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方法文章

腹腔镜取卵与卵子冷冻保存在 Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser 综合征阴道成形术中的应用

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DOI：

10.3791/63634

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2022年5月10日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Obstetrics and Gynaecology Unit, IRCCS San Raffaele Scientific Institute, 2Vita-Salute San Raffaele University, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Fondazione IRCCS Ca' Granda, Ospedale Maggiore Policlinico

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

一个专业的团队可以为苗勒管发育不全（Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser）患者提供在腹腔镜阴道成形术的同时进行控制性卵巢刺激和卵母细胞冷冻保存的选择。

摘要

对于计划接受腹腔镜阴道成形术且有生育意愿的梅耶-罗基坦斯基-屈斯特-豪泽综合征（MRKHS）患者，我们建议同时进行腹腔镜取卵并行卵母细胞冷冻保存。取卵操作在腹腔镜手术开始时进行。分别于右侧和左侧置入5 mm穿刺套管，通过套管使用17 G取卵针穿刺右侧和左侧卵巢。为便于卵泡暴露，使用腹腔镜抓钳游离并固定卵巢。

当抽吸多个相邻卵泡时，针尖保留在卵巢内，以减少穿刺卵巢皮质的次数，并降低固有的出血风险。后续步骤与Davydov腹腔镜改良式阴道成形术相同。手术前，采用促性腺激素释放激素（Gn-RH）拮抗剂方案进行控制性卵巢刺激，并在最终卵泡成熟触发后36小时安排同期进行取卵术与阴道成形术。卵泡液收集于与经阴道取卵术中相同的10 mL无菌试管中，置于加热块（37 °C）内转运至辅助生殖实验室，在该处将成熟（第二次减数分裂中期）卵母细胞进行玻璃化冷冻保存。

在本病例系列中，23例MRKH综合征女性患者均成功获取并冷冻保存了卵母细胞；随后按原计划实施了阴道成形术，未作任何修改，住院及门诊术后护理（导尿管拔除时间、出院时间、扩张器使用情况及随访时的舒适度）均未受影响。1例患者出现术后并发症（术后第5天发热及经腹超声检测到腹腔积液），经保守治疗后痊愈。该方法避免了先进行手术阴道成形术而延迟卵母细胞获取的传统做法，而是将两项操作整合于一次腹腔镜手术中完成，从而最大限度地减少了手术创伤及麻醉相关风险。

引言

MRKHS 的发病率约为每 4-10,000 名女性中有 1 例，占原发性闭经病例的 15%。MRKHS 的特征是先天性缺失阴道上段和子宫，而泌尿系统及骨骼异常则存在不同程度的伴随表现。更具体而言，通常可见深度为 1-2 cm 的阴道残端，且可能发现两个退化的子宫角1。

过去，医学界对MRKHS的主要关注在于实现正常的性交功能，这通常需要通过非手术或手术方法构建人工阴道2然而，随着生殖医学的进步，目前可通过代孕方式使MRKHS患者实现遗传学意义上的母亲身份3,4 或更近来的子宫移植5尽管子宫移植仍属于实验性手术，但代孕在世界许多国家已有提供6，且报告的产科和心理社会结局与标准方法相当 体外 受精与卵子捐赠7.

代孕和子宫移植均需要进行卵母细胞采集 体外 受精，但对于苗勒管发育不全综合征（MRKHS）患者如何实施取卵操作尚无共识。由于阴道弹性不足，经阴道途径可能难以实施8 即使在阴道成形术后，卵巢位置仍不典型9或卵巢与阴道残端之间的距离过大4,10在这些情况下，腹腔镜取卵在手术入路方面是最佳方法。然而，由于目前大多数MRKHS患者接受腹腔镜下人工阴道成形术，我们建议在进行阴道成形术的同时施行腹腔镜取卵11，随后对卵母细胞进行冷冻保存以备将来使用，从而在最小化侵入性的同时，结合治疗MRKHS患者的性功能与生殖功能。

患者的 demographic 数据
截至目前，共有23名MRKH患者接受了本方案的治疗。患者的病史、仪器检查和实验室检查结果总结于表1中。除非在表1中另有说明，否则未发现其他相关的先天性异常。

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方案

在2017年7月实施前，已通知并获得MRKHS三级转诊中心（意大利米兰圣拉斐尔科学研究医院大学医院）的当地伦理委员会批准该研究方案。所有患者或其监护人均签署了知情同意书，同意在阴道成形术期间进行腹腔镜取卵及卵母细胞冷冻保存，并同意将匿名化的临床和实验室数据用于科研目的。

1. 团队组成

  1. 组建一个专门团队，成员包括一名经验丰富的腹腔镜外科医生、一名经验丰富的阴道外科医生、一名不孕症专家、一名专职心理学家和一名专职护士。
  2. 在整个手术准备和实施过程中，团队共同协助患者。

2. 诊断性检查与咨询

  1. 对患者进行经腹盆腔和腹部超声检查，以观察卵巢并评估窦卵泡计数（AFC）。检测抗苗勒管激素（AMH）的血液水平，以优化控制性卵巢刺激的促性腺激素起始剂量。根据国家/地区关于组织/配子冷冻保存的相关方案，进行传染病血清学检测（HIV-Ab、HCV-Ab、HBV-Ab、RPR-TPHA）。
  2. 向患者提供关于MRKHS在性生活和生育方面的咨询，包括非手术和手术阴道成形术、与代孕相关的费用和法律法规、在实验项目背景下子宫移植的前景、可用于取卵的不同方法，以及卵子冷冻保存在活产率方面的表现。
  3. 为患者提供心理评估，以支持其完成整个过程，并评估其情绪稳定性、承诺程度以及对未来成为母亲的意愿。获取患者签署的知情同意书，用于同时进行腹腔镜取卵、配子冷冻保存和腹腔镜阴道成形术。对于未成年患者，应在父母在场的情况下进行临床评估，且由父母签署相应的知情同意书。

3. 手术流程与控制性卵巢刺激的时间安排

  1. 根据临床团队（见上文）以及执行卵母细胞玻璃化冷冻的实验室人员的可安排时间，统筹规划腹腔镜取卵术、配子冷冻保存和腹腔镜阴道成形术的联合手术流程。
  2. 在手术日前第-14天开始进行控制性卵巢刺激（COS），预计COS持续时间为12天，并预留36小时从触发排卵到完成卵母细胞采集及玻璃化冷冻。
  3. 若控制性卵巢刺激所需时间与预期不同，应相应调整手术时间。

4. 控制性卵巢刺激：起始剂量、剂量调整与监测、最终卵母细胞成熟触发

  1. 在卵巢周期的任何阶段开始COS，这在临床实践中较为常见 "随机起始" 生育力保存方案
  2. 根据患者的窦卵泡计数（AFC）和抗苗勒管激素（AMH）水平选择促卵泡生成素（FSH）/人绝经期促性腺激素（hMG）的起始剂量，并指导患者继续每日自行皮下注射。随后根据卵巢反应进行个体化的剂量调整。
  3. 通过连续经腹超声检查及同步测定雌二醇水平监测卵巢反应2 以及P（第1天、第6天、第8天、第10天和第12天）。
  4. 通过皮下注射0.2 mL促性腺激素释放激素类似物（曲普瑞林）以触发卵母细胞的最终成熟。

5. 临床操作（腹腔镜）：卵母细胞采集

  1. 将患者置于改良的截石位，以便同时良好地接触腹部和会阴区域。实施全身麻醉，并按照常规术中抗生素预防方案静脉注射2 g头孢唑林。放置经膀胱的弗利导尿管。
  2. 使用脐周气腹针建立气腹，在脐部置入一个10 mm套管针用于插入腹腔镜，在右上腹和左上腹各置入一个5 mm套管针。在腹腔镜视野下，通过右侧和左侧套管针分别穿刺右侧和左侧卵巢，使用一根17 G单腔针连接抽吸泵，该针通常用于经阴道取卵操作。
  3. 使用腹腔镜钳提起并固定卵巢，以利于卵泡的暴露。当抽吸多个相邻卵泡时，保持针尖位于卵巢内，以减少卵巢皮质穿刺次数及相应的出血风险。

6. 临床操作（腹腔镜）：阴道成形术

注意：与 Davydov 腹腔镜改良术式相比，阴道成形术的步骤保持不变12。

  1. 在两侧始基子宫角之间的腹膜索横向切开并提起，横向切开腹膜，然后将切口向前、向侧方和后方延伸。
  2. 在每个半骨盆中，从膀胱上方游离的腹膜开始，使用2-0单丝聚对二氧环己酮可吸收缝线（PDS）作荷包缝合，依次贯穿缝合圆韧带、输卵管峡部、子宫卵巢韧带和侧方腹膜叶；随后将两根缝线分别包含直肠系膜的外侧部分以及直肠浆膜的前部，位置紧邻直肠乙状结肠交界处下方。
  3. 经会阴途径显露阴道凹陷，行H形切口，通过锐性与钝性分离膀胱直肠间隙来创建人工阴道腔隙。然后将游离的腹膜边缘下拉至阴道前庭边缘。使用3-0 PDS缝线行间断缝合，完成腹膜-前庭吻合。最后，在腹膜覆盖的人工阴道内放置一层石蜡涂层纱布。

7. 体外受精实验室：取卵前一日

  1. 根据预期卵泡数量，准备2至5个圆底试管，每管加入9 mL含HEPES的Quinn's Advantage培养基（添加5%人血清白蛋白[HSA]），并在37 °C下孵育过夜。
  2. 准备一至两个4孔培养皿，每孔加入0.5 mL受精培养基（添加5% HSA），并在其上覆盖0.5 mL矿物油用于胚胎培养，在控制气体环境（6% CO2、5% O2）中37 °C孵育过夜。
  3. 准备一个培养皿，内含9滴（每滴30 µL）连续单细胞培养（CSCM）培养基（添加10%血清替代补充剂[SSS]），并在其上覆盖6 mL矿物油。在控制气体环境（6% CO2、5% O2）中37 °C孵育过夜。

8. 体外受精实验室：卵母细胞采集步骤

  1. 配制含肝素的Quinn's Advantage HEPES培养液（添加5% HSA），使肝素终浓度为10 IU/mL，用于收集卵泡液。
  2. 与常规经阴道取卵术类似13，将卵泡液收集至10 mL圆底试管中，置于便携式培养箱内保温（37 °C），并立即转运至胚胎实验室，转运时间约为10分钟。
  3. 在预热的无菌90 mm培养皿中检查卵泡液，以识别卵丘-卵母细胞复合体（COC）。一旦发现COC，立即将其转移至中心井培养皿中，用1 mL预热的Quinn's Advantage HEPES培养液（添加5% HSA）冲洗。
  4. 待所有COC收集完毕后，将其转移至含受精培养液的4孔培养皿中，并在培养皿盖子和底部标记患者身份信息。
  5. 将培养皿置于37 °C、可控气体环境（6% CO2、5% O2）中培养。
  6. 确保由实验室另一名工作人员对操作过程进行双重核对。

9. 卵母细胞去丘化

  1. 在排卵触发后38小时内完成卵丘细胞/放射冠细胞的去除。
  2. 配制含HEPES的Quinn's Advantage培养基（添加5%人血清白蛋白[HSA]），并加入透明质酸酶，使其终浓度为10 IU/mL。
  3. 准备中心井培养皿，其中加入1 mL预热的含透明质酸酶的Quinn's Advantage HEPES培养基（添加5% HSA），另准备一个加入1 mL预热的HEPES缓冲培养基（添加5% HSA）。
  4. 在卵母细胞去核培养皿上标注患者身份信息。
  5. 用玻璃巴斯德吸管将卵丘-卵母细胞复合体（COCs）放入含酶的中心井中，轻轻吹打溶液中的COCs上下移动，持续最多30秒，以分散卵丘细胞。
  6. 将卵母细胞转移至第二个仅含HEPES缓冲培养基的中心井培养皿中，注意尽量减少酶的带入。
  7. 使用内径逐渐减小（170–140 µm）的去核吸管去除残留的放射冠细胞。
  8. 评估卵母细胞成熟阶段，根据第一极体排出的特征，将处于第二次减数分裂中期（MII）的卵母细胞与第一次减数分裂中期（MI）卵母细胞及生发泡期（GV）卵母细胞区分开来。
  9. 将MII期卵母细胞转移至含有九滴（每滴30 µL）连续单细胞培养基（CSCM）（添加10%血清替代补充物[SSS]）的IVF培养用60 mm培养皿中，并覆盖6 mL矿物油。
  10. 在37 °C、控制气体环境（6% CO2，5% O2）中进行培养。

10. 卵母细胞玻璃化冷冻

  1. 在卵母细胞去颗粒后立即按照玻璃化冷冻试剂盒制造商提供的方案对MII期卵母细胞进行玻璃化冷冻。
  2. 在操作前约30分钟，将平衡液（ES）、玻璃化冷冻液（VS）和洗涤液（WS）置于室温（25–27 °C）下平衡。
    注意：根据制造商说明，ES含有7.5%二甲基亚砜（DMSO）、7.5%乙二醇、20%右旋糖酐血清补充剂（DSS）、庆大霉素的M-199 HEPES缓冲液；VS含有15% DMSO、15%乙二醇、0.5 M蔗糖、20% DSS、庆大霉素的M-199 HEPES缓冲液；WS含有20% DSS、庆大霉素的M-199 HEPES缓冲液。
  3. 使用Cryotop作为冷冻装置，其由附着在塑料手柄上的透明薄膜细条构成。
  4. 在冷冻装置上标注患者姓名、出生日期、编号、冷冻日期以及单个装置上装载的卵母细胞数量。
  5. 在玻璃化冷冻培养皿上标注患者姓名和编号。
  6. 确保有见证操作人员核对冷冻装置和培养皿上的患者信息是否正确。
  7. 用新鲜液氮将冷却盒灌满至顶部，并在使用前盖好，以尽量减少液氮的扩散和蒸发。
  8. 使用内径为170 µm的吹打移液管，以避免在操作过程中损伤卵母细胞。
  9. 使用前轻轻摇动ES、VS和WS的每个小瓶，以充分混匀内容物。
  10. 在60 mm培养皿的盖子上准备一滴50 µL的WS1（图1A）。
  11. 在即将使用前放置液滴，以减少培养基蒸发。
  12. 从培养箱中取出卵母细胞培养皿，将MII期卵母细胞（每次最多3个）连同极少量培养基从培养皿转移至50 µL的WS中。
  13. 在邻近位置分别加入50 µL的WS2、ES1和ES2液滴，并将卵母细胞从WS1液滴转移至WS2液滴（图1B）。
  14. 将ES1液滴与WS2合并，并静置2分钟，使两种溶液自然混合。
  15. 随后将ES2液滴与先前合并的液滴合并，继续静置2分钟。
  16. 最后，将一个新的100 µL ES3液滴与先前合并的液滴合并，再静置1分钟。
  17. 将卵母细胞放入100 µL的ES4液滴中，孵育10分钟（图1C）。
  18. 分别准备两个50 µL的VS液滴和一个100 µL的VS液滴（图1D）。
  19. 将卵母细胞依次移入三个VS液滴中，共孵育60秒，每个液滴中停留约20秒。
  20. 当60秒孵育时间还剩约10秒时，将冷冻装置置于显微镜下。
  21. 用移液管尖端携带卵母细胞，并以最少的VS液体量将其放置在冷冻装置上。
  22. 吸除多余的VS，仅保留一层薄薄的VS覆盖卵母细胞。
  23. 立即将冷冻装置直接浸入液氮中并快速移动。将装置保持在液氮中，并盖上保护盖。
  24. 将冷冻装置存入储存系统（例如visiotube），并放入液氮罐中。在实验室数据库和记录表中登记冷冻保存信息。

11. 住院术后护理

  1. 术后48小时移除导尿管和阴道内石蜡纱布。
  2. 移除后对患者的新阴道进行指检，并指导患者如何自行进行指检。随后，将雌激素凝胶涂抹于阴道模具（长9 cm，直径2 cm）表面（以促进上皮化），并指导患者如何插入并维持模具位置。
  3. 从术后第3天开始，每日指导患者正确放置模具，并确保其每日至少维持在位2小时。
  4. 若无并发症发生，于术后第5至6天安排患者出院。

12. 门诊术后护理

  1. 指导患者在住院期间使用的相同模具（长9 cm，直径2 cm）进行阴道扩张，持续2个月，之后更换较大的模具（长11 cm，直径2.5 cm）。
  2. 在术后3个月复诊后，允许患者开始性生活，并告知其在未进行性交的日期仍需继续使用模具。

13. 随访

  1. 在术后1、3、6和12个月安排随访。
  2. 每次随访时，评估患者对扩张训练的依从性，并询问其是否存在日常生活活动受限、疼痛、泌尿系统症状或性功能障碍（自术后第三个月随访起）。每次随访均应进行妇科检查，测量阴道宽度、长度、悬吊情况以及附件的活动度。

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结果

表2 包含患者的卵巢刺激数据，而主要的手术和功能结局见表3。所有患者均成功联合实施了取卵术与阴道成形术的同期腹腔镜手术。平均获取卵母细胞11.4 ± 5.4（均值 ± 标准差）枚，其中平均冷冻保存成熟卵母细胞（MII期）9.6 ± 4.3枚（表3）。根据我们在接受辅助生殖技术（ART）患者中进行卵母细胞冷冻保存的经验，采用本玻璃化冷冻方案后，解冻后卵母细胞存活率——定义为卵胞浆内单精子注射时形态完整的卵母细胞所占比例——为84.5 ± 19.3%。手术总平均时间为114 ± 17分钟，所有患者的术中出血量均极少（<50 mL），且未发生术中不良事件。所有患者术后第2天拔除导尿管和阴道纱布。术后第3天开始每日使用扩张器，平均于术后第6.0 ± 1.0天出院。1例患者出现术后并发症（术后第5天发热，并经腹部超声检查发现腹腔积液），经口服抗生素治疗后痊愈，并于术后第9天出院。术后随访证实手术在解剖结构和功能上均获得成功。所有患者均未报告日常生活活动受限、疼痛或泌尿系统症状。

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讨论

本方案通过结合阴道成形术与卵母细胞采集术，降低了MRKHS治疗的侵入性。为此，必须指定一个专门的团队，以确保促排卵周期控制（COS）、手术操作以及卵母细胞玻璃化冷冻的时间安排高效协调。

预计从这种联合腹腔镜方法中获益最多的MRKHS患者，是那些由于卵巢位于骨盆壁侧方14，或靠近肝脏、胆囊9等器官，或存在盆腔肾，而导致经阴道取卵在技术上具有挑战性或不可行的患者。对于这些患者，理论上可采用经腹取卵方式，文献中已有相关报道：然而，平均仅获得4.92 ± 1.7个卵母细胞15，提示由于技术限制导致取卵效果不理想。此外，在某些情况下，经腹途径可能困难甚至无法实施，例如腹壁明显增厚，或因肠管覆盖导致卵巢可视性差的患者16。

安全性是该方法的一个显著优势。除了上述最佳可视化和操作通路的优势外，将两种手术合并为一种可降低...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究未获得任何专项资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
卵母细胞采集程序
设备
CO2 O2 培养箱Sanyo
培养箱Thermo Scientific
超净工作台Cooper Surgical
便携式培养箱Cooper Surgical
体视显微镜Nikon
耗材
14 mL 聚苯乙烯圆底管Falcon352057
4孔培养皿Nunc144444
60 mm 培养皿NuncFA9150270
90 mm 培养皿NuncFA9150360
生理盐水（5%）中含人血清白蛋白 100 mg/mLOrigio3001
胚胎培养用矿物油Origio4008
单孔培养皿OosafeOOPW-CW05
Quinn’s Advantage 受精培养基 SAGEOrigio1020
含 HEPES 的 Quinn’s Advantage 培养基Origio1024
无菌玻璃巴斯德吸管
卵母细胞去颗粒细胞
设备
CO2 O2 培养箱Sanyo
Flexipet 可调节手柄套装CookG18674
培养箱Thermo Scientific
超净工作台Cooper Surgical
体视显微镜Nikon
耗材
4孔培养皿Nunc144444
CSCM（连续单细胞培养）培养基Fujifilm irvine Scientific90165
生理盐水（5%）中含人血清白蛋白 100 mg/mLOrigio3001
透明质酸酶Fujifilm Irvine Scientific90101
IVF 培养用 60 mm 培养皿NuncFA9150270
胚胎培养用矿物油Origio4008
单孔培养皿OosafeOOPW-CW05
含 HEPES 的 Quinn’s Advantage 培养基Origio1024
血清替代补充剂Fujifilm irvine Scientific99193
无菌玻璃巴斯德吸管
去卵丘细胞移液吸头（140 μm）CookK-FPIP-1140-10BS-5
去卵丘细胞移液吸头（170 μm）CookK-FPIP-1170-10BS-5
卵母细胞玻璃化冷冻
35 mm 培养皿NUNC150255
60 mm 培养皿NUNC150270
90 mm 培养皿NUNC150360
冷却架容器Kitazato
冷冻装置/冷冻载杆（Cryotop）Kitazato81111
电子计时器
FlexipetCOOKK- 1000
Gilson 移液器GilsonF123601
LabXpert 实验室打印机BradyXSL-86-461
20-200 µL 吸头Thermo Scientific2160G
2-20 µL 吸头Thermo Scientific2139-HR
VisotubesCryo Bio System20
玻璃化冷冻试剂盒Fujifilm Irvine Scientific90133-SO
玻璃化解冻试剂盒Fujifilm Irvine Scientific90137-SO

参考文献

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