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方法文章

5-氨基乙酰丙酸介导的光动力疗法对原发性骨肿瘤和骨转移瘤细胞系的作用

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DOI：

10.3791/63644

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2022年5月10日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Cell Biology, Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital of Tübingen, 2Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital of Tübingen

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案介绍了一种逐步暴露骨转移细胞系和原发性骨肿瘤至5-氨基乙酰丙酸介导的光动力治疗（PDT）的方法学流程。同时分析了PDT处理后对细胞迁移能力/侵袭性、活力、凋亡及衰老潜能的影响。

摘要

骨转移与患者预后不良及生活质量下降密切相关。光动力疗法（PDT）作为一种可靶向局部转移性骨病变的非侵入性治疗手段，正逐渐受到关注。本文介绍了一种 体外 研究光动力疗法对贴壁细胞系作用的方法。为此，我们展示了一种逐步操作流程，将原代细胞系（巨细胞骨肿瘤）和人骨转移性癌细胞系（来源于原发性浸润性导管乳腺癌和肾细胞癌）暴露于5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）介导的光动力疗法中。

在5-ALA-PDT照射（蓝光波长436 nm）后24小时，通过细胞迁移能力、存活率、凋亡特征以及细胞生长停滞（衰老）来评估治疗效果。在5-ALA-PDT照射后，来源于肌肉骨骼系统的细胞系对相同剂量和照射条件的PDT表现出不同的反应。根据PDT照射所引发的细胞损伤程度不同，观察到两种不同的细胞命运——凋亡和衰老。不同骨癌细胞系对PDT治疗的敏感性差异，为临床中选择更合适的PDT参数提供了有用信息。本实验方案旨在示范PDT在肌肉骨骼系统肿瘤细胞系中的应用，也可根据需要调整，用于研究PDT对多种癌细胞系、不同光敏剂及光源的治疗效应.

引言

尽管肿瘤学治疗不断进展，骨转移的治疗选择仍然有限且具有挑战性。目前的标准治疗方法是放射治疗，但其可能引发局部红斑、内脏器官毒性1和骨折愈合不良2等并发症。由于骨转移患者常伴有疼痛、高钙血症和神经学症状，导致活动能力受损和生活质量下降，因此亟需替代性的抗肿瘤治疗方案3。近期研究结果表明，光动力疗法（PDT）是一种具有前景的替代性抗肿瘤治疗手段，可直接靶向骨病变，既可单独使用，也可作为放射治疗的辅助治疗4。

光动力疗法（PDT）的作用机制本质上基于光敏化合物（光敏剂）在光照激发后将能量转移给组织中的氧气。该光敏剂在纳米尺度上的作用类似于电容器：当受到适当波长的光照射时，它可在基态下储存能量，并在从激发态返回原始基态时释放所储存的能量5。释放的能量引发两种光化学反应：其一是通过转移氢原子或电子，将氧气转化为活性氧自由基；其二是通过光敏剂底物向局部三重态氧分子进行横向能量转移，生成单线态氧粒子6。活性氧自由基和单线态氧分子对局部肿瘤细胞具有高度细胞毒性作用，并可通过诱导肿瘤血管内皮细胞凋亡，导致血管闭塞和局部炎症反应7。

传统的光敏剂是卟啉类化合物的衍生物，例如血卟啉和苯并卟啉8。使用对肿瘤组织具有更高亲和力的光敏剂物质可提高光动力疗法（PDT）的选择性9。特别是5-氨基乙酰丙酸（5-ALA），作为原卟啉IX的生物合成前体，可在光化性角化病、基底细胞癌、膀胱肿瘤和胃肠道癌症等肿瘤细胞中积聚5。采用不同的5-ALA递送方式，也可根据肿瘤的定位差异影响PDT的治疗效率。因此，局部应用5-ALA联合PDT已成为治疗光化性角化病的一线皮肤科疗法10。近期针对侵袭性导管乳腺癌细胞系骨转移的研究结果表明，在5-ALA介导的PDT处理后，可能抑制细胞迁移并诱导细胞凋亡11。然而，将PDT应用于筋膜下的人体组织（如骨组织）仍处于从临床前到实验性临床研究的阶段，其疗效尚需进一步提高。基于光疗的纳米颗粒应用在牙科领域已显示出显著影响12。因此，将纳米颗粒与PDT联合使用，有望拓展其在骨科肿瘤学中的应用范围。

以下实验方案描述了如何制备来源于原发性骨肿瘤和骨转移瘤细胞系的细胞，并对其进行5-ALA介导的光动力治疗（PDT），照射时间预先设定。文中还详细介绍了如何进行并评估5-ALA-PDT照射后的细胞迁移潜能、活力及衰老情况。逐步操作说明提供了一种简便且清晰的方法，以获得可靠且可重复的实验数据。同时讨论了光动力疗法在骨肿瘤病变治疗中的优势、局限性及未来展望。

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方案

使用了三种不同类型的细胞系："MAM"——源自肾细胞癌骨转移的细胞系，"MAC"——源自浸润性导管乳腺癌骨转移的细胞系，以及"17-1012"——骨巨细胞瘤细胞系。以骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）作为对照组。研究开始前已获得机构伦理批准（癌细胞系项目编号：008/2014BO2，MSCs项目编号：401/2013 BO2）。

1. 细胞培养

注意：培养基可预先配制。MAM 和 17-1012 的培养基由 RPMI 组成，添加 10%（v/v）胎牛血清（FBS）和 2 mM L-谷氨酰胺。MAC 和 MSCs 的培养基由含谷氨酰胺替代物的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）（参见材料表）组成，添加 4.5 g/L D-葡萄糖和 10%（v/v）FBS。

  1. 收获并传代细胞，直至达到80%融合度。
  2. 用5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，并使用移液器从培养瓶中吸除PBS。
    注意：此步骤可确保去除含有蛋白酶抑制剂的残余完全培养基。
  3. 加入3 mL 0.05%（v/v）胰蛋白酶-EDTA，使贴壁细胞从培养瓶底部解离。
  4. 将培养瓶置于含5% CO2的湿润环境中，37 °C孵育5分钟。
  5. 在相差显微镜下观察细胞脱落情况。
    注意：每种细胞类型的孵育时间需单独调整。避免细胞暴露于胰蛋白酶溶液过长时间（>10分钟）。
  6. 加入3 mL培养基以终止胰蛋白酶消化作用。
    注意：务必加入适合每种细胞类型的、含有10%（v/v）胎牛血清（FBS）的适当培养基。
  7. 将解离的细胞转移至离心管中，在7 °C下以350 × g离心7分钟。
  8. 弃去上清液。
  9. 用1 mL培养基重悬细胞沉淀，并按照先前所述方法使用血细胞计数板进行细胞计数13。

2. 光动力疗法的装置设置与照射

  1. 通过插入所有电缆和配件，准备 PDT 设备（参见材料表）。
  2. 调暗房间内的光线，以避免不必要的光耗散。
  3. 使用胶带将光纤直接固定在培养板上方，确保其位置正确并保持稳定。
    注意：希望光纤在各孔上方均匀分布，以确保所有细胞均被照射并接收到相同能量（图1）。
  4. 确保不要过度弯曲或损坏光纤，以免导致光强度降低。
  5. 用铝箔覆盖培养板，以最大限度减少光耗散。
  6. 按下开/关按钮，启动 PDT 设备。
  7. 将计量卡插入 PDT 设备前面的插槽中。
    注意：设备附带一张计量卡，对应 300 秒的照射时间。PDT 设备内部已自动集成额外的 2,000 秒程序。对于这两种照射时间，光均以连续输出模式在指定时间段内递送。
  8. 确保 PDT 光源显示屏上的计时器变更为计量卡上标明的规定时间。
  9. 通过踩下集成的脚踏开关，启动 PDT 治疗。
    ​注意：设备内置自动停止功能，系统可自动运行。在照射周期完成前，请勿中断光照过程或移除光纤。光照周期结束后，光源快门将自动关闭，不再输出任何光线。

3. 迁移实验

  1. 按以下密度接种细胞：每孔接种 2 × 104 个细胞（MAC）、1 × 104 个细胞（MAM）、3 × 104 个细胞（17-1012）以及 2.5 × 104 个细胞（MSCs），接种至集成于不透明 F 型底 6 孔板中的双室培养插件内。
  2. 将细胞在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 24 小时，随后移除插件。
    注意：为获得细胞迁移的起始参考点及初始无偏的间隙尺寸，需使用一个独立的培养板，该板不进行后续 5-ALA-PDT 处理（步骤 3.3–3.4），而是直接进行染色与定量分析（步骤 3.5–3.12）。
  3. 更换为含 1 mM 5-ALA 的新鲜无 FBS 培养基。
  4. 将细胞在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 4 小时。
    注意：作为对照，应同时设置额外孔组，使用不含 5-ALA 的培养基进行处理。
  5. 根据第 2 节所述条件，使用蓝光（436 nm，36 J/cm2）以连续输出模式对细胞进行 PDT 处理，照射时间分别为预设的 300 秒或 2,000 秒。
    注意：未接受 PDT 处理的培养板应作为对照组使用。
  6. 将细胞在 37 °C、5% CO2 条件下继续孵育 24 小时。
    注意：应定期观察细胞，评估各类细胞的迁移程度。此过程需针对每种细胞系进行优化。
  7. 用 1.5 mL PBS 洗涤细胞，随后彻底移除 PBS。
  8. 加入 1.5 mL 含 4%（v/v）多聚甲醛的 PBS 溶液，固定细胞并孵育 10 分钟。
  9. 加入 1.5 mL 70%（v/v）乙醇，孵育 10 分钟。
  10. 弃去乙醇，将培养板置于室温下晾干 10 分钟。
  11. 加入 1.5 mL 含 0.2%（v/v）考马斯亮蓝染料的 90%（v/v）乙醇溶液，孵育 20 分钟。
  12. 用双蒸水洗涤培养板。
    注意：为彻底清洗培养板并去除残留碎片，应将培养板在洁净的双蒸水中完全浸没 2–3 次。
  13. 将培养板置于室温下晾干 24 小时。
    注意：此阶段干燥后的培养板可在室温下保存至少数周。
  14. 使用倒置相差显微镜在 10 倍放大倍数下观察并拍摄细胞向间隙迁移的情况。
    注意：可在 5-ALA-PDT 处理后连续观察并拍摄活细胞迁移过程，最长可达 24 小时。然而，固定后的细胞可保存并在后续时间点进行拍摄。
  15. 将图像导出为所需格式，并使用科学图像处理与分析软件对间隙进行定量分析，方法如前文所述14。

4. 活性检测

  1. 以每孔50 µL培养基，将所有细胞以1.5 × 104的密度接种于96孔板中。
  2. 将细胞置于标准细胞培养箱中，在37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。
  3. 加入含5-ALA、终浓度为1 mM的无FBS培养基50 µL。
  4. 将细胞置于标准细胞培养箱中，在37 °C、5% CO2条件下继续孵育4小时。
    注意：由于细胞已含有50 µL培养基，应使用2倍浓度的试剂。实验中应设置仅含培养基的对照组。
  5. 按照第2节所述，使用蓝光（436 nm，36 J/cm2）以连续输出模式对细胞进行光动力治疗（PDT）照射，照射时间分别为300秒或2,000秒。
    注意：应设置未接受PDT照射的阴性对照组。
  6. 将照射后的细胞置于标准细胞培养箱中，在37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。
  7. 向细胞中加入15 µL MTS试剂，并在37 °C、5% CO2条件下孵育90分钟。
  8. 使用酶标仪在490 nm波长下测定吸光度。

5. 细胞生长停滞/衰老检测（β-半乳糖苷酶（β-Gal）活性）

注意：此处使用的所有试剂和缓冲液均来自检测试剂盒（参见材料表）。

  1. 以每孔100 µL培养基中接种密度为1.5 × 104 的细胞至96孔板中。将细胞置于标准细胞培养箱中，于37 °C、5% CO2 条件下孵育24小时。
  2. 加入含5-ALA（终浓度为1 mM）的100 µL新鲜无FBS培养基，于37 °C、5% CO2 条件下继续孵育4小时。
    注意：作为对照，应同时设置单独的孔，仅加入不含5-ALA光敏剂的新鲜培养基。
  3. 使用蓝光（436 nm，36 J/cm2）对细胞进行光动力治疗（PDT）照射，连续输出模式下照射时间分别为300秒或2,000秒，具体见第2节说明。
    注意：应同时设置未接受PDT照射的阴性对照组。
  4. 将细胞置于标准细胞培养箱中，于37 °C、5% CO2 条件下继续孵育24小时。
  5. 弃去培养基，用PBS洗涤细胞两次。
  6. 每孔加入100 µL 1x细胞裂解缓冲液，于4 °C孵育5分钟。
  7. 将裂解液在4 °C条件下以350 × g 离心10分钟，收集上清液。
  8. 取50 µL上清液转移至新的96孔板中，再加入50 µL 2x检测缓冲液。
  9. 将新的96孔板置于37 °C培养箱中孵育1.5小时。
    注意：应避免光照，防止荧光漂白。
  10. 取50 µL混合液转移至不透光的96孔板中，加入200 µL终止液。
  11. 使用荧光酶标仪在激发波长360 nm、发射波长465 nm条件下测定吸光度。

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结果

5-ALA PDT 照射后，MSC 对照组在迁移方面未表现出显著影响（图 2A，i，v，ix）。相比之下，MAC 细胞（图 1B 和 图 2A，iii，vii，xi）和 17-1012 细胞（图 1B 和 图 2A，ii，vi，x）在 300 秒和 2,000 秒光照暴露下均表现出迁移能力下降。相比之下，MAM 细胞系（来源于肾癌骨转移）在迁移潜力方面未观察到显著影响。然而，MAC 细胞系在 2,000 秒照射时间下表现出活力下降（p = 0.009）。相反，17-1012 细胞系在 300 秒照射时表现出上升趋势（p = 0.007），随后在 2,000 秒时下降（p = 0.257，图 3

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讨论

尽管现有治疗手段多样，癌症治疗反应仍存在差异，因此需要开发新方法，甚至采用联合疗法，在治疗骨转移的同时保留原始组织结构。在此背景下，光动力疗法（PDT）是一种颇具前景的替代方案。从简化的角度来看，PDT 包含两个基本组成部分：（1）一种无毒的光敏染料，称为光敏剂（PS）；（2）一个波长适当的外部光源，该光源需与 PS 的吸收光谱相匹配，从而激活光敏剂15。在本研究中，我们探讨了 5-ALA-PDT 处理对转移性和原发性骨肿瘤细胞系的影响11。

总体而言，不同癌症骨细胞系对PDT治疗的敏感性存在差异。尽管1 mM 5-ALA PDT处理显著抑制了侵袭性导管癌骨转移细胞的迁移能力并降低其细胞活力，但对骨巨细胞瘤的迁移能力未观察到显著影响。此外，肾细胞癌骨转移组和MSC组也未观察到明显效应11。随着PDT处理时间的延长，抑制效应更为显著，表明其具有处理时间依赖性，这与既往研究结果一致16,...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢原始出版物的共同作者们提供的帮助与支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
300 秒 PDT 计量卡IlluminOss Medical Inc.，美国罗德岛州东普罗维登斯n/ahttp://www.illuminoss.com
5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）光敏剂Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯A779310 mg
6孔板Greiner Bio-One，德国弗里克豪森657160
8孔板载玻片SARSTEDT AG & Co. KG，德国慕尼黑94.6140.802
96 孔板（F 型底）Greiner Bio-One，德国弗里肯豪森655180
CellTiter 96 Aqueous One
溶液 细胞增殖
测定（MTS测定）		普洛麦格，菲奇堡，
美国威斯康星州		G3580
细胞衰老检测Biotrend Chemikalien GmbH, Kö德国CBA-231定量衰老相关 ß-半乳糖苷酶检测
考马斯亮蓝 R250Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯350550.5%（w/v）
2孔细胞培养插件ibidi GmbH, Grä费尔芬，德国80209
DMEM (1x) + GlutaMax-I美国加利福尼亚州卡尔斯巴德 Life Technologies31966-021
胎牛血清（FBS）Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯F7524
荧光酶标仪Promega，美国威斯康星州麦迪逊GlowMAx®,
GM3510
血细胞计数板Hecht Assistent，Sondheim，德国4042
ImageJ美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院ImageJ（版本：1.53a）用于处理和分析科学图像的软件；https://imagej.net/
倒置相差显微镜Leica，德国韦茨拉尔DM IMBRE 100
甲醇 AnulaR NormapurVWR，法国丰特奈苏布瓦20847.307
多聚甲醛Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯158127粉末，95%纯度
PDT 设备（光源箱及配件）IlluminOss Medical Inc.，美国罗德岛州东普罗维登斯n/a蓝光 436 nm，36 J/cm2 http://www.illuminoss.com
青霉素-链霉素美国马萨诸塞州沃尔瑟姆，赛默飞世尔科技公司15140-12210,000 U/mL 青霉素
10,000 μg/mL 链霉素
磷酸盐缓冲液（PBS）Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆10010-015
RPMI 1640美国马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司21875034
分光光度计/微孔板读数仪BioTek Instruments GmbH，德国巴特弗里德里希斯哈尔EL800
0.4% 台盼蓝染料Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯T8154
胰蛋白酶-EDTA 10倍浓缩液Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯T4174

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