培养骨细胞中脂肪酸氧化的评估

摘要

本实验方案描述了一种用于评估原代骨细胞或相关细胞系脂肪酸氧化能力的检测方法。

摘要

成骨细胞在分化过程中形成骨组织需要大量的能量输入，因为这些特化细胞必须合成构成骨组织的大分子细胞外基质蛋白，并富集矿化过程所需的离子。目前关于骨形成代谢需求的研究数据正在迅速积累。尽管仍有许多未知领域，但已有预期认为中间代谢的紊乱会促成骨骼疾病的发生。本文介绍了一种用于评估成骨细胞将¹⁴C标记的脂肪酸氧化为¹⁴CO₂及酸溶性代谢产物能力的实验方案。脂肪酸是一类富含能量的储备物质，可在进食后从循环中摄取，或在从脂肪组织储存中释放后被利用。该检测在T-25组织培养瓶中进行，有助于研究基因功能获得或缺失对脂肪酸利用的影响，以及生长因子或形态发生素等合成代谢信号在维持骨量过程中的作用。文中还提供了将该方案调整用于评估葡萄糖或谷氨酰胺等氨基酸氧化能力的具体细节。

引言

成骨细胞来源于骨髓和骨膜中存在的前体细胞，负责合成并分泌富含胶原、矿化的基质，构成骨组织。为了完成这一能量消耗巨大的任务，并维持骨骼完整性的终身需求，这些特化细胞拥有丰富的粗面内质网，用于合成细胞外基质蛋白^1，2，以及大量高膜电位的线粒体，以从燃料底物中获取所需的化学能^3，4。当出现能量缺乏（如热量限制）时，骨生长停止并发生骨量减少^5，6，这凸显了后一功能的重要性。目前，关于成骨细胞偏好的能量底物，以及其在分化过程中或对同化信号响应时的代谢需求的研究正在逐步展开^7，8。

长链脂肪酸是血清中丰富的化学能源，在热量摄入减少或能量消耗增加时由脂肪组织释放。长链脂肪酸穿越细胞膜后与辅酶A结合形成脂肪酰辅酶A，以增加其溶解度；随后，在线粒体外膜和内膜上的两种肉碱棕榈酰转移酶以及肉碱-酰基肉碱转位酶的协同作用下，脂肪酰辅酶A被转运至线粒体基质⁷在线粒体基质内，β-氧化体系通过四步反应过程使酰基辅酶A（acyl-CoA）链缩短，生成进入三羧酸循环（TCA循环）的乙酰辅酶A（acetyl-CoA）以及还原当量 当量。棕榈酸盐（C₁₆），动物体内最常见的脂肪酸， 通过 该途径可产生约131个ATP，远高于葡萄糖氧化生成的约38个ATP⁷.

使用放射性标记脂质的示踪研究表明，骨骼吸收了相当一部分循环中的脂质^9,10，而关键脂质分解代谢酶的基因敲除会导致成骨细胞活性降低和骨量丢失^9,11。本文所述方案采用¹⁴C标记的脂肪酸，用于评估培养的成骨细胞将脂肪酸完全代谢为CO₂或酸溶性代谢物的能力，后者代表了氧化过程中的中间步骤。尽管该方法需要使用放射性物质，但操作简便，所需投入有限，并可适用于其他放射性标记代谢物和细胞类型的分析。

方案

本方案采用[1-¹⁴C]-油酸 转化为¹⁴CO₂的方法作为脂肪酸氧化能力的检测指标。在开展实验前，本地方辐射安全办公室已批准使用放射性物质的方案。所有涉及辐射的操作均在有机玻璃屏蔽板后进行，并使用适当的个人防护装备。在使用原代细胞前，本地方动物护理与使用委员会已批准该方案。

1. 培养的成骨细胞中的脂肪酸氧化

1. 继代培养原代颅骨成骨细胞¹² 或成骨细胞系如 Mc3t3-E1，接种于 T-25 培养瓶中（5 x 10⁵ 细胞/瓶）置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 μg/mL链霉素的α-MEM培养基中培养。
   1. 为每个处理组（即对照组和基因敲除组，或对照组和药物处理组）接种3-4个培养瓶用于实验。为每个处理组额外接种1-2个培养瓶，用于根据细胞数量或蛋白浓度进行归一化处理。将培养瓶置于37 °C、含5% CO₂的湿润细胞培养孵箱中培养。₂.
2. 将细胞培养2-3天，直至培养瓶中的细胞达到汇合状态。通过添加50 µg/mL抗坏血酸和10 mM β-甘油磷酸钠诱导汇合的细胞进行分化（参见 材料表)加入培养基中，并继续培养最多额外14天。
   注意：如果计划进行生长因子处理，则必须进行血清饥饿处理（即加入0.5%–1%胎牛血清）过夜。降低胎牛血清比例可减少培养体系中非放射性标记脂质的含量，从而增强外源性生长因子的作用效果。若需检测激素的作用，应使用活性炭处理去除激素的胎牛血清（charcoal-stripped FBS）。
3. 准备滤纸、15 mm × 30 mm 橡胶套管塞子和聚丙烯中心小室（参见 材料表实验前一天。
   1. 将一条 1 cm × 10 cm 的滤纸条折叠成扇形，放入聚丙烯中心小杯的桶部。将聚丙烯中心小杯的臂部穿过橡胶套管塞中心，然后将聚丙烯中心小杯放入 T-25 培养瓶中。随后用套管塞密封培养瓶（图1).
      注意：可能需要调整聚丙烯中心小室的位置，以确保其不与培养基接触。实验过程中，聚丙烯中心小室可防止滤纸接触标记培养基，同时便于收集 ¹⁴CO₂.
4. 实验当天，加入偶联物[1-¹⁴C]-油酸，通过将磷酸盐缓冲液中的20%牛血清白蛋白（每瓶5 μL）与终浓度为0.1 μCi/mL的[1-¹⁴C]-油酸（0.6 μL/瓶）置于1.5 mL微量离心管中。
   1. 然后将试管放入50 mL锥形管中，在37 °C下轻轻振荡孵育30分钟。为避免移液误差，额外准备1–2个含有油酸-BSA偶联物的烧瓶。
5. 从组织培养瓶中移除培养基，并加入1.5 mL新鲜的无血清饥饿培养基（步骤1.2）。
6. 每个培养瓶中，加入5.6 μL油酸-BSA溶液（步骤1.4）、2 μL 100 mM肉碱溶液和1 mL培养基，配制成标记溶液。将标记溶液加入培养瓶中。保留多余的溶液用于测定加入检测体系的总放射活性计数。
   注意：标记溶液不添加到用于定量细胞数量或蛋白质浓度的额外培养瓶中。
7. 将装有滤纸的聚丙烯中心小室放入烧瓶中，然后用橡胶塞密封。
   注意：聚丙烯中心小室绝不能接触培养基，否则会导致滤纸被放射性标记的脂肪酸交叉污染，而非 CO₂₂.
8. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育细胞培养物3小时₂.
9. 收集 ¹⁴CO₂向聚丙烯中心小室中注入150 μL的1 N NaOH以润湿滤纸，并向培养基中注入200 μL的1 M高氯酸。通过将针头刺穿橡胶塞的方式注入NaOH和高氯酸。
   注意：不应将橡胶塞从烧瓶中移除。这可能导致 ¹⁴CO₂ 以方便注射操作，注射时保持培养瓶直立，注射完成后将其恢复至培养位置。
10. 在55 °C下孵育烧瓶1小时。
11. 在细胞培养罩内将烧瓶冷却后打开，用镊子将聚丙烯中心小室中的滤纸取出，放入 3-4 mL 闪烁液中（参见 材料表在闪烁瓶中。
    ​注意：将100 μL过量标记溶液加入3-4 mL闪烁液中以测定总放射活性计数。另取100 μL基础培养基（不含[1-¹⁴将[C]-油酸加入3-4 mL闪烁液中以测定本底放射活性。
12. 室温孵育1小时或过夜后，使用闪烁计数器测量每分钟计数（cpm）的放射活性（参见 材料表).
13. 为标准化每分钟计数（cpm）结果，需从每种培养条件下未标记的T-25培养瓶中分离蛋白质提取物。用5 mL磷酸盐缓冲液洗涤，每瓶加入1 mL RIPA细胞裂解缓冲液，用细胞刮刀刮取细胞表面。
    1. 将 RIPA 缓冲液用移液器转移至微量离心管中，于 19,000 x g 4 °C 下离心 20 分钟。用移液器将上清液转移至新的微量离心管中，并根据 BCA 法测定蛋白质浓度（参见 材料表).
    2. 将闪烁计数器测得的原始cpm读数除以蛋白质浓度，以获得归一化的cpm值 ¹⁴CO₂ 产生（表1).
14. 根据当地规定处理闪烁小瓶、细胞培养材料、培养基、注射器等物品。对工作台面进行去污处理，并根据当地规定进行放射性污染擦拭检测。

2. 酸溶性代谢物的收集

注意：上述步骤 1.8 中使用的 3 小时孵育时间可能不足以将细胞摄取的全部[1-¹⁴C]全油酸完全氧化为 CO₂。脂肪酸氧化途径中的代谢流量也可通过测定酸可溶性组分中的放射性来评估。

1. 从每个处理过的T-25培养瓶中收集1 mL酸化培养基，转移至1.5 mL微量离心管中。
2. 加入60 μL 20% BSA和100 μL 16 M高氯酸。
3. 涡旋混匀，并在4 °C下孵育过夜。
4. 随后再次涡旋，于4 °C下以20,000 × g 离心30分钟。
5. 取200 μL上清液加入闪烁液中，测定放射活性（步骤1.12）。
6. 将读数归一化至蛋白浓度或DNA测定结果（步骤1.13.1）。

3. 葡萄糖氧化或氨基酸氧化的测定

1. 使用¹⁴C标记的葡萄糖或¹⁴C标记的氨基酸替代¹⁴C标记的油酸，以测定这些燃料分子的氧化情况。
2. 按照步骤1.1–1.2制备成骨细胞培养物。
3. 为启动实验，从组织培养瓶中移除培养基，并加入1.5 mL新鲜的无血清饥饿培养基。
4. 在1 mL饥饿培养基中配制含0.6 μCi的¹⁴C标记葡萄糖或¹⁴C标记氨基酸的标记溶液，并加入培养瓶中。
5. 执行步骤1.6–1.13。

结果

线粒体长链脂肪酸氧化需要肉碱棕榈酰转移酶-1（Cpt1）和肉碱棕榈酰转移酶-2（Cpt2）的酶活性。Cpt1是该代谢途径中的限速酶，但在哺乳动物基因组中存在三种同工型（Cpt-1a、Cpt-1b 和 Cpt-1c），其中一种同工型的基因功能缺失可能导致其他同工型代偿性上调¹³相比之下，Cpt2 由单个基因编码。在图示实验中 图2A，Cpt2基因的遗传性缺失会导致[1-¹⁴C]-油酸至 ¹⁴CO₂ 与对照组相比，在已分化7天的原代小鼠颅骨成骨细胞培养物中，酸溶性代谢物的标记水平下降约27%。剩余的将油酸氧化为CO₂的能力₂ 突变体成骨细胞中酸溶性代谢物标记水平的相对下降程度较小，可能是由于正常的或升高的脂肪酸摄取所致。事实上，在Cpt2缺陷的成骨细胞中，脂肪酰基肉碱的含量增加⁹在所示实验中 图2B，采用野生型成骨细胞及过表达Wnt1的成骨细...

讨论

上述步骤可直接评估脂肪酸氧化，因为所测定的产物是收集在经NaOH浸泡滤纸上的¹⁴CO₂，以及用高氯酸酸化培养物后收集的酸溶性代谢物。市面上可获得的检测试剂盒使用荧光标记的脂质分子或脂质类似物来测量脂质摄取，但无法确定用于能量生成的分解代谢过程。其他分解代谢的检测方法，例如¹³C代谢通量分析¹⁴，则需要专用的分析设备。本检测方法灵敏且相对快速，若仅需测定¹⁴CO₂水平，则可在一天内完成（图2）。或者，若需同时测定两项结果，可将滤纸在闪烁液中孵育过夜，并与酸溶性代谢物同时读数。若需要设置阴性对照，研究人员可预先用依托莫西（etomoxir）处理细胞，该物质是肉碱棕榈酰转移酶-1的不可逆抑制剂。然而，解释这些数据时需谨慎，因为依托莫西还会抑制腺苷酸转位酶及电子传递链的组分^15,16。在成骨细胞中，该检测已被用于评...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
[1-14C]-油酸	Perkin Elmer	NEC317050UC
15 x 30 mm 橡胶套管密封塞	VWR	89097-542
1 mL 注射器	BD precision	309628
25 G 针头（25 G x 1 1/2 英寸）	BD precision	305127
抗坏血酸	Sigma Aldrich	A4403
BCA 蛋白定量检测试剂盒	Thermo Fisher	23225	其他同类试剂盒也可使用
Beckman 闪烁计数器或等效设备	Beckman Coulter	LS6000SC
β-甘油磷酸钠	Sigma Aldrich	G6626
牛血清白蛋白	Sigma Aldrich	126609
肉碱	Sigma Aldrich	C0283
细胞裂解缓冲液			本方案适用于常规裂解缓冲液（例如 RIPA 缓冲液）
解剖镊			可从多个供应商处获得
DNA 定量检测试剂盒			可从多个供应商处获得
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液	Corning	20-030-CV
胎牛血清			可从多个供应商处获得
微量离心管，1.5 mL			可从多个供应商处获得
最低必需培养基，α 改良型	Corning	10-022-CV
青霉素-链霉素	Gibco	15140122
高氯酸	Sigma Aldrich	50439
聚丙烯中心小室	VWR	72760-048
氢氧化钠	Sigma Aldrich	S5881
T-25 倾斜颈组织培养瓶	Corning	430639
组织培养孵箱
胰蛋白酶（0.25%）-EDTA	Gibco	25200056
Ultima Gold（闪烁液）	PerkinElmer	6013329
Whatman 层析滤纸	Sigma Aldrich	WHA3030917