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方法文章

超声引导下诱导多能干细胞来源的心肌细胞在心肌梗死小鼠中的移植

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DOI：

10.3791/63647

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2022年3月30日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Surgery, Second Xiangya Hospital, Central South University, 2Hunan Provincial Key Laboratory of Cardiovascular Research, 3Hunan Fangsheng Pharmaceutical Co., Ltd.

本文内容

摘要

在小鼠心肌梗死部位周围进行超声引导下的细胞递送是一种安全、有效且便捷的细胞移植方法。

摘要

心肌梗死（MI）后细胞治疗的主要目标是有效提高移植细胞的存活率，而人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）是缺血性损伤后心脏修复的一种有前景的细胞来源。然而，较低的细胞移植率仍是实现有效心脏组织再生的重要障碍。本实验方案表明，通过超声引导经皮将多种hiPSC-CMs多次注射至MI区域，可有效提高细胞移植率。本研究还详细描述了hiPSC-CMs的完整培养过程、移植前预处理以及超声引导经皮递送方法。此外，利用人线粒体DNA可帮助检测hiPSC-CMs在小鼠其他器官中的缺失情况。最后，本文阐述了细胞移植后4周小鼠梗死边缘区心脏功能、血管生成、细胞大小及细胞凋亡的变化。可以得出结论：经超声心动图引导对左心室心肌进行经皮注射是一种可行、相对微创、令人满意、可重复且有效的细胞治疗方法。

引言

急性心肌梗死（MI）发生时，梗死区域的心肌细胞因缺血和缺氧而迅速死亡。细胞死亡和破裂后会释放多种炎症因子，同时炎症细胞浸润梗死部位，引发炎症反应1。值得注意的是，成纤维细胞和胶原蛋白取代了梗死区域的心肌细胞，形成无收缩性和电传导性的瘢痕组织。由于成年哺乳动物心肌细胞的再生能力有限，大面积梗死后形成的存活心肌组织通常不足以维持足够的心输出量2。心肌梗死可导致心力衰竭，在严重的心力衰竭病例中，患者只能依赖心脏移植或心室辅助装置来维持正常的心脏功能3,4。

心肌梗死（MI）后，理想的治疗策略是用新形成的心肌细胞替代已死亡的心肌细胞，并与健康组织建立电-机械耦合。然而，目前的治疗方案通常采用心肌挽救策略，而非心肌替代。目前，基于干细胞和祖细胞的治疗是促进心肌梗死后心肌修复最有前景的策略之一5。然而，这些细胞的移植仍存在若干问题，主要是成体干细胞难以分化为心肌细胞以及其存活时间较短6。

与使用胚胎干细胞（ES细胞）相关的伦理问题可通过诱导多能干细胞（iPSCs）得以避免，iPSCs是一种具有前景的细胞来源。此外，iPSCs具有强大的自我更新能力，并可分化为心肌细胞7。研究表明，移植到心肌梗死（MI）部位的人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）能够存活，并与宿主细胞形成缝隙连接8,9。然而，由于这些移植细胞处于缺血和炎症的微环境中，其存活率极低10,11。

已建立多种方法以提高移植细胞的存活率，例如对移植细胞进行缺氧和热休克预处理12,13、基因修饰14,15，以及细胞与毛细血管的同时移植16。然而，大多数方法受限于操作复杂性和高昂成本。因此，本研究提出一种可重复、便捷、相对微创且有效的hiPSC-CM递送方法。

超声引导下的心肌内细胞注射仅需一台高分辨率的小型兽用超声仪和一台微量注射器即可完成，不受操作部位限制。在超声引导下，通过剑突下途径从心包直接将细胞注入小鼠心肌，是一种安全的方案，可避免肝脏和肺组织损伤。该方法可与其他技术联合使用，显著提高移植细胞的存活率。

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方案

本研究中的所有动物实验均经中南大学湘雅二医院伦理委员会审核批准。有关本方案中使用的所有材料和设备的详细信息，请参见材料表。细胞注射、成像及安乐死的时间安排如下：t0—诱导心肌梗死，t1周—成像并移植细胞，t2周—成像并移植细胞，t4周—最终成像、安乐死及组织采集。

1. hiPSC 培养、心肌细胞分化及细胞纯化

  1. 在4 °C冰上将DMEM/F12与基底膜基质储存液按1.5:1的比例混合，分装后将所得混合液（基质稀释液）于-20 °C保存。在4 °C冰上将25 mL DMEM/F12培养基与1 mL基质稀释液充分混合，每孔加入1 mL至6孔板中。将培养板直立置于37 °C培养箱中1小时，随后吸除各孔中的DMEM/F12上清液。操作过程中切勿触碰6孔板底部。
  2. 从液氮中取出含hiPSCs的冻存管，在37 °C水浴中快速解冻。用75%酒精对冻存管外表面进行消毒，擦去酒精后将冻存管转移至无菌超净台中。
  3. 使用移液器将含hiPSCs的冻存液轻柔转移至15 mL离心管中，加入5 mL无饲养层ES培养基，室温下300 × g离心3分钟。弃去上清液，用6 mL无饲养层ES培养基轻柔重悬细胞。计数细胞，并用培养基将细胞浓度调整至5 × 105 个/mL。
  4. 向hiPSCs中加入ROCK抑制剂（Y27632），使其终浓度为5 µM。将含Y27632的hiPSCs转移至经基底膜基质预处理的6孔板中，轻柔地以“8”字形摇晃6孔板，使hiPSCs均匀分布。将细胞置于37 °C、5% CO2的湿润培养箱中直立培养24小时。随后更换为不含Y27632的无饲养层ES培养基。
  5. 当hiPSCs融合度达到80%时，吸除培养上清液，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次，加入含10 µM CHIR99021（GSK3-β抑制剂）的无胰岛素RPMI1640 + B27培养基，并将细胞置于37 °C、湿润CO2培养箱中培养24小时。
  6. 更换一半上清液为无胰岛素RPMI1640 + B27培养基，继续培养24小时。
  7. 完全更换为无胰岛素RPMI1640 + B27培养基。将培养板直立置于37 °C、5% CO2的湿润培养箱中培养24小时。
  8. 3天后完全更换为无胰岛素RPMI1640 + B27 + 5 µM IWR1（Wnt信号通路抑制剂）培养基，并将培养板置于37 °C、5% CO2的湿润培养箱中培养48小时。
  9. 5天后更换为无胰岛素RPMI1640 + B27培养基，继续在37 °C、湿润CO2培养箱中培养48小时。
  10. 7天后更换为含胰岛素的RPMI + B27培养基，将培养板置于37 °C、湿润CO2培养箱中培养3天。此后每3天更换一次RPMI + B27培养基。在分化第9至12天观察细胞是否出现自发性搏动。
  11. 观察到搏动细胞后，将RPMI + B27培养基更换为含乳酸的无葡萄糖RPMI 1640培养基（在500 mL无葡萄糖RPMI 1640培养基中加入1 mL乳酸）。将细胞置于37 °C、5% CO2的湿润培养箱中培养72小时。
  12. 72小时后，更换为RPMI + B27培养基，在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中继续培养48小时。
  13. 在负压条件下吸除培养上清液，用PBS洗涤细胞3次以去除残留培养基。使用细胞解离酶混合液在37 °C将hiPSC-CMs解离为单细胞。将获得的细胞收集至含3 mL心肌细胞支持液的15 mL离心管中，室温下300 × g离心2分钟，弃去上清液。
  14. 用RPMI + B27培养基重悬细胞，接种至经基底膜基质包被的6孔板中，在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中培养48小时。
  15. 为纯化细胞，更换培养上清液为含乳酸的无葡萄糖RPMI 1640培养基，在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中培养72小时。
  16. 更换为RPMI + B27培养基，此后每3天更换一次培养基。
  17. 持续上述操作30天，期间使用含乳酸的无葡萄糖培养基进行进一步纯化：每3天更换一次该培养基，培养3天后更换为RPMI + B27培养基。连续培养30天，直至hiPSC-CMs稳定搏动，用于小鼠心肌内注射。

2. hiPSC-CMs 的制备及小鼠急性心肌梗死模型的建立

  1. 吸除培养60天的hiPSC-CMs培养液上清，用PBS洗涤细胞3次，加入细胞解离酶混合液于37 °C条件下消化细胞使其分散为单细胞（约3–5分钟）。将细胞收集至含有5 mL RPMI + B27培养基的15 mL离心管中，充分混匀后计数以计算总细胞数。室温下以300 × g离心2分钟。弃去上清液，加入心肌细胞支持培养基重悬细胞，调整细胞浓度至0.6 × 105 个细胞/µL。
  2. 将重悬后的hiPSC-CMs置于37 °C环境中备用，以备注射14,17,18,19,20。
  3. 将小鼠放入连接异氟烷的麻醉箱中进行吸入麻醉诱导，随后在眼部涂抹兽用眼膏以防止麻醉期间眼睛干燥。
    注：异氟烷浓度为5%。实验过程中应注意实验室通风。
  4. 将小鼠平置于手术台上，轻捏其足部和尾部，观察反射是否消失，以判断麻醉是否充分。随后腹腔注射布托啡诺（0.1 mg/kg）。
  5. 在小鼠颈部中段及左侧胸部涂抹脱毛膏，5分钟后用纱布擦去脱毛膏及毛发。
  6. 用胶带固定小鼠四肢及尾巴，用2-0丝线固定门齿并用胶带加固。对手术区域（颈部中线及左侧胸部）依次交替使用聚维酮碘和酒精进行三轮消毒。
  7. 在消毒区域周围铺上手术巾。使用精细解剖剪和精细镊子沿颈部正中做切口，充分暴露气管。必要时可剪除少量颈前肌以稳定操作视野。
    注：操作人员对动物分组设盲。
  8. 经口腔插入气管插管（20 G导管穿刺针）。
  9. 将气管插管连接至呼吸机，观察胸廓运动，确认双侧肺通气良好。
  10. 调节呼吸参数（呼吸频率：100–150次/分钟，潮气量：250–300 µL）。随后将左后肢固定于右下侧，松开左前肢周围胶带，使用精细解剖剪和镊子在左侧胸壁第3–4肋间进行开胸，以最大程度暴露心脏。
  11. 在显微镜下使用镊子剥离心包膜，显露左心耳下缘的左前降支冠状动脉（LAD）。
  12. 使用6-0丝线结扎LAD近端。确认急性心肌梗死模型建立成功（结扎部位远端LAD由红色变为白色）后，逐层关闭胸腔，用4-0缝线间断缝合皮肤。假手术组动物除不进行结扎外，其余手术步骤均与上述相同。
  13. 关闭吸入麻醉，待小鼠恢复自主呼吸后拔除插管，并将其放回笼中。持续监测动物直至其意识充分恢复，能够维持胸卧位。在完全恢复前不得将其与其它动物同笼。术后每12小时腹腔注射布托啡诺（0.1 mg/kg × 3天）和卡洛芬（5 mg/kg × 1天）。
  14. 在移植hiPSC-CMs前3天开始，每日腹腔注射环孢素A（10 mg·kg-1·day-1），以防止移植细胞被排斥。移植后继续注射环孢素A达1个月。

3. 在超声引导下注射 hiPSC-CM

  1. 建立心肌梗死（MI）模型后，在MI术后第一天将MI模型小鼠（12周龄C57BL/6小鼠；体重22 g至24 g，雄性和雌性各占50%）分配至单次给药组（SD组，本研究中n = 8）和多次给药组（MD组，本研究中n = 8），并在MI术后第一周和第二周将小鼠置于连接5%异氟烷的麻醉箱中，以诱导吸入麻醉，随后进行气管插管。
  2. 将脱毛膏涂抹于小鼠胸部和上腹部的毛发区域，5分钟后用纱布擦去脱毛膏。将小鼠固定于手术台并监测其心率，持续给予吸入异氟烷，直至心率维持在400–500次/分钟（bpm）。
  3. 用胶带将小鼠的四肢和尾巴固定在检测平台上，并将平台温度设定为37 °C。
  4. 在小鼠上腹部涂抹专用超声耦合剂，并使用较小的高分辨率兽用超声探头获取小鼠肝脏图像。
  5. 将呼吸机频率下调至50 bpm。使用5 µL微量注射器吸取约3 × 105个细胞（来自步骤2.1）。将注射器固定于显微操作仪上，将3 mm针头插入左侧剑突旁位置（图1A）。在超声引导下沿膈肌上缘推进（图1B），观察呼吸节律与活动范围（图1C、D），并在呼气末期进入心包腔，避免损伤肝脏和肺组织（图1D）。
  6. 微量注射针进入心包腔后，将呼吸频率调回原始参数（150 bpm）。根据制造商说明书，采用M型超声心动图获取小鼠心脏胸骨旁长轴图像17（图1E）。在超声引导下，将3 × 105个细胞（图1F）分别注射至梗死区域的三个边缘部位（每个注射位点注入1 × 105个细胞）。
  7. 移除专用超声探头并清洗耦合剂。使小鼠脱离吸入麻醉，在完全清醒后将其放回笼中。
  8. 对MD组小鼠，在建立MI模型后第1周和第2周重复上述超声引导下的细胞注射操作。

左前降支结扎术后30天小鼠心脏功能评估、荧光标记、移植细胞计数、心肌梗死面积及器官内人源线粒体检测

  1. 心脏功能评估
    1. 将小鼠放入连接异氟烷的麻醉箱中进行吸入麻醉诱导，随后在眼睛上涂抹兽用眼膏以防止麻醉期间眼睛干燥。使用脱毛膏去除小鼠左侧胸部的毛发。将小鼠置于操作台上，监测心率并调节异氟烷吸入浓度，维持小鼠心率在400–500次/分钟。实验终点为心肌梗死（MI）诱导后第30天。
    2. 用胶带将小鼠四肢和尾巴固定在检测台上，并将平台温度设定为37 °C。
    3. 在心脏前区涂抹专用超声耦合剂后，根据制造商说明，使用（兽用）高分辨率心脏超声探头，在M型和B型超声心动图模式下获取胸骨旁长轴及二维短轴图像17。
    4. 超声检测完成后，清洗掉专用超声耦合剂，关闭吸入麻醉，待小鼠完全清醒后单独放回笼中。
    5. 分析所获得的数据，并使用分析软件计算左心室射血分数（EF）和缩短分数（FS）。确保操作人员对实验分组情况设盲17。
  2. 切片荧光标记
    1. 用PBS冲洗分离的心脏，随后将其在4 °C条件下浸入4%多聚甲醛中固定12小时。取出心脏后，再浸入30%蔗糖溶液中24小时以进行脱水处理。
    2. 将脱水后的心脏置于干冰上，使用最佳切割温度（OCT）包埋剂进行包埋。利用恒冷切片机从心尖至心底方向切取厚度为10 µm的切片，将切片贴附于载玻片上，并于-20 °C保存。
    3. 用PBS清洗载玻片上的心脏组织切片，每次3分钟。
    4. 在室温下使用0.5% Triton X-100对载玻片上的组织进行通透处理，持续8分钟，随后用PBS洗涤3次，每次5分钟。
    5. 用含10%驴血清和90% PBS的封闭液覆盖组织切片，在室温下封闭1小时。
    6. 去除封闭液后，加入用封闭液按1:100稀释的一抗，在4 °C条件下孵育过夜。随后用PBS洗涤3次，每次5分钟。
    7. 在室温下用荧光标记的二抗（用封闭液按1:100稀释）孵育载玻片上的组织1小时。
      注意：自此步骤起，应避免荧光标记的二抗暴露于光照下。
    8. 用PBS洗涤载玻片3次，每次5分钟。
    9. 使用含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂封片，并在荧光显微镜下拍照观察17。
  3. 移植的人诱导多能干细胞来源心肌细胞（hiPSC-CMs）计数17
    1. 对心脏冷冻切片进行组织免疫荧光染色，靶标包括人特异性肌钙蛋白T（hcTnT）、人核抗原（HNA）以及非特异性肌节α-肌动蛋白（Sarcomeric Alpha Actinin）。
    2. 将整个心脏连续切片后，每50张切片中选取1张进行荧光标记。
    3. 每张切片随机采集5个高倍视野图像。统计移植物视野数量，计算单位面积平均移植细胞数，记为A1/µm2。使用ImageJ软件（https://imagej.nih.gov/ij/）计算该切片的总移植面积，记为B1μm2，则该切片中移植细胞总数 = A1 × B121,22。
    4. 根据公式（1）计算每只小鼠心脏的总移植细胞数，根据公式（2）计算移植率，已知每50张切片中选取1张进行分析21,22。
    5. 每只小鼠心脏总移植细胞数 = (A1 × B1 + A2 × B2 +...+ An × Bn) × 50 （1）
      移植率 = 移植效率公式，hiPSC-CMs百分比，细胞分析与研究方程。 （2）
      注意：SD组细胞递送数量为3 × 105，MD组为3 × 3 × 105。
  4. 评估心肌梗死面积
    1. 将分离的心脏从心尖至心底方向切取厚度为10 µm的横截面冷冻切片（短轴方向）。
    2. 将整个心脏连续切片后，每30张切片中选取1张载玻片，将其置于58 °C预热的Bouin溶液中固定。根据制造商说明，使用0.04%直接红和0.1%快绿胶原染色剂（用PBS稀释）对切片进行染色17。
    3. 在显微镜下对心脏横截面进行整体拍照后，使用软件（如ImageJ）结合公式（3）分析图像14,17：
      梗死面积百分比 = 心脏分析方程，瘢痕体积与左心室比值，示意图，心血管研究。 × 100% （3）
  5. 检测各器官中的人线粒体DNA
    1. 使用5%异氟烷麻醉小鼠，并通过颈椎脱位法处死。在细胞移植后4周解剖小鼠，采集器官组织（肝脏、肺、脑、肾、脾）以及部分心肌组织（本部分n = 3）。
    2. 在液氮中研磨各器官组织，按照制造商说明，使用指定试剂盒（见材料表）提取组织DNA。
    3. 按照制造商说明，使用指定试剂盒及引物（见材料表）检测上述组织（步骤4.5.1所得）中的人线粒体DNA。

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结果

各组小鼠左心室功能的超声心动图评估显示，MD组的心肌梗死（MI）损伤得到有效逆转（图2A）。与MI组相比，SD组在MI后射血分数（EF）有所提高（从30%升至35%；图2B），缩短分数（FS）也有所增加（从18%升至22%；图2C）。然而，更为重要的是，经皮多次注射hiPSC-CMs使MD组小鼠在MI后的心脏EF显著升高（从30%升至42%；图2B），FS也明显提升（从18%升至28%；图2C）。

组织切片中非特异性α-肌动蛋白（αSA）、DAPI、人特异性肌钙蛋白T（hcTnT）和人核抗原（HNA）的荧光标记显示，MD组的移植细胞数量显著高于SD组（图3A）。尽管MD组仅比SD组多进行了两次注射，但MD组的移植细胞数量约为SD...

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讨论

本研究的关键步骤包括 hiPSC 培养、心肌细胞分化、hiPSC-CM 纯化以及将 hiPSC-CM 移植到小鼠心肌梗死部位。关键在于使用心脏超声经皮引导治疗，将 hiPSC-CM 注射至梗死边缘的梗死区域。

随着培养时间的延长，hiPSC-CM 的表型在形态学（细胞体积增大）、结构（肌纤维密度、排列方式、显微细胞簇）及生理学特性（钙处理和β-肾上腺素能反应）方面均随时间推移而发生分化相关的改变。本研究对第10天的细胞进行了荧光标记th 和 60th hiPSC向心肌细胞分化过程中，观察其形态学和结构变化。在第60天，hiPSC-CMs的细胞大小和肌节长度显著增加th 天，而非第10天th 第60天。该研究采用经分化为心肌细胞后相对稳定的hiPSC-CMs进行移植。此外，在hiPSC-CMs培养的60天期间，多次更换含乳酸但不含葡萄糖的培养基，以纯化心肌细胞并提高心肌细胞含量，从而避免移植细胞中非心肌细胞所引起的相关副作用。

在超声引导下进...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到国家自然科学基金重大研究计划（编号：91539111，资助对象：JY）、湖南省科技计划重点项目（编号：2020SK53420，资助对象：JY）以及湖南省科技创新计划项目（编号：2021RC2106，资助对象：CF）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>抗体
心肌肌钙蛋白TAbcamab8295
驴抗小鼠IgG H&L（Alexa Fluor 488）Abcamab150105
驴抗小鼠IgG H&L（Alexa Fluor 555）Abcamab150110
驴抗兔IgG H&L（Alexa Fluor 488）Abcamab150073
驴抗兔IgG H&L（Alexa Fluor 555）Abcamab150062
人的心肌肌钙蛋白TAbcamab91605
Isolectin B4载体FL-1201
肌节α-辅肌动蛋白Abcamab9465
麦芽凝集素赛默飞世尔科技W11261
<强>试剂
Accutase赛默飞世尔科技00-4555-56
B27 补充剂（不含胰岛素）赛默飞世尔科技A1895601
B27 补充剂（无血清）赛默飞世尔科技17–504-044
Bouin 氏液赛默飞世尔科技SDHT10132
CHIR99021SelleckCT99021
环孢素AMedchemexpressHY-B0579
直接红Sigma-Aldrich365548-25G
DMEM/F12赛默飞世尔科技11320033
DNeasy 血液 & 组织试剂盒Qiagen69504
快绿 FCFSigma-Aldrich F7252-5G
无葡萄糖 RPMI 1640赛默飞世尔科技11879020
IWR1SelleckS7086
乳酸Sigma-AldrichL6661
MatrigelBD 生物科学BD356234
mTeSR1干细胞技术72562
O.C.T. 包埋剂SAKURA4583
多聚甲醛Sigma-Aldrich158127
PowerUP SYBR Green MasterMix 试剂盒赛默飞世尔科技A25742
RPMI1640赛默飞世尔科技11875119
STEMdiff 心肌细胞冻存培养基/STEMdiff干细胞技术5030
STEMdiff 心肌细胞支持培养基干细胞技术5027
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
超声耦合剂CARENT22396269389
Y-27632SelleckS6390
<强>设备与耗材
应用生物系统公司赛默飞世尔科技7500 实时荧光定量 PCR
冷冻切片机LeicaCM1950
荧光显微镜奥林巴斯IX83
精细解剖剪精细科学工具15000-08
精细解剖镊Fine Science Tools11255-20
微量注射器Hamilton7633
小型动物麻醉机MATRXVMR
超高分辨率小动物超声成像系统VisualSonicsVevo 2100
<强>软件
统计产品与服务解决方案IBM21
Image J美国国立卫生研究院1.48
<强>人类线粒体DNA引物
正向引物序列CCGCTACCATAATCATCGCTAT
反向引物序列TGCTAATACAATGCCAGTCAGG

参考文献

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