检测 Wolbachia wAlbB 菌株在 白纹伊蚊 细胞系

摘要

采用四种方法检测细胞内 Wolbachia，二者相互补充，提高了检测的准确性 Wolbachia 感染 白纹伊蚊衍生的 Aa23 和 Aa23-T 治愈天然 Wolbachia 使用抗生素治疗感染。

摘要

作为一种母系传播的内共生菌，Wolbachia 感染了大部分昆虫种群。近期研究报道了利用转染 Wolbachia 的蚊子成功调控RNA病毒传播的成果。控制病毒的关键策略包括通过胞质不相容性调控宿主繁殖，以及通过免疫预激活和竞争宿主资源来抑制病毒转录。然而，转染 Wolbachia 的蚊子对病毒感染应答的潜在机制仍不清楚。本文提供了一种在体外（in vitro）水平上，于白纹伊蚊（Aedes albopictus，双翅目：蚊科）Aa23细胞中从核酸和蛋白质层面鉴定 Wolbachia 感染的实验方案，以增进对 Wolbachia 与其昆虫载体之间相互作用的理解。通过联合使用聚合酶链式反应（PCR）、定量PCR、蛋白质印迹（western blot）和免疫学分析方法，建立了一种比单一方法更准确的标准形态学检测流程，用于鉴定 Wolbachia 感染细胞。该方法也可应用于其他昆虫分类群中 Wolbachia 感染的检测。

引言

白纹伊蚊Aedes albopictus（Skuse）（双翅目：蚊科）是登革病毒（DENV）在亚洲及其他地区的重要传播媒介¹，也是胞内共生菌Wolbachia（wAlbA和wAlbB）的天然宿主，这两种细菌广泛分布于其生殖系和体组织中^2,3。源自A. albopictus胚胎的Aa23细胞系 包含至少两种形态不同的细胞类型，均可支持感染⁴，并可通过抗生素处理清除其原有的Wolbachia感染（Aa23-T）。由于Aa23细胞系仅保留wAlbB，因此是研究宿主-内共生菌相互作用的有用模型^4,5,6。

Wolbachia 通过母系遗传，估计感染了 65% 的昆虫物种^8,9 和 28% 的蚊子物种

方案

1. 材料与试剂

1. 使用无热原的溶液和培养基进行细胞培养（参见材料表）。
2. 使用超纯水配制所有溶液。
3. 选择用于细胞培养的胎牛血清（FBS）时需谨慎，并遵循批次验证流程。
   注意：由于FBS批次会定期更换，本实验方案中无法提供相应的目录号和批次号。
4. 选择源自A. albopictus卵的Aa23细胞株，对应无Wolbachia的Aa23-T。

2. 细胞培养

1. 用含有10%胎牛血清的Schneider's培养基4 mL准备25 cm²细胞培养瓶。
2. 将培养瓶在28 °C、5% CO₂的环境中孵育5至7天^7,24。
3. 在100倍放大下通过光学显微镜观察培养瓶中未经染色的Aa23和Aa23-T细胞（图1）。

3. DNA 提取

1. 将细胞培养 5-7....

结果

之前 Wolbachia 检测到后，在光学显微镜下观察 Aa23 和 Aa23-T 细胞，以确定两种细胞系之间是否存在形态学差异。Aa23 和 Aa23-T 细胞均表现出至少两种细胞形态，但两种细胞类型之间无明显形态学差异。 (图1)在此，使用 Aa23 细胞作为模型系统进行检测 Wolbachia 使用四种方法进行感染检测。阳性扩增的 Wolbachiawsp 使用诊断性引物检测基因 81F/691R 在Aa23细胞（泳道1和2）中是可能的，但在Aa23-T细胞（泳道3和4）中则不可能 (图 2A)分析 Wolbachia 使用qPCR检测细胞系中的密度显示 wsp/rps6 Aa23细胞中比值为2.4，但无 Wolbachia 在 Aa23-T 细胞中（图2B）。对.......

讨论

检测细胞内Wolbachia感染对于研究Wolbachia与宿主的相互作用以及确认将新菌株成功转染至细胞至关重要。在本方案中，采用了四种方法，在核酸和蛋白质水平上成功检测了细胞内Wolbachia感染。这四种实验方法相互验证，提高了Wolbachia细胞感染检测的准确性。

采用 PCR 在核酸水平上检测细胞中 Wolbachia 感染的存在。然而，由于 PCR 无法定量感染水平^28,29，因此使用 qPCR 对 DNA 拷贝密度进行定量^28,30。由于 PCR 方法的准确性可能受到扩增效率低和假阳性结果的影响，因此确保 DNA 的高质量尤为重要，特别是在 qPCR 检测中，试剂和模板必须置于冰上以防止变性，并应按照标准方法进行操作。扩增效率低通常由反应体系中试剂.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
显微镜	Zeiss		SteREO Discovery V8
培养皿	Fisher Scientific	FB0875713
移液器	Pipetman	F167380	P10
inSituX 平台
分析软件	自主开发
铈掺杂钇铝石榴石	MSE Supplies		Ce:Y3Al5O12, YAG 单晶基片
芯片夹具	自主开发
控制软件	自主开发
浸油	Cargille Laboratories	16482	A型低粘度 150 cSt
inSituX 平台	自主开发
红外光源	Thorlabs Incorporated	LED1085L	带玻璃透镜的 LED，1085 nm，5 mW，TO-18
外环	自主开发
泵浦激光器	Thorlabs Incorporated	LD785-SE400	785 nm，400 mW，Ø9 mm，E 引脚编码，激光二极管
Raspberry Pi	Raspberry Pi Foundation
卡环	Thorlabs Incorporated	SM1RR	用于 Ø1" 镜筒和镜座的 SM1 卡环
无籽石英晶体	University Wafers, Inc.	U01-W2-L-190514	直径 25.4 mm，Z 切，厚度 0.05 mm，双面抛光，-X 轴方向偏移 8 mm
垫片	自主开发
X 射线光束挡板	自主开发