通过简易生物测定法鉴定海葵粗提物中的溶血活性与磷脂酶活性

摘要

本文介绍了一种从海葵中获取粗毒提取物并检测其溶血活性和磷脂酶活性的实验方案。

摘要

海葵毒液的成分为多肽和非蛋白质分子。其中的细胞裂解成分在设计新型分子工具方面具有较高的生物技术和生物医学潜力。海葵毒液存在于外胚层的腺细胞以及一种称为刺丝囊的亚细胞结构中，这两者分布于整个海葵体内。这一特性带来了技术挑战，因为必须裂解这些细胞和刺丝囊，才能释放出毒液成分，同时也会释放其他非毒性分子。因此，首先获得的是粗提物（包含多种不同分子和组织碎片的混合物）。下一步是检测具有特定生物活性的多肽。本文描述了一种高效策略，用于获取海葵粗提物，并通过生物活性检测鉴定其中细胞裂解毒素的存在。第一步采用成本低廉且操作简便的技术（搅拌和冻融循环）来释放细胞裂解成分，我们由此获得了最高的细胞裂解活性和蛋白产量（从20 g干重样品中提取约500 mg蛋白质）。随后通过SDS-PAGE凝胶电泳分析提取物中多肽的复杂性，检测到分子量介于10 kDa至250 kDa之间的蛋白质。在溶血活性检测中，我们使用绵羊红细胞，并测定HU₅₀值为（11.1 ± 0.3 µg/mL）。相比之下，粗提物中磷脂酶的存在则通过在含琼脂糖的固体培养基中以蛋黄作为底物进行检测。总体而言，本研究采用一种高效且低成本的方案制备粗提物，并应用可重复的生物活性检测方法鉴定具有生物技术和生物医学研究价值的细胞裂解毒素分子。

引言

海洋动物是生物活性化合物的丰富来源。近年来，海葵毒液的成分引起了科学界的关注，因为它包含多种具有溶血、细胞毒性、酶活性（磷脂酶、蛋白酶、几丁质酶）和神经毒性作用的多肽，以及对蛋白水解活性的抑制效应¹。此外，这些多肽也是开发用于生物技术和治疗用途分子工具的潜在来源^2,3。

由于获取海葵毒液的复杂性，以及毒素的分离与表征困难，有关海葵毒液及其分子组分的报道较少。已有报道中使用的提取方法包括裂解细胞并释放与毒液生成相关或无关的细胞内容物¹。

所有刺胞动物的一个共同特征是缺乏将毒液的产生和释放集中于单一解剖区域的系统。相反，刺丝囊是一种能够储存毒液的结构^4,5。另一类称为表皮腺细胞的细胞也能分泌毒素，并且同样分布于海葵的整个身体中⁶。

获取毒液的首要且最关键的挑战是在后续操作过程中获得足量的提取物，同时避免不稳定蛋白质的失活或降解。接下来，必须裂解细胞，并高效、快速地提取其中的组分——在此情况下为多肽....

方案

海葵的采集遵循墨西哥联邦政府水产养殖、渔业和食品国家委员会的指导方针（许可证号：PPF / DGOPTA 07332.250810.4060）。墨西哥国立自治大学生物技术研究所的生物伦理委员会批准了所有涉及海葵的实验。绵羊血液样本购自动物生产与健康教学实践和研究中心（CEPIPSA，墨西哥国立自治大学）。

1. 生物体采集

1. 采集海葵 A. dowii。
   注意：此处生物样本于墨西哥下加利福尼亚州恩塞纳达海岸潮间带的低潮期采集（图1A，B）。
2. 将生物样本置于盛有海水的容器中，运送到实验室（图1C）。
3. 在实验室中，用手以蒸馏水清洗生物样本，去除附着在体表的大颗粒基质。
4. 立即将生物样本于超低温冰箱中 -80 °C 冷冻保存 72 小时。
5. 将生物样本放入专用玻璃容器中进行冷冻干燥，冻干条件为 -20 °C、0.015 psi，持续 48 小时。
6. 将冻干后的生物样本于 -20 °C 保存，直至使用。

2. 组织水化

1. 用 60 m....

结果

采用该方案制备海葵粗提物的代表性结果表明，结合两种技术（振荡和反复冻融循环）可有效释放刺丝囊，总蛋白含量为500 mg（8 mg/mL）（图3）。

通过SDS-PAGE电泳可观察到粗提物中蛋白质的复杂性，其分子量范围从10 kDa至大于250 kDa。此外，在15 kDa和20 kDa的分子量区域检测到细胞溶素，该分子量范围可能对应于磷脂酶¹³或肌动蛋白孔素³（图4）。

提取物在冻融循环前及循环过程中的溶血活性逐渐增加，至最后两个循环时，加入50 µg总粗提蛋白即可达到100%溶血。裂解50%绵羊红细胞所需的蛋白量（HU₅₀）为11.1 ± 0.3 µg/mL（图5）。通过观察琼脂平板上粗提物加样区域是否形成透明晕圈来检测磷脂酶活性。.......

讨论

由于在科学和工业不同领域应用的新化合物需求量很高，人们开始对毒液进行研究。毒液是分子的丰富来源，可作为开发新型分子工具的模板。然而，这些毒液的复杂性要求采用并结合多种方法才能获得并对其进行研究。

本文展示了一种获取和分析海葵 Anthopleura dowii Verrill 1869 毒液的方法，该方法可用于从冻干样本开始研究其他海葵物种的毒液，并制备粗提物。冻干步骤可长期保存生物样本直至使用，并可根据实验需求分次取用部分样品，从而高效利用生物资源，避免大量采集活体，同时维持蛋白质的稳定性^7,16。使用新鲜生物体提取的含毒素粗提物比从冻干生物体制备的粗提物活性更强。然而，粗提物中的蛋白质在 -20 °C 冷冻条件下可更长时间地保持其功能活性¹⁷。对生物体进行冻干处理还具有生物伦理学意义，因其可优化样本使用效率，减少对更多生物个体的采集需求。

冷.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 圆锥形离心管	Corning	430766
2-溴苯酚蓝	Sigma	B75808
2-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
50 mL 圆锥形离心管	Corning	430828
冰醋酸	J.T. Baker	9515-03
丙烯酰胺	Promega	V3115
琼脂糖	Promega	V3125
双丙烯酰胺	Promega	V3143
牛血清白蛋白 V 组分	Sigma	A3059-100G
Bradford 蛋白质测定试剂盒	Bio-Rad	5000006
氯化钙	Sigma-Aldrich	C3306
96 孔细胞培养板，V 型底	Corning	3894
离心机	Eppendorf	5804R
离心管	Corning	CLS430829
ChemiDoc MP 系统	Bio-Rad	1708280
柠檬酸	Sigma-Aldrich	251275
透明平底 96 孔板	Thermo Scientific	3855
考马斯亮蓝 G-250	Bio-Rad	#1610406
考马斯亮蓝 R-250	Bio-Rad	1610400
葡萄糖	J.T. Baker	1916-01
无管通风柜	Labconco	Vertical	https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c
Gel Doc EZ	Bio Rad.		凝胶成像系统
甘油	Sigma-Aldrich	G5516-4L
血细胞计数板	Marienfeld	650030
ImageJ（软件）	NIH, USA	Version 1.53c
培养箱 211	Labnet	I5211 DS
甲醇	J.T. Baker	9049-03
Mini-PROTEAN 四板电泳槽	Bio-Rad	1658000EDU
Na2HPO4	J.T. Baker	3824-01
NaCl	J.T. Baker	3624-01
NaH2PO4.H2O	J.T. Baker	3818-05
Origin 软件		version 9	用于绘制具有 S 形拟合的图表
培养皿	Falcon	351007
Pipetman 移液器套装	Gilson	F167380
预制小型凝胶	BioRad	1658004
预染蛋白质标准品	Thermo Scientific	26620
蛋白酶抑制剂混合物	Roche	11836153001
蛋白质测定染料试剂浓缩液	Bio-Rad	5000006
罗丹明 6G	Sigma-Aldrich	252433
SDS	Sigma-Aldrich	L4509
二水合柠檬酸钠	JT Baker	3646-01
分光光度计	THERMO SCIENTIFIC	G10S UV-VIS
Tris 碱	Sigma-Aldrich	77-86-1
电压电源	Hoefer	PS300B