在小鼠心肌梗死部位周围进行超声引导下的细胞递送是一种安全、有效且便捷的细胞移植方法。
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摘要
摘要
心肌梗死（MI）后细胞治疗的主要目标是有效提高移植细胞的存活率，而人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）是缺血性损伤后心脏修复的一种有前景的细胞来源。然而，较低的细胞移植率仍是实现有效心脏组织再生的重要障碍。本实验方案表明，通过超声引导经皮将多种hiPSC-CMs多次注射至MI区域，可有效提高细胞移植率。本研究还详细描述了hiPSC-CMs的完整培养过程、移植前预处理以及超声引导经皮递送方法。此外，利用人线粒体DNA可帮助检测hiPSC-CMs在小鼠其他器官中的缺失情况。最后，本文阐述了细胞移植后4周小鼠梗死边缘区心脏功能、血管生成、细胞大小及细胞凋亡的变化。可以得出结论：经超声心动图引导对左心室心肌进行经皮注射是一种可行、相对微创、令人满意、可重复且有效的细胞治疗方法。
引言
急性心肌梗死（MI）发生时，梗死区域的心肌细胞因缺血和缺氧而迅速死亡。细胞死亡和破裂后会释放多种炎症因子，同时炎症细胞浸润梗死部位，引发炎症反应1。值得注意的是，成纤维细胞和胶原蛋白取代了梗死区域的心肌细胞，形成无收缩性和电传导性的瘢痕组织。由于成年哺乳动物心肌细胞的再生能力有限，大面积梗死后形成的存活心肌组织通常不足以维持足够的心输出量2。心肌梗死可导致心力衰竭，在严重的心力衰竭病例中，患者只能依赖心脏移植或心室辅助装置来维持正常的心脏功能3,4。
心肌梗死（MI）后，理想的治疗策略是用新形成的心肌细胞替代已死亡的心肌细胞，并与健康组织建立电-机械耦合。然而，目前的治疗方案通常采用心肌挽救策略，而非心肌替代。目前，基于干细胞和祖细胞的治疗是促进心肌梗死后心肌修复最有前景的策略之一5。然而，这些细胞的移植仍存在若干问题，主要是成体干细胞难以分化为心肌细胞以及其存活时间较短6。
与使用胚胎干细胞（ES细胞）相关的伦理问题可通过诱导多能干细胞（iPSCs）得以避免，iPSCs是一种具有前景的细胞来源。此外，iPSCs具有....
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方案
本研究中的所有动物实验均经中南大学湘雅二医院伦理委员会审核批准。有关本方案中使用的所有材料和设备的详细信息，请参见材料表。细胞注射、成像及安乐死的时间安排如下：t0—诱导心肌梗死，t1周—成像并移植细胞，t2周—成像并移植细胞，t4周—最终成像、安乐死及组织采集。
1. hiPSC 培养、心肌细胞分化及细胞纯化
- 在4 °C冰上将DMEM/F12与基底膜基质储存液按1.5:1的比例混合，分装后将所得混合液（基质稀释液）于-20 °C保存。在4 °C冰上将25 mL DMEM/F12培养基与1 mL基质稀释液充分混合，每孔加入1 mL至6孔板中。将培养板直立置于37 °C培养箱中1小时，随后吸除各孔中的DMEM/F12上清液。操作过程中切勿触碰6孔板底部。
- 从液氮中取出含hiPSCs的冻存管，在37 °C水浴中快速解冻。用75%酒精对冻存管外表面进行消毒，擦去酒精后将冻存管转移至无菌超净台中。
- 使用移液器将含hiPSCs的冻存液轻柔转移至15 mL离心管中，加入5 mL无饲养层ES培养基，室温下300 × g离心3分钟。弃去上清液，用6 mL无饲养层ES培养基轻柔重悬细胞。计数细胞，并用培养基将细胞浓度调整至5 × 105 个/mL。
- 向hiPSCs中加入ROCK抑制剂（Y27632），使其....
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结果
各组小鼠左心室功能的超声心动图评估显示，MD组的心肌梗死（MI）损伤得到有效逆转（图2A）。与MI组相比，SD组在MI后射血分数（EF）有所提高（从30%升至35%；图2B），缩短分数（FS）也有所增加（从18%升至22%；图2C）。然而，更为重要的是，经皮多次注射hiPSC-CMs使MD组小鼠在MI后的心脏EF显著升高（从30%升至42%；图2B），FS也明显提升（从18%升至28%；图2C）。
组织切片中非特异性α-肌动蛋白（αSA）、DAPI、人特异性肌钙蛋白T（hcTnT）和人核抗原（HNA）的荧光标记显示，MD组的移植细胞数量显著高于SD组（图3A）。尽管MD组仅比SD组多进行了两次注射，但MD组的移植细胞数量约为SD.......
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讨论
本研究的关键步骤包括 hiPSC 培养、心肌细胞分化、hiPSC-CM 纯化以及将 hiPSC-CM 移植到小鼠心肌梗死部位。关键在于使用心脏超声经皮引导治疗，将 hiPSC-CM 注射至梗死边缘的梗死区域。
随着培养时间的延长，hiPSC-CM 的表型在形态学（细胞体积增大）、结构（肌纤维密度、排列方式、显微细胞簇）及生理学特性（钙处理和β-肾上腺素能反应）方面均随时间推移而发生分化相关的改变。本研究对第10天的细胞进行了荧光标记th 和 60th hiPSC向心肌细胞分化过程中，观察其形态学和结构变化。在第60天，hiPSC-CMs的细胞大小和肌节长度显著增加th 天，而非第10天th 第60天。该研究采用经分化为心肌细胞后相对稳定的hiPSC-CMs进行移植。此外，在hiPSC-CMs培养的60天期间，多次更换含乳酸但不含葡萄糖的培养基，以纯化心肌细胞并提高心肌细胞含量，从而避免移植细胞中非心肌细胞所引起的相关副作用。
在超声引导下进.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到国家自然科学基金重大研究计划（编号：91539111，资助对象：JY）、湖南省科技计划重点项目（编号：2020SK53420，资助对象：JY）以及湖南省科技创新计划项目（编号：2021RC2106，资助对象：CF）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>抗体 | |||
| 心肌肌钙蛋白T | Abcam | ab8295 | |
| 驴抗小鼠IgG H&L（Alexa Fluor 488） | Abcam | ab150105 | |
| 驴抗小鼠IgG H&L（Alexa Fluor 555） | Abcam | ab150110 | |
| 驴抗兔IgG H&L（Alexa Fluor 488） | Abcam | ab150073 | |
| 驴抗兔IgG H&L（Alexa Fluor 555） | Abcam | ab150062 | |
| 人的心肌肌钙蛋白T | Abcam | ab91605 | |
| Isolectin B4 | 载体 | FL-1201 | |
| 肌节α-辅肌动蛋白 | Abcam | ab9465 | |
| 麦芽凝集素 | 赛默飞世尔科技 | W11261 | |
| <强>试剂 | |||
| Accutase | 赛默飞世尔科技 | 00-4555-56 | |
| B27 补充剂（不含胰岛素） | 赛默飞世尔科技 | A1895601 | |
| B27 补充剂（无血清） | 赛默飞世尔科技 | 17–504-044 | |
| Bouin 氏液 | 赛默飞世尔科技 | SDHT10132 | |
| CHIR99021 | Selleck | CT99021 | |
| 环孢素A | Medchemexpress | HY-B0579 | |
| 直接红 | Sigma-Aldrich | 365548-25G | |
| DMEM/F12 | 赛默飞世尔科技 | 11320033 | |
| DNeasy 血液 & 组织试剂盒 | Qiagen | 69504 | |
| 快绿 FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| 无葡萄糖 RPMI 1640 | 赛默飞世尔科技 | 11879020 | |
| IWR1 | Selleck | S7086 | |
| 乳酸 | Sigma-Aldrich | L6661 | |
| Matrigel | BD 生物科学 | BD356234 | |
| mTeSR1 | 干细胞技术 | 72562 | |
| O.C.T. 包埋剂 | SAKURA | 4583 | |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PowerUP SYBR Green MasterMix 试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | A25742 | |
| RPMI1640 | 赛默飞世尔科技 | 11875119 | |
| STEMdiff 心肌细胞冻存培养基/STEMdiff | 干细胞技术 | 5030 | |
| STEMdiff 心肌细胞支持培养基 | 干细胞技术 | 5027 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| 超声耦合剂 | CARENT | 22396269389 | |
| Y-27632 | Selleck | S6390 | |
| <强>设备与耗材 | |||
| 应用生物系统公司 | 赛默飞世尔科技 | 7500 实时荧光定量 PCR | |
| 冷冻切片机 | Leica | CM1950 | |
| 荧光显微镜 | 奥林巴斯 | IX83 | |
| 精细解剖剪 | 精细科学工具 | 15000-08 | |
| 精细解剖镊 | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| 微量注射器 | Hamilton | 7633 | |
| 小型动物麻醉机 | MATRX | VMR | |
| 超高分辨率小动物超声成像系统 | VisualSonics | Vevo 2100 | |
| <强>软件 | |||
| 统计产品与服务解决方案 | IBM | 21 | |
| Image J | 美国国立卫生研究院 | 1.48 | |
| <强>人类线粒体DNA引物 | |||
| 正向引物序列 | CCGCTACCATAATCATCGCTAT | ||
| 反向引物序列 | TGCTAATACAATGCCAGTCAGG |
参考文献
- Leuschner, F., et al. Rapid monocyte kinetics in acute myocardial infarction are sustained by extramedullary monocytopoiesis. The Journal of Experimental Medicine. 209 (1), 123-137 (2012).
- Lázár, E., et al.
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