本方案描述了利用伪瞳现象和感光细胞的瞳孔机制，通过自动化设备测量家蝇复眼视觉轴空间排列的方法。
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本文内容
摘要
摘要
本文描述了一种自动测量昆虫复眼视觉轴空间排列的方法，昆虫复眼由数千个称为小眼的视觉单元组成。每个小眼从一个微小的立体角采集光学信息，其敏感度近似呈高斯分布（半高宽约为1˚），并以视觉轴为中心。这些小眼共同采集近乎全景视野中的视觉信息。因此，视觉轴的空间分布决定了眼睛的空间分辨率。了解复眼的光学结构及其视觉敏锐度，对于视觉信息神经处理的定量研究至关重要。本文介绍了一种利用小眼内在的、活体（in vivo）光学现象——伪瞳孔，以及感光细胞的瞳孔机制，来自动绘制复眼视觉轴的流程。我们概述了扫描昆虫眼睛的光机械装置，并以家蝇（Musca domestica）的实验结果为例，说明测量过程中的各个步骤。
引言
昆虫视觉系统的紧凑结构及其拥有者表现出的高度发达的视觉信息处理能力与敏捷性，引起了科学界和非科学界人士的浓厚兴趣。昆虫的复眼被认为是强大的光学器官，能够实现敏锐且多样的视觉功能1,2。例如，蝇类以其对移动物体的快速反应而著称，而蜜蜂则因具备色觉和偏振光视觉而闻名2。
节肢动物的复眼由大量结构相似的单元组成，这些单元称为小眼，每个小眼的顶端都覆盖有一个小平面透镜。在双翅目（蝇类）中，这些小平面透镜集合在一起形成角膜，通常近似呈半球形。每个小眼从半宽约为1˚的小立体角范围内采集入射光。两只眼睛的所有小眼共同覆盖了几乎完整的立体角，但小眼的视轴并非均匀分布。某些眼区具有较高密度的视轴，从而形成空间敏锐度较高的区域，俗称中央凹。眼睛的其余部分则具有较低的空间分辨率3,4,5,6,7,8,9。
对复眼光学结构进行定量分析，对于深入研究视觉信息的神经处理机制至关重要。对昆虫大脑神经网络的研究10通常需要了解小眼轴线的空间分布。此外，复眼结构已启发了多项技术创新。许多研制仿生人工眼的项目均基于现有对真实复眼的定量研究11,12,13。例如，已有基于昆虫复眼模型设计的半导体传感器，具备高空间分辨率11,14,15,16,17。然而，迄今为止开发的装置尚未实现现有昆虫眼睛的实际特征。要准确再现昆虫复眼及其空间组织结构，需要来自天然眼睛的详尽且可靠的数据，而这类数据目前尚不充分。
数据匮乏的主要原因是现有方法在绘制眼睛空间特征时极为繁琐。这促使人们尝试建立一种更自动化的视觉成像方法。在首次尝试对昆虫复眼进行自动化分析时，Douglass 和 Wehling18 开发了一种扫描角膜小眼大小的程序，并证明了该方法在几种蝇类物种中的可行性。本文在他们的基础上进一步拓展，不仅开发了用于扫描角膜小眼的方法，还实现了对小眼所属的感光单元视觉轴线的评估。我们以家蝇的眼睛为例，说明所涉及的操作流程。
扫描昆虫复眼的实验装置包括：部分光学组件，即配备相机和照明光学系统的显微镜；部分机械组件，即用于旋转被测昆虫的测角仪系统；以及部分计算组件，即用于控制仪器的软件驱动程序以及执行测量和分析的程序。所开发的方法涵盖一系列计算流程，从采集图像、选择相机通道、设定图像处理阈值，到通过其凸面反射的亮斑识别单个小眼的位置。傅里叶变换方法在图像分析中至关重要，既用于检测单个小眼，也用于分析小眼的排列模式。
本文结构如下：首先介绍实验装置以及伪瞳现象——一种用于识别活体眼睛中感光细胞视轴的光学标志19,20,21；随后概述扫描过程和图像分析中所使用的算法。
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方案
该方案符合本校的昆虫护理指南。
1. 家蝇 Musca domestica 的制备
- 从实验室饲养的果蝇群体中采集果蝇。将果蝇放入黄铜固定器中（图1）。
- 从固定管的上部切下6 mm（见材料表）。新管的上部外径为4 mm，内径为2.5 mm（图1A）。将活体果蝇放入管内，用棉塞封住管口以防止损伤果蝇，并推动果蝇使其头部从管口伸出，身体被固定（图1B）。用蜂蜡固定头部，确保复眼保持暴露（图1C-E）。
- 再次切割固定管，使其长度为10 mm（图1C）。将带有果蝇的塑料管放入黄铜固定器中，确保当固定器平放在桌面上时，果蝇的一只眼睛朝上（图1D、E）。
- 调整固定管的方向，使在测角仪仰角为0°时（即方位角载物台处于水平位置），显微镜的垂直照明光束与果蝇复眼表面中央区域（介于腹侧与背侧、前缘与后缘之间）垂直，从而可在装置允许的方位角和仰角范围内完整扫描整个复眼。
2. 将测角仪的旋转方位轴与显微镜光轴对齐
- 将校准销安装在方位旋转台上，以便调整其尖端的 x-y 位置，使其与电动台的方位轴重合。使用配备 5 倍物镜的显微镜，通过 z 轴操纵杆对尖端进行调焦（图 2）。
- 调整方位轴的 x-y 位置，使其与显微镜的光轴对齐，并使用 x 轴和 y 轴操纵杆确保俯仰和方位旋转轴已预先与中心销对齐。
- 操作方位和俯仰操纵杆，检查销钉是否在两个自由度上均处于中心位置。当对中良好时，销钉尖端在方位和俯仰旋转过程中基本保持在同一位置。
3. 使用电动载物台对齐果蝇眼睛
- 将俯仰台调至0°，把果蝇及其固定装置安装到方位角台上，用显微镜观察果蝇的眼睛。
- 打开照明LED，调节果蝇的水平位置，使伪瞳孔中心与显微镜对齐；通过旋转固定装置上的螺钉（图1D）调节果蝇的垂直位置，使深部伪瞳孔（DPP；图3）19,20,21聚焦于俯仰轴平面。
- 通过将深部伪瞳孔置于视野中央，使其与方位角和俯仰轴对齐（见图2）。利用粘附在果蝇固定装置底部的磁铁，将其牢固地固定在安装于方位角台的铁板上，同时允许手动滑动微调。
- 切换至显微镜上安装的数字相机视图。运行GRACE系统的软件初始化程序，包括电机控制器和Arduino LED控制器的初始化（图4）。为此，请打开MATLAB R2020a或更高版本，运行MATLAB脚本Initialize_All_Systems（补充文件1）。
- 确认果蝇的伪瞳孔（图3B,C）是否位于计算机屏幕投影图像的中心。
4. 自动对焦与自动居中
- 使用 z 轴操纵杆手动将焦距调整至角膜假瞳（CPP；图 3B）水平19,20,21。
- 运行自动对焦算法（补充文件 1，脚本 AF），以获得角膜层面的清晰图像。通过调节电动 z 轴载物台将焦点返回至 DPP 水平进行检查。记录 DPP 与 CPP 之间的距离（以电机步数表示）。
- 运行自动居中算法（补充文件 1，脚本 AC）以精细调节假瞳的居中位置。将焦点重新移回 CPP 水平。
- 重新运行自动对焦算法。将电动载物台当前位置设为零点（X, Y, Z, E, A）=（0, 0, 0, 0, 0），其中 E 表示仰角，A 表示方位角。
- 运行扫描算法（补充文件 1，脚本 Scan_Begin），该算法沿轨迹以 5° 步长采集眼球图像，同时执行自动居中和自动对焦算法。
- 采样结束后，关闭 LED 控制器和电机控制器。
- 应用图像处理算法（补充文件 1，脚本 ImProcFacets）对图像进行处理。
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结果
动物与光学刺激
实验所用家蝇（Musca domestica）来自格罗宁根大学进化遗传学系维持的培养种群。测量前，将家蝇用低熔点蜡固定于一个尺寸合适的管中以实现固定。随后将家蝇安装在电动测角仪的载物台上。两个旋转台的旋转中心与显微装置的焦点重合24。落射照明光束由光源提供，光线经半透镜反射后聚焦于光圈，并在家蝇复眼处成像via半透镜，从而激活特定光感受器细胞的瞳孔机制（图3）。通过以微小步长旋转家蝇，并在每一步后使用连接在显微镜上的彩色数码相机拍摄图像，可确定含有这些光感受器的小眼的光轴方向（图2）。由于瞳孔色素颗粒主要在长波长范围内反射光，因此使用数码相机的红色通道来区分伪瞳孔与小眼晶状体的反射；而蓝色通道则最有利于将晶状体反射与伪瞳孔分离。
自动对焦与自动居中算法
在扫描昆虫复眼时，主要...
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讨论
利用复眼的假瞳孔现象以及光依赖性瞳孔机制引起的反射变化，可以绘制出家蝇眼睛视轴的空间分布。因此，将待研究的家蝇固定在一种测角系统中，该系统可在计算机控制下，通过配备数码相机的显微镜装置观察其局部小眼排列模式。图像分析可生成眼睛图谱。实验中的一个主要难点在于，若在测量开始时未精确地将眼睛定位，即使测角装置发生微小旋转，所观察到的眼睛和假瞳孔位置也可能发生显著变化。通过将眼睛中心与测角仪的旋转中心对齐（在此位置可观察到深层假瞳孔），可最大限度减少这些变化。通过关联后续测量获得的图像，可追踪小眼排列模式。值得注意的是，旋转角度必须调整至较小值，因为在小眼排列非常规则的区域，相关性分析过程容易产生错误结果。
在此，我们展示了一幅部分复眼图谱（图8），证明了对昆虫复眼视力进行高度自动化测绘的可行性。通过将小眼间距与连续图像中心之间5°的位移进行比较，得出的相邻小眼间夹角约为2.0°–2.5°，该结果与此前通过更为繁琐的方法从同一物种（Musca domestica）获得的数据高度一致
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披露
作者声明无任何利益冲突。
致谢
本研究由美国空军科学研究办公室/欧洲航空航天研究与发展办公室（AFOSR/EOARD）提供资金支持（项目编号 FA9550-15-1-0068，授予 D.G.S.）。我们感谢 Primož Pirih 博士的诸多有益讨论，以及 Kehan Satu、Hein Leertouwer 和 Oscar Rincón Cardeño 提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 数码相机 | PointGrey | BFLY-U3-23S6C-C | 用于获取放大图像并与计算机进行数字通信 |
| 高功率星型LED | Velleman | LH3WW | 用于观察和成像复眼的光源 |
| 被测果蝇固定夹具 | 格罗宁根大学 | 由大学车间制造了多种设计 | |
| 直线电机 | ELERO | ELERO Junior 1, version C | 驱动显微镜上部上下运动（负载 300N，行程速度 15mm/s，额定电流 1.2A） |
| 低温熔化石蜡 | 各种品牌 | 低温熔点石蜡用于固定果蝇并将其固定在夹具上 | |
| 显微镜 | Zeiss | 任何其他品牌的显微镜均可使用；推荐使用5倍物镜 | |
| 电机与LED控制器 | 格罗宁根大学 | Z-o1 | 由格罗宁根大学设计和制造，基于Arduino和Adafruit技术 |
| 电动载物台 | Standa（立陶宛维尔纽斯） | 8MT175-50XYZ-8MR191-28 | 六轴电动载物台，经改装后具有五个自由度 |
| 光学元件 | LINUS | 多个透镜和光学元件构成落射照明系统（参见 Stavenga，《实验生物学杂志》205, 1077-1085, 2002） | |
| 运行MATLAB的计算机 | 格罗宁根大学 | 该计算机能够处理PointGrey相机的图像，控制LED亮度，并向系统电机控制器发送控制指令 | |
| 电源（36V，3.34A） | Standa（立陶宛维尔纽斯） | PUP120-17 | 专用于STANDA电机控制器的电源 |
| 电烙铁 | 各种品牌 | 用于熔化石蜡 | |
| 步进电机与直流电机控制器 | Standa（立陶宛维尔纽斯） | 8SMC4-USB-B9-B9 | 专用于STANDA电动载物台的控制器，可与MATLAB通信 |
| Finntip-61 | Finnpipette Ky, 赫尔辛基 | FINNTIP-61, 200-1000μL | Finnpipette移液器吸头，400个/盒。用于限制果蝇活动 |
| 雕刻笔造型/加热刻线工具 | Max Wax | 雕刻笔的尖端设计用于将石蜡转移至果蝇头部 | |
| MATLAB | Mathworks, Natick, MA, 美国 | 主程序及图像采集、图像分析和仪器控制工具箱 | 用于实现算法的编程语言 |
参考文献
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