5-氨基乙酰丙酸介导的光动力疗法对原发性骨肿瘤和骨转移瘤细胞系的作用

摘要

本方案介绍了一种逐步暴露骨转移细胞系和原发性骨肿瘤至5-氨基乙酰丙酸介导的光动力治疗（PDT）的方法学流程。同时分析了PDT处理后对细胞迁移能力/侵袭性、活力、凋亡及衰老潜能的影响。

摘要

骨转移与患者预后不良及生活质量下降密切相关。光动力疗法（PDT）作为一种可靶向局部转移性骨病变的非侵入性治疗手段，正逐渐受到关注。本文介绍了一种 体外 研究光动力疗法对贴壁细胞系作用的方法。为此，我们展示了一种逐步操作流程，将原代细胞系（巨细胞骨肿瘤）和人骨转移性癌细胞系（来源于原发性浸润性导管乳腺癌和肾细胞癌）暴露于5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）介导的光动力疗法中。

在5-ALA-PDT照射（蓝光波长436 nm）后24小时，通过细胞迁移能力、存活率、凋亡特征以及细胞生长停滞（衰老）来评估治疗效果。在5-ALA-PDT照射后，来源于肌肉骨骼系统的细胞系对相同剂量和照射条件的PDT表现出不同的反应。根据PDT照射所引发的细胞损伤程度不同，观察到两种不同的细胞命运——凋亡和衰老。不同骨癌细胞系对PDT治疗的敏感性差异，为临床中选择更合适的PDT参数提供了有用信息。本实验方案旨在示范PDT在肌肉骨骼系统肿瘤细胞系中的应用，也可根据需要调整，用于研究PDT对多种癌细胞系、不同光敏剂及光源的治疗效应.

引言

尽管肿瘤学治疗不断进展，骨转移的治疗选择仍然有限且具有挑战性。目前的标准治疗方法是放射治疗，但其可能引发局部红斑、内脏器官毒性¹和骨折愈合不良²等并发症。由于骨转移患者常伴有疼痛、高钙血症和神经学症状，导致活动能力受损和生活质量下降，因此亟需替代性的抗肿瘤治疗方案³。近期研究结果表明，光动力疗法（PDT）是一种具有前景的替代性抗肿瘤治疗手段，可直接靶向骨病变，既可单独使用，也可作为放射治疗的辅助治疗⁴。

光动力疗法（PDT）的作用机制本质上基于光敏化合物（光敏剂）在光照激发后将能量转移给组织中的氧气。该光敏剂在纳米尺度上的作用类似于电容器：当受到适当波长的光照射时，它可在基态下储存能量，并在从激发态返回原始基态时释放所储存的能量⁵。释放的能量引发两种光化学反应：其一是通过转移氢原子或电子，将氧气转化为活性氧自由基；其二是通过光敏剂底物向局部三重态氧分子进行横向能量转移，生成单线态氧粒子⁶。活性氧自由基和单线态氧分子对局部肿瘤细胞具有高度细胞毒性作用，并可通过诱导肿瘤血管内皮细胞凋亡，导致血管闭塞和局部炎症反应⁷。

方案

使用了三种不同类型的细胞系："MAM"——源自肾细胞癌骨转移的细胞系，"MAC"——源自浸润性导管乳腺癌骨转移的细胞系，以及"17-1012"——骨巨细胞瘤细胞系。以骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）作为对照组。研究开始前已获得机构伦理批准（癌细胞系项目编号：008/2014BO2，MSCs项目编号：401/2013 BO2）。

1. 细胞培养

注意：培养基可预先配制。MAM 和 17-1012 的培养基由 RPMI 组成，添加 10%（v/v）胎牛血清（FBS）和 2 mM L-谷氨酰胺。MAC 和 MSCs 的培养基由含谷氨酰胺替代物的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）（参见材料表）组成，添加 4.5 g/L D-葡萄糖和 10%（v/v）FBS。

1. 收获并传代细胞，直至达到80%融合度。
2. 用5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，并使用移液器从培养瓶中吸除PBS。
   注意：此步骤可确保去除含有蛋白酶抑制剂的残余完全培养基。
3. 加入3 mL 0.05%（v/v）胰蛋白酶-EDTA，使贴壁细胞从培养瓶底部解离。
4. 将培养瓶置于含5% CO₂的湿润环境中，37 °C孵育5分钟。
5. ....

结果

5-ALA PDT 照射后，MSC 对照组在迁移方面未表现出显著影响（图 2A，i，v，ix）。相比之下，MAC 细胞（图 1B 和 图 2A，iii，vii，xi）和 17-1012 细胞（图 1B 和 图 2A，ii，vi，x）在 300 秒和 2,000 秒光照暴露下均表现出迁移能力下降。相比之下，MAM 细胞系（来源于肾癌骨转移）在迁移潜力方面未观察到显著影响。然而，MAC 细胞系在 2,000 秒照射时间下表现出活力下降（p = 0.009）。相反，17-1012 细胞系在 300 秒照射时表现出上升趋势（p = 0.007），随后在 2,000 秒时下降（p = 0.257，图 3

讨论

尽管现有治疗手段多样，癌症治疗反应仍存在差异，因此需要开发新方法，甚至采用联合疗法，在治疗骨转移的同时保留原始组织结构。在此背景下，光动力疗法（PDT）是一种颇具前景的替代方案。从简化的角度来看，PDT 包含两个基本组成部分：（1）一种无毒的光敏染料，称为光敏剂（PS）；（2）一个波长适当的外部光源，该光源需与 PS 的吸收光谱相匹配，从而激活光敏剂¹⁵。在本研究中，我们探讨了 5-ALA-PDT 处理对转移性和原发性骨肿瘤细胞系的影响¹¹。

总体而言，不同癌症骨细胞系对PDT治疗的敏感性存在差异。尽管1 mM 5-ALA PDT处理显著抑制了侵袭性导管癌骨转移细胞的迁移能力并降低其细胞活力，但对骨巨细胞瘤的迁移能力未观察到显著影响。此外，肾细胞癌骨转移组和MSC组也未观察到明显效应¹¹。随着PDT处理时间的延长，抑制效应更为显著，表明其具有处理时间依赖性，这与既往研究结果一致^16,.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
300 秒 PDT 计量卡	IlluminOss Medical Inc.，美国罗德岛州东普罗维登斯	n/a	http://www.illuminoss.com
5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）光敏剂	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	A7793	10 mg
6孔板	Greiner Bio-One，德国弗里克豪森	657160
8孔板载玻片	SARSTEDT AG & Co. KG，德国慕尼黑	94.6140.802
96 孔板（F 型底）	Greiner Bio-One，德国弗里肯豪森	655180
CellTiter 96 Aqueous One 溶液 细胞增殖 测定（MTS测定）	普洛麦格，菲奇堡， 美国威斯康星州	G3580
细胞衰老检测	Biotrend Chemikalien GmbH, Kö德国	CBA-231	定量衰老相关 ß-半乳糖苷酶检测
考马斯亮蓝 R250	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	35055	0.5%（w/v）
2孔细胞培养插件	ibidi GmbH, Grä费尔芬，德国	80209
DMEM (1x) + GlutaMax-I	美国加利福尼亚州卡尔斯巴德 Life Technologies	31966-021
胎牛血清（FBS）	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	F7524
荧光酶标仪	Promega，美国威斯康星州麦迪逊	GlowMAx®, GM3510
血细胞计数板	Hecht Assistent，Sondheim，德国	4042
ImageJ	美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院	ImageJ（版本：1.53a）	用于处理和分析科学图像的软件；https://imagej.net/
倒置相差显微镜	Leica，德国韦茨拉尔	DM IMBRE 100
甲醇 AnulaR Normapur	VWR，法国丰特奈苏布瓦	20847.307
多聚甲醛	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	158127	粉末，95%纯度
PDT 设备（光源箱及配件）	IlluminOss Medical Inc.，美国罗德岛州东普罗维登斯	n/a	蓝光 436 nm，36 J/cm2 http://www.illuminoss.com
青霉素-链霉素	美国马萨诸塞州沃尔瑟姆，赛默飞世尔科技公司	15140-122	10,000 U/mL 青霉素 10,000 μg/mL 链霉素
磷酸盐缓冲液（PBS）	Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	10010-015
RPMI 1640	美国马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司	21875034
分光光度计/微孔板读数仪	BioTek Instruments GmbH，德国巴特弗里德里希斯哈尔	EL800
0.4% 台盼蓝染料	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	T8154
胰蛋白酶-EDTA 10倍浓缩液	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	T4174