本文介绍了一种从海葵中获取粗毒提取物并检测其溶血活性和磷脂酶活性的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
海葵毒液的成分为多肽和非蛋白质分子。其中的细胞裂解成分在设计新型分子工具方面具有较高的生物技术和生物医学潜力。海葵毒液存在于外胚层的腺细胞以及一种称为刺丝囊的亚细胞结构中，这两者分布于整个海葵体内。这一特性带来了技术挑战，因为必须裂解这些细胞和刺丝囊，才能释放出毒液成分，同时也会释放其他非毒性分子。因此，首先获得的是粗提物（包含多种不同分子和组织碎片的混合物）。下一步是检测具有特定生物活性的多肽。本文描述了一种高效策略，用于获取海葵粗提物，并通过生物活性检测鉴定其中细胞裂解毒素的存在。第一步采用成本低廉且操作简便的技术（搅拌和冻融循环）来释放细胞裂解成分，我们由此获得了最高的细胞裂解活性和蛋白产量（从20 g干重样品中提取约500 mg蛋白质）。随后通过SDS-PAGE凝胶电泳分析提取物中多肽的复杂性，检测到分子量介于10 kDa至250 kDa之间的蛋白质。在溶血活性检测中，我们使用绵羊红细胞，并测定HU50值为（11.1 ± 0.3 µg/mL）。相比之下，粗提物中磷脂酶的存在则通过在含琼脂糖的固体培养基中以蛋黄作为底物进行检测。总体而言，本研究采用一种高效且低成本的方案制备粗提物，并应用可重复的生物活性检测方法鉴定具有生物技术和生物医学研究价值的细胞裂解毒素分子。
引言
海洋动物是生物活性化合物的丰富来源。近年来，海葵毒液的成分引起了科学界的关注，因为它包含多种具有溶血、细胞毒性、酶活性（磷脂酶、蛋白酶、几丁质酶）和神经毒性作用的多肽，以及对蛋白水解活性的抑制效应1。此外，这些多肽也是开发用于生物技术和治疗用途分子工具的潜在来源2,3。
由于获取海葵毒液的复杂性，以及毒素的分离与表征困难，有关海葵毒液及其分子组分的报道较少。已有报道中使用的提取方法包括裂解细胞并释放与毒液生成相关或无关的细胞内容物1。
所有刺胞动物的一个共同特征是缺乏将毒液的产生和释放集中于单一解剖区域的系统。相反，刺丝囊是一种能够储存毒液的结构4,5。另一类称为表皮腺细胞的细胞也能分泌毒素，并且同样分布于海葵的整个身体中6。
获取毒液的首要且最关键的挑战是在后续操作过程中获得足量的提取物，同时避免不稳定蛋白质的失活或降解。接下来，必须裂解细胞，并高效、快速地提取其中的组分——在此情况下为多肽，同时避免蛋白酶解和水解，并去除其他细胞组分7。
获取海葵粗提物的方法有多种，其中一些方法需要牺牲生物体，而另一些则可使其保持存活。与保持生物体存活的方法相比，使用生物体整个身体的方法能够释放出更多的毒液毒素8，而活体提取法仅能获得毒液中的部分成分9。提取物的制备需要通过特定的生物测定方法来评估目标物质的存在及其活性强度，该过程包括采用体内（in vivo）或体外（in vitro）方法观察其药理效应的策略10。
海葵毒液含有细胞溶解性多肽、孔形成毒素（PFTs）11以及磷脂酶12；这些分子是研究蛋白质-脂质相互作用的模型，在癌症治疗中作为分子工具，并可用于基于纳米孔的生物传感器3。海葵PFTs根据其大小或分子量进行分类，范围从5 kDa到80 kDa。其中研究最为深入的是20 kDa的PFT，被称为刺胞溶素（actinoporins）11，因其在开发分子工具方面的生物医学潜力而备受关注，可能应用于抗癌、抗菌以及基于纳米孔的生物传感器。另一种细胞溶解素包括磷脂酶，特别是磷脂酶A2（PLA2）13，其通过水解磷脂并释放脂肪酸，破坏细胞膜的稳定性。由于这种作用机制，PLA2有望成为研究炎症性疾病的重要模型，也可作为细胞膜中脂质行为研究的模型14。
本文介绍了一种高效提取海葵 Anthopleura dowii Verrill, 1869 粗提物并检测其中溶血素和磷脂酶的方法。这两种毒素均具有重要研究价值，可作为设计新型分子工具的模板。
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方案
海葵的采集遵循墨西哥联邦政府水产养殖、渔业和食品国家委员会的指导方针（许可证号：PPF / DGOPTA 07332.250810.4060）。墨西哥国立自治大学生物技术研究所的生物伦理委员会批准了所有涉及海葵的实验。绵羊血液样本购自动物生产与健康教学实践和研究中心（CEPIPSA，墨西哥国立自治大学）。
1. 生物体采集
- 采集海葵 A. dowii。
注意：此处生物样本于墨西哥下加利福尼亚州恩塞纳达海岸潮间带的低潮期采集（图1A，B）。 - 将生物样本置于盛有海水的容器中，运送到实验室（图1C）。
- 在实验室中，用手以蒸馏水清洗生物样本，去除附着在体表的大颗粒基质。
- 立即将生物样本于超低温冰箱中 -80 °C 冷冻保存 72 小时。
- 将生物样本放入专用玻璃容器中进行冷冻干燥，冻干条件为 -20 °C、0.015 psi，持续 48 小时。
- 将冻干后的生物样本于 -20 °C 保存，直至使用。
2. 组织水化
- 用 60 mL（1/3 w/v）50 mM 磷酸钠缓冲液（pH 7.5）和 1 片蛋白酶抑制剂混合片（材料表）重悬 20 g 干重的冻干菌体。
- 在磁力搅拌器上，于 4 °C 条件下以约 800 rpm 持续搅拌样品 12 小时。
3. 毒素释放
- 为诱导细胞裂解和刺丝囊释放，将样品在 -20 °C 下冷冻 12 小时，然后将容器置于室温（RT）水中，直至样品解冻至约 90%。重复此操作三次。
注意：样品无需完全解冻至 100%；必须将样品保持在约 4 °C，以防止蛋白质降解。 - 在共聚焦显微镜下观察释放的刺丝囊。取 10 µL 样品置于载玻片上，盖上盖玻片，在 100 倍和 60 倍放大倍数下用共聚焦显微镜观察。此处无需使用染料。
- 使用 ImageJ 软件（版本 1.53c，Wayne Rasband，美国国立卫生研究院，https://imagej.nih.gov/ij）处理共聚焦显微镜拍摄的图像。
- 若刺丝囊内部的管状结构已解旋并伸出囊外，则表明刺丝囊已释放，可继续下一步操作；否则，仅再进行一次冻融循环。
- 为澄清提取物，将样品在 4 °C 条件下以 25,400 × g 离心 40 分钟，收集上清液后再次离心。重复此步骤 3–4 次。
- 收集上清液，弃去沉淀。上清液或粗提物中含有毒液成分（毒素）及其他细胞分子，如脂质、碳水化合物和核酸。
4. 总蛋白定量
- 使用商用 Bradford 比色法检测试剂盒（材料表）测定粗提物的蛋白质浓度15。
- 将染料试剂稀释（1 份染料加 4 份蒸馏水）。
- 用磷酸盐缓冲液（50 mM 磷酸钠，pH 7.5）配制牛血清白蛋白（BSA）第五组分（材料表）溶液，浓度为 1 mg/mL。
- 按照 表 1 中所列溶液，每种制备三份。
- 在振荡器上剧烈振荡混合每种溶液，持续 4 秒。
- 在室温下静置孵育样品 5 分钟，不振荡。
- 在 595 nm 处测定吸光度（AU）。
- 绘制样品 BSA 吸光度平均值的曲线（吸光度 AU 对蛋白质浓度），并确定曲线方程（公式 1）。
公式 1
其中 y 为吸光度，m 为直线斜率，x 为蛋白质浓度，b 为 y 轴截距。为计算粗提物浓度，按以下方式求解 x：
公式 2
5. 确定多肽毒液的复杂性
- 根据说明书组装用于垂直凝胶电泳的玻璃容器。
- 制备丙烯酰胺混合液（30%）：称取29.2 g丙烯酰胺、0.8 g双丙烯酰胺，加水定容至100 mL。使用滤器过滤该溶液 0.45 µm 膜。将溶液储存在避光瓶中于 4 °C然后，配制分离胶的混合液（表 2).
- SDS-PAGE 凝胶由分离胶和浓缩胶组成。根据溶液体积的定义配制凝胶 表 2制备过程中，务必保持各混合物处于 4 °C 缩短聚合时间。
注意：每种混合物的体积因所用设备品牌而异；本方案中的体积适用于制备15%丙烯酰胺凝胶（厚度0.75 mm），用于垂直电泳槽材料清单). - 丙烯酰胺聚合后（约10分钟），加入浓缩胶混合液。
- 制备浓缩胶混合液，立即注入玻璃板中，并插入梳子以形成加样孔。
- 待浓缩胶聚合后（约15分钟），取出梳子，将玻璃容器置于垂直电泳装置的电泳槽中。
- 在电泳槽中加入200 mL电极缓冲液（0.25 M Tris，0.192 M 甘氨酸，0.1% SDS）。
- 分析粗提物：混合 30 µg 粗提物与 5 µL 加入蛋白上样缓冲液（25% 甘油，15% 十二烷基硫酸钠，25% 2-巯基乙醇，0.125 mM Tris pH 7，0.1 mg/mL 溴酚蓝）以变性蛋白质。最终体积必须为 <50 µL.
- 加热至 90 °C 5分钟，冷却，然后在1,400 x g下离心3秒 g.
- 将样品加入浓缩胶的加样孔中，同时加入标准分子量蛋白标记物。
- 以25 mA恒定电流电泳运行1小时30分钟。
- 从电泳槽中取出玻璃容器，以进行凝胶蛋白的染色。
6. 蛋白质染色
- 用 50 mL 蒸馏水冲洗凝胶，以去除缓冲电极中的碎屑。
- 弃去水溶液。
- 为防止凝胶中蛋白质扩散，加入固定液（60 mL 乙醇、20 mL 乙酸、20 mL 蒸馏水，终体积 100 mL），室温下以 80 rpm 振荡孵育 40 分钟，倾去溶液。
- 加入蛋白质交联液（15 mL 乙醇、0.25 mL 戊二醛、50 mL 蒸馏水，终体积 65.25 mL），室温下以 80 rpm 振荡孵育 30 分钟，移除溶液。
- 用 100 mL 蒸馏水洗涤凝胶 5 分钟，弃去水溶液，重复此步骤四次。
- 使用 50 mL 经滤过的考马斯亮蓝 R-250 染色液（40% 甲醇、10% 乙酸、50% 蒸馏水、0.1% 染料，终体积 100 mL），在室温下以 60 rpm 在实验室旋转振荡器中搅拌染色 15 分钟。
- 回收染色液，可重复用于其他凝胶的染色。
- 为去除多余染料，加入脱色液（40 mL 甲醇、10 mL 乙酸、50 mL 蒸馏水），在室温下持续以 80 rpm 搅拌，直至条带（染色的蛋白质）清晰可见。
- 将凝胶保存于 50 mL 蒸馏水中，并在凝胶成像系统中扫描图像。
7. 准备红细胞溶液
- 从绵羊颈静脉抽取 1 mL 血液。
- 将针头从注射器上取下，并立即将血液注入含有 50 mL Alsever 溶液（含 0.002 M 柠檬酸、0.07 M NaCl、0.1 M 右旋糖和 0.027 M 柠檬酸钠作为抗凝剂，pH 7.4）的试管中。
- 缓慢倒置溶液三次。
- 在 4 °C 条件下保存，以转运至实验室。
- 在 4 °C 下以 804 x g 离心 5 分钟，弃去上清液。
- 将沉淀重悬于 30 mL Alsever 溶液中。沿试管内壁缓慢加入溶液，并使用塑料巴斯德吸管缓慢重悬细胞。再次在 4 °C 下以 804 x g 离心 5 分钟。重复此步骤，直至上清液澄清。
- 加入 15 mL Alsever 溶液；用塑料巴斯德吸管缓慢重悬沉淀。
- 调整 Alsever 溶液的最终体积，使细胞浓度约为 2 x 106 个细胞/mL。然后使用血细胞计数板（Neubauer 计数板）进行细胞计数。
注意：在血细胞计数板载玻片（改进型 Neubauer 计数板）上计数红细胞。该载玻片尺寸为 30 mm x 70 mm x 4 mm，中央有两个银色平台（图 2A）（一个上部和一个下部网格），每个平台为 3 mm x 3 mm，网格两侧有两条通道。细胞计数区域为四个角和中心的方格（图 2B 中的红色方格）。用于计数的最佳细胞浓度应在 106 个细胞左右。中央方格的表面积为 0.1 cm2，相当于 0.0001 mL。 - 将盖玻片盖在载玻片上。
- 在载玻片与盖玻片之间加入 10 µL 样品，静置等待样品扩散均匀。
- 在光学显微镜（60 倍放大）下对第一个方格进行计数。仅计数中心网格内的细胞以及接触方格上边缘或左边缘的细胞。
- 使用以下公式计算细胞浓度：
公式 3
如果样品浓度过高需要稀释，则使用以下公式：
公式 4
注意：取用于溶血试验的红细胞溶液时，需用塑料巴斯德吸管缓慢混匀溶液。 - 为减少误差，所有步骤需设三个重复。
8. 溶血实验
- 在锥形96孔板中制备表3所示的溶液混合物（每组三个重复）。
注意：缓慢混匀红细胞，以保持均匀的悬浮状态。 - 在37 °C下孵育1小时，不振荡。
- 在4 °C下以804 × g离心5分钟。
- 将上清液转移至另一块平底96孔板中。
- 如果粗提物中含有细胞溶解素，红细胞将发生裂解并释放血红蛋白。在415 nm处测定吸光度。
- 使用以下公式计算溶血百分比：
% 溶血 = ((A粗提物 - AAlsever缓冲液) / (AH2O - AAlsever)) × 100
注意：A粗提物、AAlsever缓冲液和AH2O分别代表红细胞与粗提物混合后的吸光度、Alsever溶液的吸光度以及蒸馏水的吸光度。 - 使用粗提物中50 µg总蛋白，在每次冻融循环前后进行溶血试验。
- 确定达到100%溶血活性所需的冻融循环次数。
- 计算引起50%红细胞溶血的提取物量（HU50）；按照表3中所述相同方案操作，增加海葵粗提物的用量，并使用适当的软件（例如Origin，材料表）进行S型拟合绘图。
9. 磷脂酶活性检测
- 用含1% SDS的蒸馏水清洗一个鸡蛋。
- 在无菌条件下将蛋黄与蛋清分离。
- 配制50 mL的0.86% NaCl溶液，并通过0.22 µm滤膜过滤。然后配制溶液A：加入12 mL蛋黄和36 mL 0.86% NaCl溶液。
- 配制溶液B：将300 mg琼脂糖溶于50 mL缓冲液（50 mM Tris，pH 7.5）中，通过0.22 µm滤膜过滤。将溶液放入微波炉加热至沸腾。用温水冷却至43–45°C。
- 配制溶液C：配制10 mM CaCl2溶液，并用0.22 µm滤膜过滤。
- 配制溶液D：将10 mg罗丹明6G溶于1 mL蒸馏水中。
- 在无菌条件下（超净工作台内），向溶液B中加入500 µL溶液A和500 µL溶液C，以及100 µL溶液D，混匀后将25 mL混合液倒入每个培养皿（90 × 15 mm）中。
- 在无菌条件下静置，待溶液凝固（约30分钟）。
- 用细管打孔，孔径约为2–3 mm。
- 在一个孔中加入20 µL磷酸盐缓冲液（阴性对照），在另一孔中加入20 µL已知的磷脂酶（阳性对照）。
- 在其余孔中分别加入不同量的粗提蛋白样品（5、15、25、35、45 µg），每孔终体积为20 µL。
- 静置等待琼脂完全吸附所有样品（约30分钟）。
- 在37 °C下孵育20小时。
- 若孔周围出现透明晕圈，则表明具有磷脂酶活性。使用游标卡尺测量晕圈直径。
注意：实验需设三个重复（步骤9.1–9.14）。
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结果
采用该方案制备海葵粗提物的代表性结果表明，结合两种技术（振荡和反复冻融循环）可有效释放刺丝囊，总蛋白含量为500 mg（8 mg/mL）（图3）。
通过SDS-PAGE电泳可观察到粗提物中蛋白质的复杂性，其分子量范围从10 kDa至大于250 kDa。此外，在15 kDa和20 kDa的分子量区域检测到细胞溶素，该分子量范围可能对应于磷脂酶13或肌动蛋白孔素3（图4）。
提取物在冻融循环前及循环过程中的溶血活性逐渐增加，至最后两个循环时，加入50 µg总粗提蛋白即可达到100%溶血。裂解50%绵羊红细胞所需的蛋白量（HU50）为11.1 ± 0.3 µg/mL（图5）。通过观察琼脂平板上粗提物加样区域是否形成透明晕圈来检测磷脂酶活性。...
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讨论
由于在科学和工业不同领域应用的新化合物需求量很高，人们开始对毒液进行研究。毒液是分子的丰富来源，可作为开发新型分子工具的模板。然而，这些毒液的复杂性要求采用并结合多种方法才能获得并对其进行研究。
本文展示了一种获取和分析海葵 Anthopleura dowii Verrill 1869 毒液的方法，该方法可用于从冻干样本开始研究其他海葵物种的毒液，并制备粗提物。冻干步骤可长期保存生物样本直至使用，并可根据实验需求分次取用部分样品，从而高效利用生物资源，避免大量采集活体，同时维持蛋白质的稳定性7,16。使用新鲜生物体提取的含毒素粗提物比从冻干生物体制备的粗提物活性更强。然而，粗提物中的蛋白质在 -20 °C 冷冻条件下可更长时间地保持其功能活性17。对生物体进行冻干处理还具有生物伦理学意义，因其可优化样本使用效率，减少对更多生物个体的采集需求。
冷...
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披露
作者声明，他们与本文的发表不存在任何利益冲突。
致谢
本工作由研究与技术创新项目支持计划（PAPIIT）资助，项目编号为 IT200819。作者感谢 Tom Musselman（Rock Paper Editing, LLC）对本文英文语法的审校，以及萨曼塔·希门尼斯（CICESE，恩塞纳达）和胡安·曼努埃尔·巴尔博萨·卡斯蒂略（墨西哥国立自治大学细胞生理研究所）提供的技术支持。 我们还感谢 Augusto César Lizarazo Chaparro 博士（CEPIPSA）提供绵羊血液。 我们特别感谢 José Saniger Blesa 博士（墨西哥国立自治大学应用科学与技术研究所）提供其实验室设施用于视频录制。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 15 mL 圆锥形离心管 | Corning | 430766 | |
| 2-溴苯酚蓝 | Sigma | B75808 | |
| 2-巯基乙醇 | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| 50 mL 圆锥形离心管 | Corning | 430828 | |
| 冰醋酸 | J.T. Baker | 9515-03 | |
| 丙烯酰胺 | Promega | V3115 | |
| 琼脂糖 | Promega | V3125 | |
| 双丙烯酰胺 | Promega | V3143 | |
| 牛血清白蛋白 V 组分 | Sigma | A3059-100G | |
| Bradford 蛋白质测定试剂盒 | Bio-Rad | 5000006 | |
| 氯化钙 | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| 96 孔细胞培养板，V 型底 | Corning | 3894 | |
| 离心机 | Eppendorf | 5804R | |
| 离心管 | Corning | CLS430829 | |
| ChemiDoc MP 系统 | Bio-Rad | 1708280 | |
| 柠檬酸 | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| 透明平底 96 孔板 | Thermo Scientific | 3855 | |
| 考马斯亮蓝 G-250 | Bio-Rad | #1610406 | |
| 考马斯亮蓝 R-250 | Bio-Rad | 1610400 | |
| 葡萄糖 | J.T. Baker | 1916-01 | |
| 无管通风柜 | Labconco | Vertical | https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c |
| Gel Doc EZ | Bio Rad. | 凝胶成像系统 | |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G5516-4L | |
| 血细胞计数板 | Marienfeld | 650030 | |
| ImageJ（软件） | NIH, USA | Version 1.53c | |
| 培养箱 211 | Labnet | I5211 DS | |
| 甲醇 | J.T. Baker | 9049-03 | |
| Mini-PROTEAN 四板电泳槽 | Bio-Rad | 1658000EDU | |
| Na2HPO4 | J.T. Baker | 3824-01 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624-01 | |
| NaH2PO4.H2O | J.T. Baker | 3818-05 | |
| Origin 软件 | version 9 | 用于绘制具有 S 形拟合的图表 | |
| 培养皿 | Falcon | 351007 | |
| Pipetman 移液器套装 | Gilson | F167380 | |
| 预制小型凝胶 | BioRad | 1658004 | |
| 预染蛋白质标准品 | Thermo Scientific | 26620 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 11836153001 | |
| 蛋白质测定染料试剂浓缩液 | Bio-Rad | 5000006 | |
| 罗丹明 6G | Sigma-Aldrich | 252433 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| 二水合柠檬酸钠 | JT Baker | 3646-01 | |
| 分光光度计 | THERMO SCIENTIFIC | G10S UV-VIS | |
| Tris 碱 | Sigma-Aldrich | 77-86-1 | |
| 电压电源 | Hoefer | PS300B |
参考文献
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