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方法文章

检测 Wolbachia wAlbB 菌株在 白纹伊蚊 细胞系

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DOI：

10.3791/63662

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2022年6月1日

 ,  ,  ,  , 
1Guizhou Medical University, 2Guizhou Health Vocational College

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

采用四种方法检测细胞内 Wolbachia，二者相互补充，提高了检测的准确性 Wolbachia 感染 白纹伊蚊衍生的 Aa23 和 Aa23-T 治愈天然 Wolbachia 使用抗生素治疗感染。

摘要

作为一种母系传播的内共生菌，Wolbachia 感染了大部分昆虫种群。近期研究报道了利用转染 Wolbachia 的蚊子成功调控RNA病毒传播的成果。控制病毒的关键策略包括通过胞质不相容性调控宿主繁殖，以及通过免疫预激活和竞争宿主资源来抑制病毒转录。然而，转染 Wolbachia 的蚊子对病毒感染应答的潜在机制仍不清楚。本文提供了一种在体外（in vitro）水平上，于白纹伊蚊（Aedes albopictus，双翅目：蚊科）Aa23细胞中从核酸和蛋白质层面鉴定 Wolbachia 感染的实验方案，以增进对 Wolbachia 与其昆虫载体之间相互作用的理解。通过联合使用聚合酶链式反应（PCR）、定量PCR、蛋白质印迹（western blot）和免疫学分析方法，建立了一种比单一方法更准确的标准形态学检测流程，用于鉴定 Wolbachia 感染细胞。该方法也可应用于其他昆虫分类群中 Wolbachia 感染的检测。

引言

白纹伊蚊Aedes albopictus（Skuse）（双翅目：蚊科）是登革病毒（DENV）在亚洲及其他地区的重要传播媒介1，也是胞内共生菌Wolbachia（wAlbA和wAlbB）的天然宿主，这两种细菌广泛分布于其生殖系和体组织中2,3。源自A. albopictus胚胎的Aa23细胞系 包含至少两种形态不同的细胞类型，均可支持感染4，并可通过抗生素处理清除其原有的Wolbachia感染（Aa23-T）。由于Aa23细胞系仅保留wAlbB，因此是研究宿主-内共生菌相互作用的有用模型4,5,6。

Wolbachia 通过母系遗传，估计感染了 65% 的昆虫物种8,9 和 28% 的蚊子物种10。它可感染多种组织，并与宿主形成密切的共生关系，通常通过操控宿主生殖系统诱导胞质不相容性（CI）11，进而实现种群替换12,13。此类宿主反应已在自然种群的 Drosophila simulans14 以及实验室笼养和田间试验中的 A. aegypti15 中被观察到。Wolbachia 引发的重要非生殖性调控表现为诱导宿主对多种病原体产生抗性，包括登革病毒（DENV）、基孔肯雅病毒（CHIKV）和西尼罗病毒（WNV）16,17，其机制可能涉及共生菌增强的先天免疫系统18,19、Wolbachia 与病毒之间对宿主必需资源的竞争20，以及对宿主抗病毒防御通路的调控21。

本方案已开发用于研究这些潜在机制 Wolbachia诱导的宿主抗病毒反应。它采用四种细胞内检测方法 Wolbachia Aa23细胞的感染。这些方法为细胞内研究提供了坚实的理论基础 Wolbachia 感染其他宿主物种。第一种方法为PCR——一种强大的技术，可对DNA的特定区域进行酶促扩增，而无需使用传统的克隆程序——用于检测 Wolbachia DNA 并确定其存在/缺失情况 Wolbachia 感染22第二种方法测量 Wolbachia 使用定量PCR（qPCR）检测和测量每个PCR循环中产生的产物，其产物量与PCR前模板量成正比，从而实现DNA拷贝数密度的准确定量23. 第三种方法检测细胞内是否存在 Wolbachia 蛋白质，使用蛋白质印迹法（Western blot）——这是一种通过结合电泳的高分离能力、抗体的特异性以及显色酶促反应的灵敏性，来检测复杂混合物中特定蛋白质的最强大工具之一。最后一种方法是免疫荧光检测（IFA），该方法结合了免疫学、生物化学和显微镜技术，用于检测 Wolbachia 表面蛋白（wsp）通过抗原-抗体反应以确认细胞摄取 Wolbachia 并确定其细胞定位。

本文描述了上述四种用于验证细胞中是否存在Wolbachia的方法，可用于检测外源性Wolbachia是否成功转染以及细胞内的Wolbachia是否已被清除。在确定细胞中是否存在Wolbachia后，可进行多种不同类型的分析，包括基因组学、蛋白质组学或代谢组学。本方案以Aa23细胞为例演示Wolbachia的检测，但也适用于其他细胞。

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方案

1. 材料与试剂

  1. 使用无热原的溶液和培养基进行细胞培养（参见材料表）。
  2. 使用超纯水配制所有溶液。
  3. 选择用于细胞培养的胎牛血清（FBS）时需谨慎，并遵循批次验证流程。
    注意：由于FBS批次会定期更换，本实验方案中无法提供相应的目录号和批次号。
  4. 选择源自A. albopictus卵的Aa23细胞株，对应无Wolbachia的Aa23-T。

2. 细胞培养

  1. 用含有10%胎牛血清的Schneider's培养基4 mL准备25 cm2细胞培养瓶。
  2. 将培养瓶在28 °C、5% CO2的环境中孵育5至7天7,24。
  3. 在100倍放大下通过光学显微镜观察培养瓶中未经染色的Aa23和Aa23-T细胞（图1）。

3. DNA 提取

  1. 将细胞培养 5-7 天，直至每瓶细胞汇合度达到 70-80%（步骤 2）。通过移液枪吸取 1 mL 重悬的培养基，于微型离心机中以 100 × g 离心 5 分钟，收集细胞。
  2. 通过抽吸去除上清液，并将所得细胞沉淀在 -20 °C 下保存。
  3. 将沉淀重悬于 0.40 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中，取 50 µL 溶液加入微型离心管，加入 5 µL 蛋白酶 K（20 mg/mL），在 55 °C 下孵育 1 小时。最后，将这些离心管在 99 °C 下加热 15 分钟以获得粗制 DNA，并在 -20 °C 下保存。

4. 检测 Wolbachia 核酸

  1. PCR 分析
    1. 在总体积为 20 µL 的反应体系中进行 PCR，其中包含 8 µL ddH2O、10 µL Taq 聚合酶（见材料表）、1 µL DNA 模板（来自步骤 3）以及 0.5 µL 正向和反向引物（10 µM）：wsp81F（5' TGG TCC AAT AAG TGATGA AGAAAC 3'）和 wsp691R（5' AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA 3'）25。
    2. 采用以下 PCR 条件：95 °C 预变性 5 分钟，随后进行 35 个循环的 94 °C 变性、55 °C 退火和 72 °C 延伸；最后在 72 °C 下终延伸 7 分钟。
    3. 使用凝胶成像系统在 1% 琼脂糖凝胶（PBS 中含 1% w/v 琼脂糖）上检测 DNA。
  2. qPCR 分析
    1. 使用 wsp 引物 183F（5' AAGGAACCGAAGTTCATG 3'）和 QBrevR（5' AGTTGAGAGTAAAGTCCC 3'）22，对提取的 DNA（步骤 3）中的三个生物学重复（n = 6）进行 Wolbachia 基因组拷贝数分析，并以核糖体蛋白 S6（RPS6）的正向和反向引物（分别为 5' GAAGTTGAACGTATCGTTTC 3' 和 5' GAGATGGTCAGCGGTGATTT 3'）3 进行归一化处理。
    2. 构建 wAlbB 和 RPS6 的标准曲线。
      1. 从含有 wsp 和 rps6 基因片段的 PMD-18T（一种用于高效克隆 PCR 产物的特殊载体，即 TA 克隆）重组质粒（补充文件）中提取 DNA，测定质粒 DNA 浓度（见材料表）。
      2. 使用公式（1）将质粒 DNA 浓度转换为拷贝数浓度。
        质粒拷贝数 = DNA 定量方程；质粒浓度转分子数公式；用于教学 （1）
      3. 用超纯水将质粒拷贝数稀释至 101 到 108，每个浓度梯度设置 3 个重复。
      4. 使用 TB Green 和实时 PCR 系统（见材料表）进行 qPCR 扩增，记录每次反应的结果。使用 Ct 值建立标准曲线。qPCR 反应总体积为 20 µL，包含 7 µL ddH2O、10.4 µL TB Green（见材料表）、1 µL DNA 模板（来自步骤 3）以及 0.8 µL 正向和反向引物（10 µM）。反应条件如下：95 °C 预变性 5 分钟，随后进行 40 个循环的 95 °C 变性 10 秒和 60 °C 退火 35 秒。
      5. 根据建立的标准曲线计算细胞中 WSP 和 RPS6 基因的拷贝数，并通过 wsp/RPS6 拷贝数比值计算 Wolbachia 的相对密度。使用独立样本 t-检验分析数据。
  3. Wolbachia 蛋白的 Western 印迹分析
    1. 蛋白提取
      1. 从六孔板（来自步骤 2）中收集 2 × 107 个 Aa23 和 Aa23-T 细胞至微量离心管中，用 PBS 洗涤三次，4 °C 下以 100 × g 离心 5 分钟。
      2. 用 RIPA 裂解缓冲液（50 mM Tris（pH 7.4）、150 mM NaCl、1% Triton X-100、1% 脱氧胆酸钠、0.1% 十二烷基硫酸钠 [SDS]、2 mM 焦磷酸钠、25 mM β-甘油磷酸、1 mM EDTA、1 mM Na3VO4、0.5 µg/mL 亮抑酶肽）和 PMSF（终浓度 1 mM）制备 1 mL 裂解液。
      3. 向细胞沉淀中加入 200 µL 裂解缓冲液，冰上孵育 30 分钟。4 °C 下以 12,000 × g 离心 10 分钟，弃去上清液。
    2. 按照制造商说明书，使用二喹啉甲酸（BCA）蛋白检测试剂盒（见材料表）测定上清液中 wsp 蛋白的浓度。
    3. 将等量蛋白上样至 15% SDS-PAGE 凝胶 [10% 蒸馏水；50%（30% Acr-Bis（29:1）、38% 1 M Tris，pH 8.8）；1%（10% SDS）、1%（10% 过硫酸铵）、0.04% TEMED]。
    4. 将蛋白转移至硝酸纤维素膜，室温下用 5% 脱脂牛奶封闭 2 小时26,27，然后用 TBST（1 L TBS 中含 1 mL Tween 20）洗涤三次（见材料表）。
    5. 将膜与 100 µL 抗 wsp 多克隆抗体（实验室自制，见补充文件）在 4 °C 下孵育过夜，该抗体用 5% 脱脂牛奶按 1:12,000 比例稀释。
    6. 用 TBST 洗涤一次抗体三次。
    7. 将膜在摇床上与 100 µL 辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗在室温下孵育 1 小时。
    8. 用 TBST 洗涤膜三次，将化学发光检测试剂盒中的溶液 A（HRP 底物鲁米诺试剂）20 µL 与溶液 B（HRP 底物过氧化物试剂）20 µL 按 1:1 比例混合。同时将整张膜浸入发光液中，使用多功能成像系统观察信号。
  4. Wolbachia 蛋白的免疫荧光定位
    1. 将 5 × 105 个 Aa23 和 Aa23-T 细胞接种于底部厚度为 0.17 mm 的激光共聚焦培养皿中，在 28 °C、5% CO2 条件下孵育 3 至 4 天7,24。待细胞融合度达到 60%–70% 后，用 PBS 洗涤三次。
    2. 在 4 °C 下用 1 mL 含 4%（w/v）多聚甲醛的 PBS 固定细胞 20 分钟。
    3. 用 PBST（PBS 中含 0.2% v/v Triton X-100）洗涤固定后的细胞 5 分钟，再用 PBS 洗涤两次。
    4. 将载玻片置于 1 mL 含 3%（w/v）牛血清白蛋白的 PBS 中，37 °C 孵育 1 小时。
    5. 将载玻片置于湿盒（可保持湿度并防止液体蒸发）中，与 100 µL 小鼠抗 wsp 多克隆抗体（实验室自制）和小鼠血清（PBS 中 1:1,000 稀释）在 4 °C 下孵育过夜。
    6. 从湿盒中取出载玻片并恢复至室温，用 PBS 洗涤三次并吸除 PBS。
      注意：自步骤 4.4.7 起，所有操作均需避光。
    7. 将载玻片与 100 µL Alexa Fluor 488 标记的山羊抗小鼠抗体（PBS 中 1:2,000 稀释）在 37 °C 下孵育 30 分钟。
    8. 将样本载玻片与 50 µL DAPI（用 PBS 稀释至 10 µg/mL，可强结合 DNA）在 37 °C 下孵育 5 分钟，然后用 PBS 洗涤三次。
    9. 在共聚焦显微镜下观察免疫染色结果。
      1. 打开电源和激光器。
      2. 打开显微镜的普通灯和汞灯。
      3. 启动系统并运行操作软件。在样本载玻片上滴加一滴杉木油，将载玻片置于显微镜载物台上，并移动载物台至合适位置。
      4. 在软件中点击汞灯观察按钮，打开汞灯快门，通过倒置显微镜观察样本并调焦。
      5. 使用手动控制面板选择绿色和蓝色荧光，在 100 倍放大倍数下拍摄荧光图像。
      6. 关闭汞灯观察按钮，开始采集图像。
      7. 为确保良好的图像质量，先以扫描尺寸（512 像素 × 512 像素）进行预扫描。调整扫描尺寸以获得清晰图像（1,024 像素 × 1,024 像素）。
      8. 若背景噪声过高，进行降噪处理。
      9. 停止扫描并保存图像。
      10. 关闭汞灯和激光器。
      11. 用 75% 酒精擦拭物镜，并将物镜降至最低位置。
      12. 关闭快门和显微镜电源。
      13. 待仪器冷却后，盖上防尘罩。

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结果

之前 Wolbachia 检测到后，在光学显微镜下观察 Aa23 和 Aa23-T 细胞，以确定两种细胞系之间是否存在形态学差异。Aa23 和 Aa23-T 细胞均表现出至少两种细胞形态，但两种细胞类型之间无明显形态学差异。 (图1)在此，使用 Aa23 细胞作为模型系统进行检测 Wolbachia 使用四种方法进行感染检测。阳性扩增的 Wolbachiawsp 使用诊断性引物检测基因 81F/691R 在Aa23细胞（泳道1和2）中是可能的，但在Aa23-T细胞（泳道3和4）中则不可能 (图 2A)分析 Wolbachia 使用qPCR检测细胞系中的密度显示 wsp/rps6 Aa23细胞中比值为2.4，但无 Wolbachia 在 Aa23-T 细胞中（图2B）。对...

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讨论

检测细胞内Wolbachia感染对于研究Wolbachia与宿主的相互作用以及确认将新菌株成功转染至细胞至关重要。在本方案中，采用了四种方法，在核酸和蛋白质水平上成功检测了细胞内Wolbachia感染。这四种实验方法相互验证，提高了Wolbachia细胞感染检测的准确性。

采用 PCR 在核酸水平上检测细胞中 Wolbachia 感染的存在。然而，由于 PCR 无法定量感染水平28,29，因此使用 qPCR 对 DNA 拷贝密度进行定量28,30。由于 PCR 方法的准确性可能受到扩增效率低和假阳性结果的影响，因此确保 DNA 的高质量尤为重要，特别是在 qPCR 检测中，试剂和模板必须置于冰上以防止变性，并应按照标准方法进行操作。扩增效率低通常由反应体系中试剂...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢来自明尼苏达大学的 Xin-Ru Wang 博士提供的深刻建议与指导。本工作由国家自然科学基金（编号：81760374）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
显微镜ZeissSteREO Discovery V8
培养皿Fisher ScientificFB0875713
移液器PipetmanF167380P10
inSituX 平台
分析软件自主开发
铈掺杂钇铝石榴石MSE SuppliesCe:Y3Al5O12, YAG 单晶基片
芯片夹具自主开发
控制软件自主开发
浸油Cargille Laboratories16482A型低粘度 150 cSt
inSituX 平台自主开发
红外光源 Thorlabs IncorporatedLED1085L带玻璃透镜的 LED，1085 nm，5 mW，TO-18
外环 自主开发
泵浦激光器 Thorlabs IncorporatedLD785-SE400785 nm，400 mW，Ø9 mm，E 引脚编码，激光二极管
Raspberry PiRaspberry Pi Foundation
卡环Thorlabs IncorporatedSM1RR用于 Ø1" 镜筒和镜座的 SM1 卡环
无籽石英晶体University Wafers, Inc.U01-W2-L-190514直径 25.4 mm，Z 切，厚度 0.05 mm，双面抛光，-X 轴方向偏移 8 mm
垫片自主开发
X 射线光束挡板自主开发

参考文献

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