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方法文章

原代细胞培养研究微小RNA处理后小鼠穆勒胶质细胞的再生潜能

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DOI：

10.3791/63651

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2022年3月28日

 , 
1Department of Biological and Vision Sciences, College of Optometry, The State University of New York

本文内容

摘要

从小鼠视网膜获得的穆勒胶质细胞原代培养物是研究微小RNA处理后胶质细胞转化为视网膜前体细胞的一种非常稳健且可靠的工具。可在将其进一步应用于体内实验之前，利用该体系检测单个分子或分子组合的效果。 体内 方法。

摘要

穆勒胶质细胞（MG）是神经视网膜中的主要胶质细胞，可作为视网膜神经元再生的来源。在鱼类等低等脊椎动物中，MG介导的再生可自然发生；而在哺乳动物中，则需要特定因子的刺激或基因/表观遗传学操作。由于MG仅占视网膜细胞总数的5%，因此需要能够特异性研究该细胞群体的模型系统。其中一种模型系统是原代MG培养，该系统具有可重复性，可用于多种应用，包括分子/因子的筛选与鉴定、化合物或因子的测试、细胞监测和/或功能检测。该模型可用于研究补充或抑制微小RNA（miRNAs）后小鼠MG转化为视网膜神经元的潜能 通过 转染人工miRNA或其抑制剂。结合使用小胶质细胞特异性报告小鼠、免疫荧光标记和单细胞RNA测序（scRNA-seq），证实这些培养物中80%–90%的细胞为小胶质细胞（MG）。利用该模型发现，miRNA可将MG重编程为视网膜前体细胞（RPCs），随后进一步分化为类神经元细胞。该技术的优势在于，可在将miRNA候选分子应用于体内实验之前，先对其效率和作用效果进行评估。 体内 应用。

引言

Müller胶质细胞（MG）是神经视网膜中的主要胶质细胞。它们的功能与其他中枢神经系统部位的胶质细胞相似，包括维持水和离子稳态、为神经元提供营养以及保护组织。MG还具有另一个引人注目的特征：尽管它们是成熟的胶质细胞，但仍表达许多在视网膜发育晚期阶段的视网膜前体细胞（RPCs）中表达的基因1,2。这种相似性被认为是鱼类视网膜受损后MG介导的神经元自然再生现象的原因3,4。在此过程中，MG重新进入细胞周期，并去分化为RPCs，随后分化为全部六种类型的视网膜神经元。尽管这一现象在鱼类中自然发生，哺乳动物的MG却不能转化为神经元5,6。然而，它们可以被重编程。已有多种因子被证明能够将MG重编程为RPCs/神经元；其中一种因子是碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子achaete-scute同源物1（Ascl1），该因子参与了鱼类的视网膜再生过程7,8。在小鼠中，Ascl1仅在视网膜发生过程中表达于RPCs中，而在成熟的MG或视网膜神经元中则不表达9。

直接重编程细胞 体内 不仅在方法学上具有挑战性，还需要获得机构动物护理与使用委员会的批准。要获得批准，必须提供有关所使用或改变的因素、浓度、脱靶效应、潜在机制、毒性和效率的初步数据。细胞培养系统可在体内应用之前用于测试这些指标 体内 模型。此外，由于Müller胶质细胞仅占整个视网膜细胞群体的约5%10，MG 培养物可用于研究其功能11 以及它们的行为，包括迁移12,13增殖14，对损伤/损害的应激反应15,16，它们与其他细胞类型（如小胶质细胞）的相互作用17 或视网膜神经节细胞（RGCs）18，或其神经发生潜能19,20,21许多研究人员使用永生化细胞系进行研究，因为这些细胞具有无限增殖潜能，易于培养和转染。然而，在生物学相关性检测中，原代细胞比永生化细胞更优，因为原代细胞具有真实的细胞特性（基因和蛋白表达），更重要的是，它们代表发育过程中的特定阶段，因此具有相应的 "年龄"动物的年龄（以及由此获得的细胞的年龄）是细胞重编程过程中尤为关键的因素，因为细胞可塑性会随着发育阶段的推进而降低22.

本方案详细描述了如何利用miRNA对原代小胶质细胞进行重编程 体外 用于研究再生的方法。该肌抑素（MG）原代培养模型于2012年建立，旨在评估P53基因敲除小鼠中MG细胞的增殖特性。trp53-/- 小鼠23已证明培养的少突胶质细胞能维持其胶质细胞特征（即表达S100）β，Pax6 和 Sox2 蛋白的检测 通过 免疫荧光标记），并且它们具有相似性 体内 MG（经FACS纯化的MG的微阵列）23随后，采用病毒载体的另一种方法对胶质细胞的 mRNA 和蛋白质表达进行了验证和确认。20几年后，通过使用少突胶质细胞特异性的 Rlbp1CreERTtdTomatoSTOPfl/fl 报告基因小鼠24此外，对经FACS纯化的显微胶质细胞（MG）和原代培养的MG中一组miRNA的定量分析显示，在生长阶段，培养的MG中MG特异性miRNA（mGLiomiRs）的水平变化不大。然而，延长培养时间会导致miRNA水平发生变化，进而影响mRNA水平和蛋白质表达，因为miRNA是翻译调控因子。25.

2013年，该穆勒胶质细胞（MG）培养模型被用于测试多种转录因子将MG重编程为视网膜神经元的能力20. Ascl1 被发现是一种非常稳健且可靠的重编程因子。过表达 Ascl1通过 病毒载体诱导了形态学变化、神经元标志物的表达以及神经元电生理特性的获得。更重要的是，从这些首次研究中获得的见解和结果 体外 实验已成功转移至 体内 应用22,26 表明原代小胶质细胞培养是进行初始因子筛选及胶质细胞特征评估的可靠工具 体内 实施

几年前，有研究发现，在脑组织中富集且在视网膜神经元中高表达的miRNA miR-124能够诱导 Ascl1 培养的MG细胞中的表达21. Ascl1 在活细胞中的表达被可视化 通过 一个 Ascl1 报告基因小鼠（Ascl1CreERTtdTomatoSTOPfl/fl）。报告基因小鼠是一种经过基因改造的小鼠，其DNA中插入了报告基因。该报告基因编码报告蛋白，在本研究中为tdTomato，一种红色荧光蛋白。该报告蛋白用于报告目的基因的表达情况，此处指 Ascl1换句话说，表达 Ascl1 会变成红色。由于 Ascl1 是 仅 表达 在 视网膜前体细胞9, 这 Ascl1CreERTtdTomatoSTOPfl/fl 小鼠模型可用于追踪小胶质细胞向 Ascl1 表达RPCs，即转化后的细胞将表达红色荧光tdTomato报告蛋白。这是一种不可逆标记，因为这些细胞的DNA已被改变。因此，任何后续的神经元分化过程均可被可视化，因为tdTomato标记会保留在分化细胞中。如果 Ascl1 表达MG来源的RPCs（带有tdTomato标记）分化为神经元后，这些神经元仍将保留红色标记。因此，该小鼠模型不仅可用于活细胞成像中标记MG来源的RPCs，还可用于对这些MG来源的（红色）RPCs进行命运图谱绘制和谱系追踪。最近，关于miRNA的研究集 视网膜前体细胞 是 已鉴定 和 MG 培养物 的 Ascl1CreERTtdTomatoSTOPfl/fl 使用RPC报告基因小鼠筛选并检测这些miRNA对重编程能力与效率的影响27一种候选分子——RPC-miRNA miR-25，被发现能够将培养的MG细胞重编程为 Ascl1 表达（Ascl1-Tomato+）的细胞。这些重编程细胞随时间推移逐渐获得神经元特征，包括神经元形态（胞体较小，具有短或长的细突起）以及神经元转录本的表达水平测定 通过 scRNA-Seq 以及神经元蛋白表达的验证 通过 免疫荧光标记27.

此处的实验方案详细描述了如何培养和转染来自P12小鼠的MG细胞，该方法改编自先前的研究工作21,24,27选择本方案中所述的miRNA miR-25，该miRNA在视网膜前体细胞（RPCs）中高表达，而在穆勒胶质细胞（MG）或视网膜神经元中表达水平较低。为了过表达miR-25，使用小鼠miR-25模拟物，即人工合成的miRNA分子。作为对照，使用来自一种miRNA的模拟物 秀丽隐杆线虫 选择在哺乳动物细胞中无功能的基因，通过可视化方法实现了对MG向RPC转化过程的观察 通过 RPC 报告小鼠（Ascl1CreERTtdTomatoSTOPfl/fl)，一种混合背景的小鼠（C57BL/6, S129，以及 ICR品系）。然而，该培养方法适用于所有小鼠品系，包括野生型品系。近年来，原始实验方案已经过改良，以缩短生长期和整体培养周期，确保胶质细胞状态更加稳定，并最大限度减少长期培养过程中出现的细胞退行性变化。常规转染的时间窗口也从3小时延长至2天。如前所述，尽管当前方案将穆勒胶质细胞（MG）培养作为再生研究的工具进行描述，但该方法不仅可用于测试重编程因子，还可根据需要调整用于其他研究，包括MG的迁移或增殖行为、损伤/细胞损伤相关模型，以及潜在机制和信号通路的鉴定等。

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方案

涉及动物受试者的实验程序已获得纽约州立大学视光学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

注意：该培养方案包括三个阶段：生长期、转染期和转化期。整体方案的时间线总结见图1。

1. 培养基及所有所需试剂的准备

注意：所有步骤均需在A2或B2级生物安全柜（BSC）中进行。在生长阶段，使用含高血清的生长培养基，该培养基由基础神经元培养基添加表皮生长因子（EGF）组成。在转化阶段，则使用含低血清并添加神经元补充物的神经生理学基础培养基，以确保神经元的分化与存活。

  1. 通过在200 mL基础神经元培养基中添加20 mL胎牛血清（FBS，10%）、1 mL 200 mM L-谷氨酰胺（0.5%）、2 mL青霉素/链霉素（1%）和2 mL N2补充剂（1%）来配制生长培养基（用于生长阶段）。使用孔径为0.22 µm的滤器进行无菌过滤。使用前在37 °C金属珠浴中预热培养基。
  2. 根据生产商说明书（见材料表）配制神经元培养基（用于转化阶段）：在100 mL无血清神经生理学基础培养基中加入2 mL B27神经元补充剂（2%）、1 mL N2补充剂（1%）、20 µL 100 ng/mL脑源性神经营养因子（BDNF，用含0.1%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS）重悬，终浓度20 ng/mL）、20 µL 100 ng/mL胶质细胞源性神经营养因子（GDNF，用无菌Hanks平衡盐溶液[HBSS]重悬，终浓度20 ng/mL）、500 µL 100 mg/mL二丁酰环腺苷酸（Dibutyryl-cAMP，用DMSO重悬）、70 µL 50 ng/mL抗坏血酸（用无菌PBS重悬）以及1.5 mL青霉素/链霉素。进行无菌过滤（使用孔径为0.22 µm的滤器）。使用前在37 °C金属珠浴中预热培养基。
    注意：这些培养基可在4 °C保存1个月。
  3. 根据生产商方案重悬视网膜解离所需试剂——木瓜蛋白酶（Papain）、DNase I和卵黏蛋白（Ovomucoid）。将750 µL木瓜蛋白酶分装至无菌1.5 mL离心管中，75 µL DNase I分装至无菌0.6 mL离心管中，750 µL卵黏蛋白蛋白酶抑制剂分装至2 mL离心管中。将木瓜蛋白酶和DNase I分装物于-20 °C冷冻保存，卵黏蛋白分装物则保存于4 °C以避免试剂降解。使用前于室温下解冻。
    注意：木瓜蛋白酶、DNase I和卵黏蛋白包含于一种名为木瓜蛋白酶解离系统（Papain Dissociation System）的试剂盒中（见材料表）。
  4. 若进行免疫荧光标记，则根据产品说明书配制用于盖玻片包被的多聚-L-鸟氨酸（Poly-O）和层粘连蛋白（Laminin）（Poly-O：0.1 mg/mL溶于无菌水；Laminin：将1.2 mg/mL原液按1:50比例稀释于DMEM中）。将Poly-O和Laminin各分装2.5 mL后于-20 °C冷冻保存。使用前于室温解冻。
    ​注意：仅当进行免疫荧光标记和激光扫描显微镜检测时才需要执行步骤1.4。

2. 小鼠与组织提取

注意：在这些重编程研究中，通过将 Ascl1CreERT 小鼠（Ascl1-CreERT：Jax # 012882）与 tdTomatoSTOPfl/fl 小鼠（B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J: Jax # 007914）杂交，构建了 Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl 小鼠。该小鼠具有混合遗传背景（C57BL/6、S129 和 ICR strain）。该小鼠的基因型如图1A所示。所有品系均可用于本实验方案。

  1. 佩戴手套，并使用70%乙醇对工作台面、解剖显微镜及所有精细工具（Dumont #5精细镊子、Dumont #7弯头镊子、精细剪刀和Vannas剪刀）进行消毒。将10 cm硅胶涂层黑色解剖皿暴露于紫外线下20分钟以完成消毒。
  2. 组织提取用培养皿和孔板的准备
    1. 准备一个24孔板用于眼球收集和样本分离（每只小鼠的两个眼球置于同一孔中，并标注小鼠编号），每孔加入约1 mL冷HBSS（4 °C）。将24孔板置于冰上。
    2. 在无菌10 cm培养皿（用于清洗）和已消毒的硅胶涂层解剖皿中加入数毫升冷HBSS（4 °C），确保组织完全浸没于HBSS中。
    3. 准备一个无菌1.5 mL离心管，内含1 mL 70%乙醇。
    4. 标记12孔细胞培养板，注明培养编号、日期、品系及所有必要信息。
  3. 采用任一经批准的方法处死P12小鼠。
  4. 眼球摘除
    1. 用拇指和食指轻轻夹住小鼠头部，固定眼球周围区域。
    2. 使用Dumont #7弯头镊子，轻柔地伸至眼球后方剪断视神经，小心取出眼球。
      注意：若使用成年小鼠，则不应使用弯头镊子，也不应牵拉眼球。应使用精细剪刀小心沿眼球周围剪开，切断视神经，但不得剪破眼球本身。使用镊子小心取出眼球。
  5. 眼球清洗
    1. 将眼球短暂浸入含乙醇的离心管中，以避免动物体表细菌污染。
    2. 将眼球在10 cm培养皿中短暂清洗后，放入置于冰上的24孔板中。
  6. 对另一侧眼球重复步骤2.4和2.5。操作过程中始终保持孔板置于冰上。将同一只动物的两个眼球放入置于解剖显微镜下、带有光源的解剖皿中。
  7. 视网膜提取
    1. 用Dumont #5精细镊子夹住视神经及巩膜周围的结缔组织，将眼球固定并轻压于解剖皿上（角膜朝上）。
    2. 使用30 G针头在角膜中央刺一个小孔，以便Vannas剪刀更容易进入。
    3. 使用Vannas剪刀沿睫状体环形剪开角膜，并用Dumont #5精细镊子小心移除角膜、晶状体、虹膜和玻璃体。图2A展示了内含视网膜的眼杯结构。
    4. 使用Vannas剪刀剪开巩膜直至暴露视神经，剪断视神经后，用Dumont #5精细镊子小心提取视网膜。
    5. 使用另一把Dumont #5精细镊子轻推视网膜，以促进玻璃体完全去除。图2B展示了两个已提取的视网膜。
  8. 转移与清洗
    1. 剪去无菌移液管尖端约2.5 cm以扩大管口直径。使用该管尖吸取完整视网膜，避免损伤组织。
    2. 将视网膜转移至盛有冷HBSS（4 °C）的新无菌培养皿中，轻轻晃动培养皿（前后、左右摇动）。
    3. 使用移液管尖小心推动视网膜，以洗去视网膜色素上皮（RPE）细胞。
      注意：也可选择将包含晶状体和玻璃体的整个视网膜从眼杯中取出，随后再从已提取的视网膜上去除晶状体和玻璃体。若视网膜发生撕裂，务必收集所有碎片用于后续解离；否则将导致组织量不足，无法形成融合的细胞层。
  9. 立即将分离的视网膜放入24孔板中新的洁净孔内，每孔含1 mL HBSS。解剖过程中始终保持24孔板置于冰上。
  10. 重复步骤2.7–2.9以分离第二只视网膜。

3. 视网膜解离

注意：所有后续步骤（直至细胞收获）均须在A2或B2级生物安全柜（BSC）中进行。

  1. 按如下方法配制木瓜蛋白酶/DNase I 消化液。
    1. 对于六块视网膜，加入 75 µL 将DNase I加入含有 750 µL 来自步骤1.3的木瓜蛋白酶，并小心混匀（解离混合液）。
    2. 对于本方案所需的单个样品制备，将总体积分装 825 µL 分为三等份： 275 µL 每只小鼠（两个视网膜）将混合物放入一个1.5 mL离心管中。根据样本量计算所需DNase I和Papain的用量。
      注意：一个试管中的木瓜蛋白酶/脱氧核糖核酸酶 I 混合液最多可解离六只视网膜。然而，单独处理每个样本比合并处理能形成更少的细胞团块，并获得更佳的细胞生长效果。
  2. 将两片视网膜转移至木瓜蛋白酶/DNase I 消化液中。使用 tip 口径扩大的移液枪（步骤 2.8.1），吸取视网膜，待视网膜沉降至 tip 底部后，将其释放至含有木瓜蛋白酶/DNase I 混合液的离心管中，注意避免带入过多 HBSS。
  3. 置于摇床上，在细胞培养箱中孵育10分钟（37 °C，5% CO₂2).
  4. 用1 mL移液器轻轻吹打细胞20-30次，使细胞解离。待细胞完全解离（即形成均匀溶液，无团块）后，加入 275 µL 加入木瓜蛋白酶解离试剂盒中的卵黏蛋白蛋白酶抑制剂以中和木瓜蛋白酶。用移液器轻轻吹打混匀。
    注意：如果六只视网膜被分离 825 µL 木瓜蛋白酶/DNase I 混合物 825 µL 需要卵类粘蛋白。
  5. 将混合物在 300 x g 10分钟 4 °C.
  6. 添加表皮生长因子（EGF， 1 µL 每1 mL培养基，重悬于 200 µg/mL 在 PBS 中）加入预热的生长培养基（每只小鼠 1 mL）至计算体积 37 °C.
    注意：根据实验设计，可在培养开始时加入增殖标志物5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）、4-羟基他莫昔芬（4-OHT）或其他所需因子。
  7. 小心地从离心机中取出离心管，不要触碰管底的沉淀物。
  8. 小心且彻底地移除上清液。用重悬细胞沉淀 500 µL 含EGF的生长培养基
  9. 将细胞悬液转移至已标记的12孔板中的一个孔内（图 2C）。用另一份 500 µL 加入含EGF的生长培养基，并添加至孔中（每孔总体积为1 mL）。
  10. 重复步骤 3.8 和 3.9，处理所有其他样品。
  11. 轻轻前后、左右摇动培养板三次。将培养板放入培养箱中（37 °C, CO2).
    ​注意：若使用转基因小鼠，需对每只动物进行基因分型（图 2D）。确定 Cre 重组酶阳性与阴性小鼠，并相应标记培养板。本方案中，仅使用以下细胞 Cre 重组酶阳性报告小鼠用于后续步骤。细胞的 Cre 阴性样本被冷冻并用于其他用途。

4. 生长阶段

注意：生长期持续约 4-5 天（图 1B）。向含有细胞的孔中添加液体时，移液器应指向孔壁，并缓慢释放液体，以避免细胞脱落。切勿直接将液体加在细胞上方。

  1. 解离后一天，移除培养基并加入 1 mL 新鲜的含 EGF 生长培养基。
  2. 第 3 天，移除培养基并加入 1 mL HBSS（室温）以去除细胞碎片。轻轻左右来回摇动。移除 HBSS，重复洗涤步骤，然后加入 1 mL 预热的含 EGF 生长培养基。
  3. 每天监测细胞，评估其生长状态，直至细胞达到 90%–100% 汇合度。图 3 展示了 MG 细胞随时间良好生长的一个示例。检查是否存在可能的污染或细胞死亡（补充图 1）。弃置受污染的培养物。
    注意：为监测和记录细胞状态，使用配备相机的光学显微镜及 4x、10x 或 20x 物镜，在不同放大倍数下拍摄图像。本研究中使用荧光显微镜。

5. 多聚-L-鸟氨酸（Poly-O）和层粘连蛋白包被盖玻片的制备

注意：仅当进行免疫荧光标记和共聚焦激光扫描显微镜检测时，此步骤才必要。成像需使用圆形玻璃盖玻片（直径 12 mm）。包被方案也可参见神经元培养基产品说明书（见材料表）。

  1. 使用无菌的Dumont #2AP镊子，小心地将无菌盖玻片放置在24孔板每个孔的中央。
    注意：请将盖玻片置于孔的中央位置。若将盖玻片放置在孔壁附近，会在后续步骤中引起表面张力问题。
  2. 在室温下解冻一份2.5 mL的Poly-O分装液，并将其中100 µL加至每张盖玻片的中央。
  3. 将24孔板置于37 °C培养箱中孵育30分钟。
  4. 去除Poly-O溶液，并用约1 mL的无菌水对带有盖玻片的孔进行三次洗涤。
  5. 将24孔板置于生物安全柜中过夜干燥。同时，在4 °C条件下过夜解冻2.5 mL的层粘连蛋白（Laminin）。
  6. 次日早晨，向每张盖玻片中央加入100 µL层粘连蛋白，并在37 °C培养箱中孵育4小时。
  7. 小心且彻底地去除层粘连蛋白溶液。
  8. 若无法立即进行传代操作，请将24孔板保存在4 °C环境中。
    ​注意：已包被的盖玻片在制备完成后可在4 °C保存数天。

6. 细胞传代以去除存活的神经元

注意：细胞传代的目的是去除神经元细胞，而非增加细胞数量。胶质细胞仅能分裂少数几次，传代后将不再继续生长。不要稀释细胞悬液。一个12孔板中长满的单孔细胞可接种至一个12孔板的单孔，或两个24孔板的孔中。当使用包被的盖玻片时，仅约三分之一的盖玻片表面被包被。因此，一个12孔板中长满的单孔细胞（约80%–90%融合度）可获得置于24孔板中的六个盖玻片，且细胞呈融合生长状态。也可选择其他比例以提高或降低细胞密度。本方案中使用一只Cre+报告基因小鼠 [一次实验，两种处理：miR-25 或对照 miR；技术重复 n = 3（每种处理三个盖玻片），生物学重复 n = 1]。技术重复和生物学重复的数量可根据实验设计进行不同设定。

  1. 检查细胞是否达到 90%–100% 汇合度（包括孔的边缘；图 3E、F）。
  2. 移除培养基，加入 1 mL HBSS（室温）洗涤。轻轻摇动培养板（前后、左右方向），然后完全移除 HBSS。
  3. 加入 500 µL 预热的含胰蛋白酶溶液（在 37 °C 金属珠浴中预热），使细胞从孔底脱落。轻轻摇动（前后、左右方向），在 37 °C 培养箱中孵育 2 分钟。
  4. 将培养板从培养箱转移至生物安全柜。倾斜培养板，吸除含胰蛋白酶的溶液，并小心缓慢地在孔内反复吹打数次，直至细胞完全脱落。将培养板对着光源观察，确保底部无残留细胞。
  5. 将该细胞悬液转移至无菌 1.5 mL 离心管中。在 4 °C 条件下，以 300 × g 离心 8 分钟。
  6. 弃去上清液，通过加入 600 µL 预热的生长培养基（每孔 100 µL，共 6 孔/盖玻片；添加 EGF，1:1000）小心重悬细胞沉淀，并上下吹打约 30–40 次。
    注意：此时可按照细胞系冻存与复苏的标准操作流程，将细胞在 -80 °C 或液氮中冷冻保存。若进行冻存，则不应使用含 EGF 的培养基（生长培养基）重悬细胞，而应使用基础培养基（不含 EGF）与冻存液（1:1 比例）重悬。步骤 6.1.1 至 6.6.2 描述了细胞冻存的具体操作。若不进行冻存，请继续执行步骤 6.7。
    1. 通过混合 100 µL DMSO 与 400 µL FBS 制备冻存液（每孔/样本总体积为 500 µL）。
    2. 用 500 µL 预热的生长培养基重悬细胞沉淀。将细胞悬液加入 500 µL DMSO/FBS 冻存液中（总体积为 1 mL）。所有样本处理期间保持离心管置于冰上。将细胞在 -20 °C 冻存 1 小时，随后转移至 -80 °C 保存。
  7. 取 600 µL 细胞/培养基悬液中的 100 µL（步骤 6.6），接种于 24 孔板中六个已包被的盖玻片中央（参见步骤 5）。小心将培养板放入培养箱，使细胞沉降。
    注意：从 12 孔板的一个孔中收获的 600 µL 细胞悬液中取 100 µL 接种，可达到 90%–100% 的细胞汇合度，此为转染所需条件。
  8. 3 小时后检查细胞，确认其是否已贴附于盖玻片。加入 400 µL 添加 EGF 的生长培养基。
    ​注意：细胞通常在次日即可用于转染（图 3G）。若汇合度未达 90%–100%，可继续培养一天；若仍不足，则不应用于转染。若进行其他下游实验（如 miRNA 谱分析、RNA-Seq、RT-qPCR 或 Western blot），则需将细胞以 1:1 比例传代至 12 孔板（无需包被处理），并用于 RNA/蛋白提取。

7. 转染

注意：转染阶段包括仅含转染培养基的3小时阶段（转染操作详见转染试剂配套的转染手册），以及一个延长阶段，在此阶段中转染试剂和miRNA仍然存在，但已添加含有必要补充成分的神经元培养基（总时长为2天；图1B）。本方案中将对六孔进行转染：其中三孔加入重编程miRNA miR-25，另外三孔加入对照miRNA。

  1. 检查细胞是否达到 90% 汇合度，并在转染前记录或拍摄细胞图像。
  2. 移除生长培养基，加入 500 µL 的 HBSS（室温）洗涤细胞。
  3. 移除 HBSS，每孔加入 400 µL 用于转染的低血清培养基，将培养板放回 37 °C 培养箱中。
  4. 按照转染试剂生产商提供的说明书配制转染混合液。需配制两种混合液：转染试剂混合液和 miRNA 混合液（示意图见 图 1B）。
    1. 配制转染试剂混合液：对于 24 孔板，每孔需要 49 µL 低血清培养基和 1 µL 转染试剂（总体积 50 µL）。对于六孔，将 294 µL 低血清培养基与 6 µL 转染试剂混合，通过轻柔吹打充分混匀。
    2. 配制 miRNA 模拟物混合液：对于 24 孔板，每孔需要 50 µL 模拟物混合液。其中三孔加入对照 miRNA，另外三孔加入 miR-25。本实验方案采用 200 nM 的终浓度。
      1. 对于 miR-25 处理组（三孔），将 150 µL 低血清培养基与 3 µL miR-25 模拟物（100 µM 储存液）混合，轻柔吹打混匀，室温孵育 5 分钟。
        对于对照模拟物处理组（三孔），将 150 µL 低血清培养基与 3 µL 对照 miRNA 模拟物（100 µM 储存液）混合，轻柔吹打混匀，室温孵育 5 分钟。
        注意：miRNA 模拟物的体积取决于所需的稀释倍数和浓度（20–500 nM）。也可使用 miRNA 抑制剂（antagomiRs）或其他分子（如质粒）。多种分子组合亦可同时进行转染。
  5. 将 miRNA 模拟物混合液与转染试剂混合液混合，通过缓慢、彻底地轻柔吹打小心混匀。室温孵育 20 分钟（遵循生产商说明书）。
  6. 使用 20 µL 移液器将上述转染混合液逐滴缓慢加入孔中细胞表面附近，贴近培养基液面加样。轻轻摇动培养板（前后、左右方向）。
  7. 置于 37 °C 培养箱中孵育 3 小时。
  8. 3 小时后，向各孔中加入神经元培养基（每孔 500 µL），并补充 4-羟基他莫昔芬（用 2.58 mL 乙醇配制 5 mM 储存液，终浓度为 250 nM）以激活 Cre 重组酶，以及 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU，用 2 mL DMSO 配制 10 mM 储存液，终浓度为 1 µM）以标记细胞增殖。
    警告：4-羟基他莫昔芬和 EdU 被确认为人类致癌物、致畸物和致突变物。使用前请阅读材料安全数据表，佩戴手套、护目镜和实验服。请根据生产商推荐方法配制两种试剂。避免吸入该物质/混合物。使用后务必密封保存。废弃物必须依照国家和地方规定进行处置。操作后应清洗手部和面部。
  9. 置于 37 °C 培养箱中孵育 2 天（图 1B）。

8. 细胞转化

注意：细胞转化阶段持续约5-6天（图1B），但也可能持续更长时间。

  1. 每天检查细胞，观察 tdTomato 表达是否成功、是否存在细胞死亡和/或污染。细胞密度无变化（图4). 4-羟基他莫昔芬处理后1天即可观察到最初微弱的红色荧光标记细胞。需使用荧光显微镜对细胞进行监测和成像。
    注意：本研究中使用荧光显微镜进行活体成像。图像采用4x、10x或20x物镜拍摄。
  2. 转染两天后，移除培养基并加入 500 µL 每孔加入含4-羟基他莫昔芬和EdU的预热神经元培养基。
  3. 每隔一天更换一次新鲜培养基，直至收获细胞。
  4. 拍摄活体图像，用于评估红色荧光的数量Ascl1 表达细胞及其形态学变化（图4 和 图5A- C).

9. 细胞收获：免疫荧光标记的固定

注意：细胞可用于其他下游应用，包括大量或单细胞 RNA 测序（scRNA-Seq）、逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）或蛋白质印迹（western blot）。

  1. 吸去培养基，每孔加入 500 µL 冷的 HBSS（4 °C），轻轻摇动培养板（前后、左右方向）。吸去 HBSS。
  2. 加入 500 µL 2% 多聚甲醛（PFA）固定细胞，在室温下孵育 20 分钟。
  3. 根据既定方案进行免疫荧光标记。

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结果

本方案描述了如何从P12小鼠视网膜中培养穆勒胶质细胞（MG），并利用Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl 视网膜前体细胞（RPC）报告小鼠，通过miR-25将这些细胞重编程为视网膜神经元。此前的研究已详细报道了该方法可用于筛选其他适合的miRNA（模拟物或抑制剂，可单独使用或组合使用），以将MG重编程为RPC，进而获得神经元样细胞特征27。本方法已进行优化，可加快细胞培养速度，从而最大限度减少人工环境随时间推移所引起的细胞改变24,28,29。

视网膜解离与原代穆勒胶质细胞培养的生长阶段
最早在第一天即可观察到第一个肌无力症状 体外 使用光学显微镜观察。MG 具有管状、细长的形态以及浅灰色的细胞体（

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讨论

本方案描述了如何从解离的小鼠视网膜中培养穆勒胶质细胞（MG），用于miRNA介导的重编程研究。如多项先前研究所示并证实，这些培养物中绝大多数细胞（80%–90%）为MG20,23,24。该方法是一种非常稳健且可靠的培养技术，只要严格按照方案操作，结果易于重复21,27。然而，培养物的成功生长及其重编程效率取决于多种因素。

首先，小鼠的年龄对细胞成功生长具有重要作用。因此，如果从野生型小鼠或表型类似于野生型的转基因小鼠（如报告基因小鼠）中培养Müller胶质细胞（MG），获得融合MG单层的最晚时间为出生后第12天（P12）。在P12阶段，所有视网膜神经元和MG均已分化，视网膜中不再存在视网膜前体细胞（RPCs）。MG表达成熟的MG标志物，如谷氨酰胺合成酶或谷氨酸-天冬氨酸转运体（GL...

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披露

华盛顿大学已就本报告中包含的部分研究成果向发明人Nikolas Jorstad、Stefanie G. Wohl和Thomas A. Reh提交了专利申请。该专利的名称为“刺激视网膜再生的方法和组合物”。

致谢

作者感谢 Ann Beaton 博士及实验室所有成员对本文手稿提出的宝贵意见。特别感谢 Tom Reh 博士、Julia Pollak 博士和 Russ Taylor 博士在 S.G.W. 于西雅图华盛顿大学进行博士后培训期间，将其引入使用穆勒胶质细胞（MG）原代培养作为筛选工具的方法。本研究由 Empire Innovation Program（EIP）向 S.G.W. 提供的资助、纽约州立大学视光学院向 S.G.W. 提供的启动资金，以及美国国立眼科研究所（NEI）授予 S.G.W. 的 R01EY032532 项目资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
动物
Ascl1-CreERT 小鼠 Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J杰克逊实验室#012882Ascl1-CreERT 小鼠与 tdTomato 小鼠杂交
tdTomato-STOPfl/fl 小鼠  B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J杰克逊实验室#007914基因分型是鉴定 Ascl1CreER 阳性小鼠所必需的
试剂
(Z)-4-羟基他莫昔芬， ≥98% Z 异构体Sigma-AldrichH7904-5MG在乙醇中重新溶解，分装后冷冻
16 % 甲醛（PFA）水溶液VWR100504-7822% PFA（用磷酸盐缓冲液 PBS 配制），冷冻分装
Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab')₂2 片段驴抗兔IgG（H+L）杰克逊免疫研究实验室711-546-152稀释比例 1:500
Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab')₂2 片段驴抗山羊IgG（H+L）杰克逊免疫研究实验室705-606-147稀释比例 1:500
抗人 Otx2 抗体，R&D系统Fisher ScientificAF1979稀释比例 1:500
抗兔MAP2抗体Sigma-AldrichM9942-200UL稀释比例 1:250
抗红色荧光蛋白（RFP）抗体Antibodies-OnlineABIN334653稀释比例 1:500
抗坏血酸STEMCELL Technologies72132在 PBS 中重悬，分装冻存
B-27 补充剂Fisher Scientific17-504-044冷冻分装样品
脑生理神经元培养基STEMCELL Technologies05790在1.2节中用作神经元培养基质，储存于 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831.
1643231638-1407032920.163831
5521&_gac=1.124727416.1643
231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR
IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY
dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY
-26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 成像试剂盒Fisher ScientificC10340按照说明书进行重悬， 4°C
二丁酰-cAMPSTEMCELL Technologies73886用二甲基亚砜（DMSO）重悬，分装冻存
二甲基亚砜（DMSO）Fisher ScientificMT-25950CQC
胎牛血清（FBS）Fisher ScientificMT35010CV冻存分装样本
Gibco Opti-MEM 低血清培养基，含 GlutaMAX 补充剂Fisher Scientific51-985-034储存于 4 °C
Gibco TrypLE Express 酶（1X），酚红Fisher Scientific12-605-028含有胰蛋白酶的溶液，储存于 4 °C
HBSSFisher Scientific14-025-134储存于 4 °C
小鼠层粘连蛋白，天然Fisher Scientific23-017-015

冻存分装样本，(https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831.
1643231638-1407032920.163831
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26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB

L-谷氨酰胺Fisher Scientific25-030-081冻存分装样本
miRIDIAN microRNA 模拟物阴性对照地平线CN-001000-01-50用无RN酶水重悬（200 µM），冷冻分装样品
miRIDIAN microRNA 小鼠 mmu-miR-25-3p 模拟物地平线C-310564-05-0050用无RN酶水重悬（200 µM），冷冻分装样品
N-2 补充剂Fisher Scientific17-502-048冷冻分装样品
Neurobasal 培养基Fisher Scientific21-103-049用于第1.1节生长培养基，储存于 4 °C
木瓜蛋白酶解离系统沃辛顿生物化学LK003153在Earle平衡盐溶液中重悬，分装后冷冻
青霉素-链霉素Fisher Scientific15-140-122冻存分装样本
磷酸盐缓冲液（PBS）Fisher Scientific20-012-043
聚-L-鸟氨酸氢溴化物Sigma-AldrichP4538-50MG用无菌水重悬，分装后冷冻
重组人BDNF蛋白R&D系统248-BDB-050/CF用无菌 PBS 和 FBS 重悬，分装后冻存
重组小鼠 EGF 蛋白Fisher Scientific2028EG200用无菌 PBS 重悬，分装后冻存
重组大鼠GDNF蛋白Fisher Scientific512GF010用无菌 PBS 重悬，分装后冻存
罗丹明红 570 - AffiniPure F(ab')2 片段驴抗大鼠IgG（H+L）杰克逊免疫研究实验室712-296-150稀释比例 1:1,000
封片介质Fisher ScientificOB100-01
转染试剂（Lipofectamine 3000）Fisher ScientificL3000015储存于 4 °C
塑料器皿/耗材
0.6 mL 微量离心管Fisher Scientific50-408-120
1.5 mL 微量离心管Fisher Scientific50-408-129
10 µL 提示  无菌滤器  移液器吸头Fisher Scientific02-707-439
100 µL 提示  无菌滤膜移液器吸头Fisher Scientific02-707-431
1000 µL TIP 无菌滤膜吸头Fisher Scientific02-707-404
2.0 mL 微量离心管Fisher Scientific50-408-138
20 µL 提示  无菌滤膜移液器吸头Fisher Scientific02-707-432
可调体积移液器（2.5、10、20、100、200、 & 1000 µL)Eppendorf2231300008
一次性移液管Fisher Scientific13-669-12
12孔平底带盖培养板Fisher Scientific08-772-29
24孔带盖平底多孔板Fisher Scientific08-772-1
移液器  无菌滤器 10 mL 一次性血清移液管Fisher Scientific13-676-10J
移液器  无菌滤器 50 mL 一次性血清移液管Fisher Scientific13-676-10Q
移液器  无菌滤器 5 mL 一次性血清移液管Fisher Scientific13-676-10H
无粉丁腈检查手套Fisher Scientific19-130-1597B
圆形盖玻片（直径12 mm，厚度0.17–0.25 mm）Fisher Scientific22293232
真空滤器，孔径=0.22 µmFisher Scientific09-761-106
设备
1300 B2 生物安全柜赛默飞世尔科技1310
一体化荧光显微镜 Keyence BZ-X 810Keyence9011800000
双目变焦立体显微镜视觉科学VS-1EZ-IFR07
一次性培养皿（100 mm 直径）VWR25384-088
Dumont #5 镊子 - 生物学/钛合金Fine Science Tools11252-40
Dumont #55 镊子 - 生物学/不锈钢Fine Science Tools11255-20
Dumont #7 弯头镊子 - 生物学/钛合金Fine Science Tools11272-40
Eppendorf 离心机 5430 REppendorf2231000508
精细剪刀-锋利Fine Science Tools14058-11
McPherson-Vannas 剪刀，8 cmWorld Precision Instruments14124
金属珠浴Lab Armor74309-714
摆动式混合器，电气=115V，60Hz，转速=24 rpmVWR82007-202
硅胶涂层解剖培养皿（90 mm 直径）生命系统仪器设备DD-ECON-90-BLK-5PK
镊子，经济型 #5World Precision Instruments501979
水套式CO2培养箱VWR10810-744

参考文献

  1. Jadhav, A. P., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller glial cells in the vertebrate retina. Progress in Retinal and Eye Research. 28 (4), 249-262 (2009).
  2. Roesch, K., et al. The transcriptome of retinal Müller glial cells. The Journal of Comparative Neurology. 509 (2), 225-238 (2008).
  3. Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature Reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
  4. Konar, G. J., Ferguson, C., Flickinger, Z., Kent, M. R., Patton, J. G. miRNAs and Muller Glia Reprogramming During Retina Regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 632632(2020).
  5. Karl, M. O., Reh, T. A. Regenerative medicine for retinal diseases: activating endogenous repair mechanisms. Trends in Molecular Medicine. 16 (4), 193-202 (2010).
  6. Wilken, M. S., Reh, T. A. Retinal regeneration in birds and mice. Current Opinion in Genetics and Development. 40, 57-64 (2016).
  7. Fausett, B. V., Gumerson, J. D., Goldman, D. The proneural basic helix-loop-helix gene ascl1a is required for retina regeneration. The Journal of Neuroscience. 28 (5), 1109-1117 (2008).
  8. Ramachandran, R., Fausett, B. V., Goldman, D. Ascl1a regulates Müller glia dedifferentiation and retinal regeneration through a Lin-28-dependent, let-7 microRNA signalling pathway. Nature Cell Biology. 12 (11), 1101-1107 (2010).
  9. Brzezinski, J. A. t, Kim, E. J., Johnson, J. E., Reh, T. A. Ascl1 expression defines a subpopulation of lineage-restricted progenitors in the mammalian retina. Development. 138 (16), 3519-3531 (2011).
  10. Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 18 (21), 8936-8946 (1998).
  11. Del Rio, P., et al. GDNF-induced osteopontin from Muller glial cells promotes photoreceptor survival in the Pde6brd1 mouse model of retinal degeneration. Glia. 59 (5), 821-832 (2011).
  12. Pena, J., et al. Controlled microenvironments to evaluate chemotactic properties of cultured Muller glia. Experimental Eye Research. 173, 129-137 (2018).
  13. Pena, J. S., Vazquez, M. VEGF Upregulates EGFR expression to stimulate chemotactic behaviors in the rMC-1 model of Muller glia. Brain Sciences. 10 (6), 330(2020).
  14. Ueki, Y., Reh, T. A. EGF stimulates Müller glial proliferation via a BMP-dependent mechanism. Glia. 61 (5), 778-789 (2013).
  15. Zhang, X., Feng, Z., Li, C., Zheng, Y. Morphological and migratory alterations in retinal Muller cells during early stages of hypoxia and oxidative stress. Neural Regeneration Research. 7 (1), 31-35 (2012).
  16. Sheline, C. T., Zhou, Y., Bai, S. Light-induced photoreceptor and RPE degeneration involve zinc toxicity and are attenuated by pyruvate, nicotinamide, or cyclic light. Molecular Vision. 16, 2639-2652 (2010).
  17. Wang, M., Ma, W., Zhao, L., Fariss, R. N., Wong, W. T. Adaptive Muller cell responses to microglial activation mediate neuroprotection and coordinate inflammation in the retina. Journal of Neuroinflammation. 8, 173(2011).
  18. Pereiro, X., Miltner, A. M., La Torre, A., Vecino, E. Effects of adult muller cells and their conditioned media on the survival of stem cell-derived retinal ganglion cells. Cells. 9 (8), 1759(2020).
  19. Xia, X., Teotia, P., Patel, H., Van Hook, M. J., Ahmad, I. Chemical induction of neurogenic properties in mammalian Muller glia. Stem Cells. 39 (8), 1081-1090 (2021).
  20. Pollak, J., et al. ASCL1 reprograms mouse Müller glia into neurogenic retinal progenitors. Development. 140 (12), 2619-2631 (2013).
  21. Wohl, S. G., Reh, T. A. miR-124-9-9* potentiates Ascl1-induced reprogramming of cultured Muller glia. Glia. 64 (5), 743-762 (2016).
  22. Ueki, Y., et al. Transgenic expression of the proneural transcription factor Ascl1 in Müller glia stimulates retinal regeneration in young mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (44), 13717-13722 (2015).
  23. Ueki, Y., et al. P53 is required for the developmental restriction in Müller glial proliferation in mouse retina. Glia. 60 (10), 1579-1589 (2012).
  24. Wohl, S. G., Reh, T. A. The microRNA expression profile of mouse Muller glia in vivo and in vitro. Scientific Reports. 6, 35423(2016).
  25. Zuzic, M., Rojo Arias, J. E., Wohl, S. G., Busskamp, V. Retinal miRNA functions in health and disease. Genes (Basel). 10 (5), 377(2019).
  26. Jorstad, N. L., et al. Stimulation of functional neuronal regeneration from Muller glia in adult mice. Nature. 548 (7665), 103-107 (2017).
  27. Wohl, S. G., Hooper, M. J., Reh, T. A. MicroRNAs miR-25, let-7 and miR-124 regulate the neurogenic potential of Muller glia in mice. Development. 146 (17), 179556(2019).
  28. Hauck, S. M., Suppmann, S., Ueffing, M. Proteomic profiling of primary retinal Muller glia cells reveals a shift in expression patterns upon adaptation to in vitro conditions. Glia. 44 (3), 251-263 (2003).
  29. Merl, J., Ueffing, M., Hauck, S. M., von Toerne, C. Direct comparison of MS-based label-free and SILAC quantitative proteome profiling strategies in primary retinal Muller cells. Proteomics. 12 (12), 1902-1911 (2012).
  30. Buchsbaum, I. Y., et al. ECE2 regulates neurogenesis and neuronal migration during human cortical development. EMBO Reports. 21 (5), 48204(2020).
  31. Eliscovich, C., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Imaging mRNA and protein interactions within neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1875-1884 (2017).
  32. Wohl, S. G., Jorstad, N. L., Levine, E. M., Reh, T. A. Muller glial microRNAs are required for the maintenance of glial homeostasis and retinal architecture. Nature Communications. 8 (1), 1603(2017).
  33. Yamamoto, H., Kon, T., Omori, Y., Furukawa, T. Functional and evolutionary diversification of Otx2 and Crx in vertebrate retinal photoreceptor and bipolar cell development. Cell Reports. 30 (3), 658-671 (2020).
  34. Kaufman, M. L., et al. Initiation of Otx2 expression in the developing mouse retina requires a unique enhancer and either Ascl1 or Neurog2 activity. Development. 148 (12), (2021).
  35. Emerson, M. M., Cepko, C. L. Identification of a retina-specific Otx2 enhancer element active in immature developing photoreceptors. Developmental Biology. 360 (1), 241-255 (2011).
  36. Ghinia Tegla, M. G., et al. OTX2 represses sister cell fate choices in the developing retina to promote photoreceptor specification. eLife. 9, 54279(2020).
  37. Brzezinski, J. A. t, Lamba, D. A., Reh, T. A. Blimp1 controls photoreceptor versus bipolar cell fate choice during retinal development. Development. 137 (4), 619-629 (2010).
  38. Brzezinski, J. A. t, Uoon Park, K., Reh, T. A. Blimp1 (Prdm1) prevents re-specification of photoreceptors into retinal bipolar cells by restricting competence. Developmental Biology. 384 (2), 194-204 (2013).
  39. Kim, H. T., et al. Mitochondrial protection by exogenous Otx2 in mouse retinal neurons. Cell Reports. 13 (5), 990-1002 (2015).
  40. Nishida, A., et al. Otx2 homeobox gene controls retinal photoreceptor cell fate and pineal gland development. Nature Neuroscience. 6 (12), 1255-1263 (2003).
  41. Nelson, B. R., et al. Genome-wide analysis of Muller glial differentiation reveals a requirement for Notch signaling in postmitotic cells to maintain the glial fate. PLoS One. 6 (8), 22817(2011).
  42. VandenBosch, L. S., et al. Developmental changes in the accessible chromatin, transcriptome and Ascl1-binding correlate with the loss in Muller Glial regenerative potential. Scientific Reports. 10 (1), 13615(2020).
  43. Clark, B. S., et al. Single-cell RNA-seq analysis of retinal development identifies NFI factors as regulating mitotic exit and late-born cell specification. Neuron. 102 (6), 1111-1126 (2019).
  44. Lewis, G. P., Fisher, S. K. Up-regulation of glial fibrillary acidic protein in response to retinal injury: its potential role in glial remodeling and a comparison to vimentin expression. International Review of Cytology. 230, 263-290 (2003).
  45. Luna, G., Lewis, G. P., Banna, C. D., Skalli, O., Fisher, S. K. Expression profiles of nestin and synemin in reactive astrocytes and Muller cells following retinal injury: a comparison with glial fibrillar acidic protein and vimentin. Molecular Vision. 16, 2511-2523 (2010).
  46. Pogue, A. I., et al. Micro RNA-125b (miRNA-125b) function in astrogliosis and glial cell proliferation. Neuroscience Letters. 476 (1), 18-22 (2010).
  47. Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Friese, T., Witte, O. W., Isenmann, S. In situ dividing and phagocytosing retinal microglia express nestin, vimentin, and NG2 in vivo. PLoS One. 6 (8), 22408(2011).
  48. Takamori, Y., et al. Nestin-positive microglia in adult rat cerebral cortex. Brain Research. 1270, 10-18 (2009).
  49. Alliot, F., Rutin, J., Leenen, P. J., Pessac, B. Pericytes and periendothelial cells of brain parenchyma vessels co-express aminopeptidase N, aminopeptidase A, and nestin. Journal of Neuroscience Research. 58 (3), 367-378 (1999).
  50. Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 26 (5), 613-624 (2006).
  51. Mokry, J., et al. Expression of intermediate filament nestin in blood vessels of neural and non-neural tissues. Acta Medica (Hradec Kralove). 51 (3), 173-179 (2008).
  52. Suzuki, S., Namiki, J., Shibata, S., Mastuzaki, Y., Okano, H. The neural stem/progenitor cell marker nestin is expressed in proliferative endothelial cells, but not in mature vasculature. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (8), 721-730 (2010).
  53. Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Isenmann, S. Neurogenic potential of stem/progenitor-like cells in the adult mammalian eye. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (3), 213-242 (2012).
  54. Eberhardt, C., Amann, B., Stangassinger, M., Hauck, S. M., Deeg, C. A. Isolation, characterization and establishment of an equine retinal glial cell line: a prerequisite to investigate the physiological function of Muller cells in the retina. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition (Berlin). 96 (2), 260-269 (2012).
  55. Löffler, K., Schäfer, P., Völkner, M., Holdt, T., Karl, M. O. Age-dependent Müller glia neurogenic competence in the mouse retina). Glia. 63 (10), 1809-1824 (2015).
  56. Schafer, P., Karl, M. O. Prospective purification and characterization of Muller glia in the mouse retina regeneration assay. Glia. 65 (5), 828-847 (2017).

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