方法文章

通过简易生物测定法鉴定海葵粗提物中的溶血活性与磷脂酶活性

DOI：

10.3791/63630

⸱

2022年3月29日

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1Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México, 2Departamento de Micro y Nanotecnologías, Instituto de Ciencias Aplicadas y Tecnología, Universidad Nacional Autónoma de México

本文内容

摘要

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本文介绍了一种从海葵中获取粗毒提取物并检测其溶血活性和磷脂酶活性的实验方案。

摘要

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海葵毒液的成分为多肽和非蛋白质分子。其中的细胞裂解成分在设计新型分子工具方面具有较高的生物技术和生物医学潜力。海葵毒液存在于外胚层的腺细胞以及一种称为刺丝囊的亚细胞结构中，这两者分布于整个海葵体内。这一特性带来了技术挑战，因为必须裂解这些细胞和刺丝囊，才能释放出毒液成分，同时也会释放其他非毒性分子。因此，首先获得的是粗提物（包含多种不同分子和组织碎片的混合物）。下一步是检测具有特定生物活性的多肽。本文描述了一种高效策略，用于获取海葵粗提物，并通过生物活性检测鉴定其中细胞裂解毒素的存在。第一步采用成本低廉且操作简便的技术（搅拌和冻融循环）来释放细胞裂解成分，我们由此获得了最高的细胞裂解活性和蛋白产量（从20 g干重样品中提取约500 mg蛋白质）。随后通过SDS-PAGE凝胶电泳分析提取物中多肽的复杂性，检测到分子量介于10 kDa至250 kDa之间的蛋白质。在溶血活性检测中，我们使用绵羊红细胞，并测定HU50值为（11.1 ± 0.3 µg/mL）。相比之下，粗提物中磷脂酶的存在则通过在含琼脂糖的固体培养基中以蛋黄作为底物进行检测。总体而言，本研究采用一种高效且低成本的方案制备粗提物，并应用可重复的生物活性检测方法鉴定具有生物技术和生物医学研究价值的细胞裂解毒素分子。

引言

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海洋动物是生物活性化合物的丰富来源。近年来，海葵毒液的成分引起了科学界的关注，因为它包含多种具有溶血、细胞毒性、酶活性（磷脂酶、蛋白酶、几丁质酶）和神经毒性作用的多肽，以及对蛋白水解活性的抑制效应1。此外，这些多肽也是开发用于生物技术和治疗用途分子工具的潜在来源2,3。

由于获取海葵毒液的复杂性，以及毒素的分离与表征困难，有关海葵毒液及其分子组分的报道较少。已有报道中使用的提取方法包括裂解细胞并释放与毒液生成相关或无关的细胞内容物1。

所有刺胞动物的一个共同特征是缺乏将毒液的产生和释放集中于单一解剖区域的系统。相反，刺丝囊是一种能够储存毒液的结构4,5。另一类称为表皮腺细胞的细胞也能分泌毒素，并且同样分布于海葵的整个身体中6。

获取毒液的首要且最关键的挑战是在后续操作过程中获得足量的提取物，同时避免不稳定蛋白质的失活或降解。接下来，必须裂解细胞，并高效、快速地提取其中的组分——在此情况下为多肽....

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方案

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海葵的采集遵循墨西哥联邦政府水产养殖、渔业和食品国家委员会的指南（许可证号：PPF / DGOPTA 07332.250810.4060）。墨西哥国立自治大学生物技术研究所生物伦理委员会批准了所有涉及海葵的实验。绵羊血液样本购自动物生产与健康教学实践和研究中心（CEPIPSA，墨西哥国立自治大学）。

1. 生物体采集

  1. 采集海葵 A. dowii。
    注：此处，生物样本于墨西哥下加利福尼亚州恩塞纳达海岸潮间带的低潮期采集（图1A，B）。
  2. 将生物样本置于盛有海水的容器中，运输至实验室（图1C）。
  3. 在实验室中，用手以蒸馏水清洗生物样本，去除附着在体表的大颗粒基质。
  4. 立即将生物样本于-80 °C超低温冰箱中冷冻72小时。
  5. 将生物样本放入专用玻璃容器中进行冷冻干燥，冻干条件为-20 °C、0.015 psi，持续48小时。
  6. 将冻干后的生物样本于-20 °C保存，直至使用。

2. 组织水化

  1. 用 60 mL（1/3 w/v）50 m....

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结果

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采用该方案制备海葵粗提物的代表性结果表明，结合两种技术（振荡和反复冻融循环）可有效释放刺丝囊，总蛋白含量为 500 mg（8 mg/mL）（图 3）。

通过SDS-PAGE电泳可观察到粗提物中蛋白质的复杂性，其分子量范围从10 kDa到大于250 kDa。此外，在15 kDa和20 kDa的分子量区域检测到细胞溶解素，该分子量范围可能对应于磷脂酶13或肌动蛋白孔素3（图4）。

提取物在冻融循环前后的溶血活性逐渐增加，在最后两个循环中，当总粗提蛋白量达到50 µg时，溶血率达到100%。裂解50%绵羊红细胞所需的蛋白量（HU50）为11.1 ± 0.3 µg/mL（图5）。通过观察琼脂平板上粗提物样品施加区域形成透明晕圈的现象，可检测到.......

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讨论

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由于在科学和工业不同领域应用的新化合物需求量很高，人们开始对毒液进行研究。毒液是分子的丰富来源，可作为开发新型分子工具的模板。然而，这些毒液的复杂性要求采用并结合多种方法才能获得并对其进行研究。

本文展示了一种获取和分析海葵 Anthopleura dowii Verrill 1869 毒液的方法，该方法可用于从冻干样本开始研究其他海葵物种的毒液，并制备粗提物。冻干步骤可长期保存生物样本直至使用，并可根据实验需求分次取用部分样品，从而高效利用生物资源，避免大量采集活体，同时维持蛋白质的稳定性7,16。使用新鲜生物体提取的含毒素粗提物比从冻干生物体制备的粗提物活性更强。然而，粗提物中的蛋白质在 -20 °C 冷冻条件下可更长时间地保持其功能活性17。对生物体进行冻干处理还具有生物伦理学意义，因其可优化样本使用效率，减少对更多生物个体的采集需求。

冷.......

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披露

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作者声明，他们与本文的发表不存在任何利益冲突。

致谢

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本工作由研究与技术创新项目支持计划（PAPIIT）资助，项目编号为 IT200819。作者感谢 Tom Musselman（Rock Paper Editing, LLC）对本文英文语法的审校，以及萨曼塔·希门尼斯（CICESE，恩塞纳达）和胡安·曼努埃尔·巴尔博萨·卡斯蒂略（墨西哥国立自治大学细胞生理研究所）提供的技术支持。 我们还感谢 Augusto César Lizarazo Chaparro 博士（CEPIPSA）提供绵羊血液。 我们特别感谢 José Saniger Blesa 博士（墨西哥国立自治大学应用科学与技术研究所）提供其实验室设施用于视频录制。 

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15 mL 圆锥形离心管Corning430766
2-溴苯酚蓝SigmaB75808
2-巯基乙醇Sigma-AldrichM6250-100ML
50 mL 圆锥形离心管Corning430828
冰醋酸J.T. Baker9515-03
丙烯酰胺PromegaV3115
琼脂糖PromegaV3125
双丙烯酰胺PromegaV3143
牛血清白蛋白 V 组分SigmaA3059-100G
Bradford 蛋白质测定试剂盒Bio-Rad5000006
氯化钙Sigma-AldrichC3306
96 孔细胞培养板，V 型底Corning3894
离心机Eppendorf5804R
离心管CorningCLS430829
ChemiDoc MP 系统Bio-Rad1708280
柠檬酸Sigma-Aldrich251275
透明平底 96 孔板Thermo Scientific3855
考马斯亮蓝 G-250Bio-Rad#1610406
考马斯亮蓝 R-250Bio-Rad1610400
葡萄糖J.T. Baker1916-01
无管通风柜LabconcoVerticalhttps://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c
Gel Doc EZBio Rad.凝胶成像系统
甘油Sigma-AldrichG5516-4L
血细胞计数板Marienfeld650030
ImageJ（软件）NIH, USAVersion 1.53c
培养箱 211LabnetI5211 DS
甲醇J.T. Baker9049-03
Mini-PROTEAN 四板电泳槽Bio-Rad1658000EDU
Na2HPO4J.T. Baker3824-01
NaClJ.T. Baker3624-01
NaH2PO4.H2OJ.T. Baker3818-05
Origin 软件version 9用于绘制具有 S 形拟合的图表
培养皿Falcon351007
Pipetman 移液器套装GilsonF167380
预制小型凝胶BioRad1658004
预染蛋白质标准品Thermo Scientific26620
蛋白酶抑制剂混合物Roche11836153001
蛋白质测定染料试剂浓缩液Bio-Rad5000006
罗丹明 6GSigma-Aldrich252433
SDSSigma-AldrichL4509
二水合柠檬酸钠JT Baker3646-01
分光光度计THERMO SCIENTIFICG10S UV-VIS
Tris 碱Sigma-Aldrich77-86-1
电压电源HoeferPS300B

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frazão, B., Vasconcelos, V., Antunes, A. Sea anemone (Cnidaria, Anthozoa, Actiniaria) toxins: an overview. Marine Drugs. 10 (8), 1812-1851 (2012).
  2. Jayathilake, J. M. N. J., Gunathilake, K. V. K. Cnidarian toxins: recent evidences for potential therapeutic u....

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