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方法文章

高分辨率中子谱学研究蛋白质及水合水的皮秒至纳秒动力学

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DOI：

10.3791/63664

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2022年4月28日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institut für Angewandte Physik, Universität Tübingen, 2Institut Max von Laue - Paul Langevin (ILL), 3Institut de Biologie Structurale, Université Grenoble Alpes, 4Institut Européen de Chimie et Biologie, Bordeaux INP, Chimie et Biologie des Membranes et des Nanoobjets (CBMN), Université de Bordeaux

本文内容

摘要

中子背散射谱学提供了一种无损且无需标记的方法，用于研究蛋白质及其水合水在皮秒至纳秒时间尺度上的动力学行为。本文通过两项关于淀粉样蛋白的研究展示了该方法的工作流程：一是溶菌酶在聚集过程中时间分辨的动力学研究，二是tau蛋白在形成纤维时其水合水动力学的研究。

摘要

中子散射能够在无需除氘以外的标记、且非破坏性的条件下，以较宽的能量范围探测样品内部的动力学过程。特别是，中子背散射谱学可同时记录多个散射角的散射信号，非常适用于研究生物体系在皮秒至纳秒时间尺度上的动力学行为。通过使用D2O以及可能的氘代缓冲液组分，该方法能够同时监测液态下蛋白质的质心扩散以及主链和侧链运动（内部动力学）。

此外，通过使用经全氘代并以H2O水合的蛋白质粉末，可研究水合水的动力学。本文介绍了在位于法国劳厄-朗之万研究所（ILL）的IN16B仪器上用于研究蛋白质及水合水动力学的工作流程。文中阐述了利用蒸气交换法制备溶液样品和水合蛋白质粉末样品的方法，并针对中子背散射谱仪可获得的不同类型数据集（准弹性谱或固定窗口扫描），描述了蛋白质和水合水动力学的数据分析流程。

该方法通过两项涉及淀粉样蛋白的研究加以说明。溶菌酶聚集形成微米级球形聚集体（称为颗粒物）的过程被证实，在IN16B所探测的空间和时间尺度范围内，该过程以单步方式进行，同时其内部动力学保持不变。 µ微米级球形聚集体（称为颗粒物）在IN16B探测的空间和时间范围内表现为一步形成过程，同时其内部动力学保持不变。此外，利用全氘代蛋白的水合粉末样品研究了tau蛋白水合水的动力学，结果显示水的平动运动在淀粉样纤维形成时被激活。最后，讨论了实验方案中的关键步骤，并阐述了中子散射在研究动力学方面相对于其他实验生物物理方法所处的地位。

引言

中子是一种不带电且具有质量的粒子，多年来已成功用于从基础物理学到生物学等多个领域的样品探测1在生物学应用中，小角中子散射、非弹性中子散射、中子晶体学和中子反射测量被广泛使用2,3,4非弹性中子散射能够提供无需特定标记的、对动力学过程的系综平均测量, 且信号质量不依赖于分子大小或蛋白质5. 可使用高度复杂的环境来测量目标蛋白，该环境可模拟细胞内介质，例如氘代细菌裂解物，甚至 体内3,6,7. 可采用不同的实验装置来研究动力学过程，即：i) 飞行时间法——可探测亚皮秒至皮秒量级的动力学；ii) 背散射法——可探测皮秒至纳秒量级的动力学；iii) 自旋回波法——可探测纳秒至数百纳秒量级的动力学。中子背散射利用布拉格定律 2d sinθ = nλ，其中 d 表示晶体中晶面之间的距离， θ 散射角，n 为散射级次，以及 λ 波长。利用晶体将信号背散射至探测器，可实现较高的能量分辨率，通常约为 ~0.8 µeV. 为了测量能量交换，可使用带有背散射晶体的多普勒驱动装置来定义和调节入射中子波长8,9,10 (图1，或者可以使用飞行时间装置，但会降低能量分辨率11.

figure-introduction-1
图 1：带有多普勒驱动器的中子背散射谱仪示意图。 入射束流首先到达相空间转换（PST）斩波器42，该装置可提高样品位置处的中子通量。随后，多普勒驱动器将中子束流反射至样品，并选择特定能量 E1 （图中以青色箭头表示）。中子随后被样品散射（不同能量以不同颜色箭头表示），而由 Si 111 晶体制成的分析器仅反射具有特定能量 E0 的中子（此处以红色箭头表示）。因此，通过探测器阵列上中子的探测位置可获得动量转移 q，而能量转移则由 E1 - E0 的差值得到。利用 PST 产生的中子脉冲的预期飞行时间，可排除直接散射至探测管的中子信号。缩写：PST = 相空间转换。 请点击此处查看此图的放大版本。

对于背散射光谱学，来自富含氢质子的样品（如蛋白质）的信号主要来源于非相干散射，其散射强度 Sinc(q, ω) 由公式（1）给出12

figure-introduction-2 （1）

其中，σinc 为所考虑元素的非相干散射截面，k' 为散射波矢的模，k 为入射波矢的模，q （= k - k'）为动量转移，rj(t) 为原子 j 在时间 t 时的位置矢量， ω 为入射中子与系统之间能量转移对应的频率。角括号表示系综平均。因此，非相干散射探测的是原子位置随时间变化的系综平均单粒子自关联，反映系统中所有原子及不同时间起点下的自动力学行为（系综平均）。散射函数是中间散射函数 I(q, t) 在时间上的傅里叶变换，而中间散射函数可视为由公式（2）给出的范霍夫关联函数在空间上的傅里叶变换：

figure-introduction-3 （2）

其中，ρ(r,t) 表示在位置 r 和时间 t 找到一个原子的概率密度13。

对于费克型扩散过程，自扩散函数的结果（见公式（3））经过双重傅里叶变换后，得到一个散射函数，该函数为洛伦兹线型，其线宽由 γ = Dq2 给出。

figure-introduction-4 （3）

随后开发了更为复杂的模型，并被证明具有实用价值，例如Singwi和Sjölander提出的用于描述蛋白质内部ps-ns尺度动力学的跳跃扩散模型14，以及Sears提出的用于水合水的旋转模型15,16,17。

在中子背散射（NBS）仪器 IN16B 上8,9 在法国格勒诺布尔的ILL（补充图 S1），一种常用于蛋白质研究的设置是使用Si 111晶体作为分析器，并配备多普勒驱动装置以调节入射波长（补充图 S2A），从而获得约0.2的动量转移范围 Å-1 < q < ~2 Å-1 以及能量转移范围为 -30 µeV < figure-introduction-5 < 30 µeV- 对应于从几皮秒到几纳秒的时间尺度和几纳米的距离 Å此外，IN16B 提供了进行弹性与非弹性固定窗口扫描（E/IFWS）的可能性。10，包括在固定能量转移下进行数据采集。由于中子实验中的通量有限，E/IFWS 可以针对某一能量转移最大化通量，从而减少获得满意信噪比所需的数据采集时间。一种较新的选择是反冲散射与飞行时间谱仪（BATS）模式11，可实现多种能量转移的测量（例如，-150 µeV < figure-introduction-6 < 150 µeV），通量高于多普勒驱动，但代价是能量分辨率较低（补充图 S2B).

中子散射的一个重要特性是，氢的非相干散射截面 σinc比氘高出约40倍，而对于生物样品中常见的其他元素则可忽略不计。因此，可通过使用氘代缓冲液来研究蛋白质在液态环境中的动力学行为；而粉末状态则可用于研究氢化蛋白质粉末在D2O水合条件下的蛋白质内部动力学，或全氘代蛋白质粉末在H2O水合条件下的水合水动力学。在液态体系中，中子背散射通常可同时探测蛋白质的质心自扩散（符合菲克定律的扩散）及其内部动力学。后者通常指主链和侧链的运动，可用所谓的跳跃扩散模型或其他模型进行描述3,18。在氢化蛋白质粉末中，蛋白质的扩散过程不存在，只需对内部动力学进行建模。对于水合水而言，水分子的平动和转动运动对动量转移q的依赖关系不同，因此可在数据分析过程中加以区分17。

本文通过研究一类能够去折叠、聚集形成由β折叠链堆叠而成的典型结构——即所谓的交叉-β结构19,20——并形成细长纤维的蛋白质，展示了中子背散射方法的应用。这种聚集过程被称为淀粉样蛋白聚集，因其在阿尔茨海默病或帕金森病等神经退行性疾病中起核心作用而被广泛研究21,22。对淀粉样蛋白的研究还受到其潜在功能作用23,24 或其在新型生物材料开发中具有高度应用前景的推动25。尽管近年来取得了巨大进展21,26，淀粉样蛋白聚集的理化决定因素仍不明确，目前尚无普适性的淀粉样蛋白聚集理论。

淀粉样聚集意味着蛋白质结构和稳定性随时间发生变化，对其研究自然涉及与蛋白质构象稳定性、蛋白质功能及蛋白质能量景观相关的动力学过程27动力学通过最快运动的熵贡献与特定状态的稳定性直接相关28，而蛋白质功能可通过从亚皮秒（适用于光敏蛋白）等多种时间尺度上的运动得以维持29 用于毫秒级的结构域运动，可通过皮秒至纳秒级动力学过程实现30.

将介绍中子背散射谱学在淀粉样蛋白研究中的两个应用实例，一个用于研究液态下蛋白质的动力学，另一个用于研究水合粉末状态下水合水的动力学。第一个实例涉及溶菌酶聚集形成淀粉样纤维的过程 µm 实时追踪的微米级球体（称为颗粒物）5，以及人源蛋白tau在天然状态和聚集状态下的水动力学比较31.

溶菌酶是一种参与免疫防御的酶，由129个氨基酸残基组成。在pD为10.5、温度为90 °C的氘代缓冲液中，溶菌酶可形成聚集体。通过中子散射实验，我们发现溶菌酶质心扩散系数随时间的变化遵循硫黄素T荧光信号的单指数动力学（硫黄素T是一种用于监测淀粉样蛋白交叉-β结构形成的荧光探针32），表明聚集体超结构和交叉-β结构的形成是通过同一速率的单步过程完成的。此外，在整个聚集过程中，蛋白质内部动力学保持不变，这可能归因于构象变化过快而无法在NBS仪器上观测到，或归因于蛋白质在聚集过程中内部能量未发生显著变化。

人类tau蛋白是一种内在无序蛋白（IDP），其所谓的2N4R亚型由441个氨基酸组成，在阿尔茨海默病中具有重要作用33。我们利用完全氘代的tau蛋白粉末进行中子背散射实验，发现纤维态下水合水的动力学增强，发生平移运动的水分子比例更高。该结果表明，水合水熵的增加可能驱动tau蛋白的淀粉样纤维化。

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方案

1. 为液态蛋白质制备氘代缓冲液

  1. 将缓冲液的所有组分溶解于纯 D2O 中。
  2. 若 pH 电极是在 H2O 中校准的，则使用 NaOD 或 DCl34 根据公式 pD = pH + 0.4 调整 pD。
    注意：使用 D2O 而非 H2O 可能会影响蛋白质溶解度，缓冲条件可能需要调整（例如，通过轻微改变盐浓度）。

2. 准备 H2全氘代蛋白质的O-水合粉末

  1. 准备样品架。
    1. 用去离子水和乙醇彻底清洗平底铝制样品架及其铟丝密封圈和螺丝，然后使其自然晾干。
      注意：使用平底样品架可使粉末在表面均匀分布。粉末的用量应足够多，以确保其能被限制在样品架壁内，当样品架垂直放置时不会掉落。
    2. 使用精密天平分别称量样品架的底座、盖子和铟丝的质量。
    3. 将1 mm直径的铟丝密封圈放入样品架底座的凹槽中，两端连接处应留有少量重叠（图2A）。
    4. 取适量冻干蛋白（通常约为100 mg蛋白），使其均匀覆盖样品架底座的内表面。
  2. 水合蛋白粉末。
    1. 将样品架放入干燥器中，并在干燥器内放置一个含有P2O5粉末的培养皿，持续24小时以彻底干燥蛋白粉末35（图2B）。称量含有铟密封圈和干燥粉末的样品架底座部分，得到质量mdry。
      注意：P2O5粉末具有强腐蚀性。
    2. 从干燥器中移除P2O5，换入一个装有D2O的培养皿。定期监测粉末质量，以检测水合程度h = mhyd / mdry，其中mhyd和mdry分别为水合粉末和干燥粉末的质量。
      注意：对于胰岛素等高度疏水的蛋白质，可能需要提高干燥器内的温度以增加水蒸气压，从而达到目标水合水平h。
    3. 重复步骤2.2.1和2.2.2至少三次，以确保所有可交换的氢原子完全被氘代。
      注意：作为替代方法，若蛋白性质允许，可通过多次冻干并溶解于纯D2O中的循环处理，实现更充分的氢/氘交换。
    4. 将粉末水合至略高于目标水平，然后将带有铟丝和水合粉末的样品架底座部分置于精密天平上，等待其质量缓慢下降至目标值，以获得所需的h值（对于中等大小的球状蛋白，通常目标h值为0.2–0.4，对应形成一层完整的水合层）。
    5. 迅速将盖子盖上底座，并先用四个螺丝固定样品架，以终止蒸汽交换（补充图S3A）。
    6. 安装并拧紧所有剩余螺丝，直至底座与盖子之间无可见缝隙（补充图S3B）。
    7. 称量已密封的样品架，以检查中子实验后是否存在因泄漏导致的水合损失。

3. 进行非相干中子散射实验

  1. 在指定的机时前几周，与当地联系人讨论并再次确认实验所需仪器的配置。
  2. 制备液态样品。
    1. 将蛋白质溶解于氘代缓冲液中。
    2. 使用水确定样品 holder 中应加入的合适液体体积（确保关闭样品 holder 时无溢出）； 图2C).
      注意：以下步骤（3.3 和 3.4）描述了在ILL的NBS谱仪IN16B上进行的实验8,9，使用冷冻炉作为样品环境。仪器控制系统会因仪器不同而有所差异，但工作原理保持不变。
  3. 插入样品。
    1. 彻底干燥样本棒（图 2D），并在确认电离辐射剂量低于 100 µSv/h 在处理任何材料之前（在ILL）。
    2. 将样品放置到位，检查其相对于光束中心的居中情况（补充图 S4），并将样品杆插入冷冻炉中（图 2D）。开启真空泵，使真空度达到10以下-3 条，并通过以下操作重复三次以排出冷冻炉内的空气：向冷冻炉中充入氦气直至达到大气压，再使用真空泵将气体抽出。
      注意：若使用平面样品台，样品台必须调整至特定角度 45° 相对于入射光束的角度。由于样品池对中子的吸收和散射，有效动量转移范围可能会减小。可使用强中子吸收材料（如镉）遮蔽样品架的某些部分（例如螺丝、较厚区域）。
    3. 向冷冻炉中通入少量氦气，使压力约为 0.05 bar。
  4. 采集数据（例如，在 ILL 的 IN16B 上使用 NOMAD，假设用户在采集准弹性中子散射（QENS）谱前倾向于将温度设定为 200 K，随后在以 0.5 K/min 的速率升温至 310 K 的过程中采集弹性/非弹性宽谱（E/IFWS），最后在 310 K 下采集 QENS 谱）。
    1. 使用 NOMAD，在该 执行 标签，拖放一个 熔炉恒温器 控制器在 发射台. 设置 温度 到 200 K. 使用 快速 模式和一个 超时 的 30 min 使温度有足够时间稳定。点击 旋转箭头 在后台运行该图标，以便在温度降低期间采集数据。
    2. 拖放 IN16多普勒设置 控制器，设置 速度分布 至 精确速度 设定为 最大 ΔE，一个值为 0.00 µeV 和 128 通道 以获得EFWS构型。
    3. 拖放一个 计数 控制器，填充 字幕 字段名称应便于数据的识别，并进行设置 60 次重复 的 30 s 扫描 (补充图 S5A).
    4. 拖放一个 IN16多普勒设置 控制器，设置 速度分布曲线 到 正弦 设定为 速度 其值为 4.5 m/s 和 2,048 个通道 以获得QENS构型。
    5. 拖放一个 计数 控制器与 4 次重复的 30 分钟扫描 (补充图 S5B).
    6. 对于温度梯度，拖放一个 熔炉-恒冷切片机 控制器，设置 温度 到 310 K，设定 斜坡 到 设定点 与 Δ = 0.05 K 和 6 s. 使用一个 时间到 的 220 分钟 (补充图 S6A).
    7. 使用一个 for 循环 与 65 次重复. 内部插入一个 IN16多普勒设置 控制器操作同步骤 3.4.2，随后进行一次计数 30 s随后，插入 IN16多普勒设置，如先前所述，但使用一种 能量偏移 的 1.5 µeV 和 1,024 个通道 随后进行一次计数 3 分钟 (补充图 S6B).
    8. 为获得310 K下的最后一个QENS，拖放 IN16多普勒设置 和 计数 分别按照步骤 3.4.4 和 3.4.5 中所述配置的控制器。
    9. 按压 开始 单击按钮（窗口底部的直角三角形）以运行脚本。
      注意：每次实验都需要采集校准数据，即用于扣除或吸收校正的空样品池数据、在不同温度下单独测量的缓冲液数据（用于模拟背景），以及钒样品（或等效地，在10 K或更低温度下测量的样品）的测量数据，以获得仪器的分辨率函数。

4. 数据分析 - QENS

  1. 使用 Python 软件 nPDyn v3.x 中的 'IN16B_QENS.process()' 方法导入数据集36
    >>>> 来自 nPDyn.dataParsers 的 IN16B_QENS

    >>> 样品 = IN16B_QENS(
    ...<数据文件路径>
    ... [detGroup= ...格式>]
    ... ).process()

    >>> sample = sample.get_q_range(0.3, 1.8)
  2. 使用以下命令执行数据校正（可选）（有关更多信息，请参见 nPDyn 的文档， 图3):
    #假设已获取空细胞、钒和缓冲液的数据
    # 已在名为 'empty_cell'、'vanadium' 的数据集中导入
    # 和“缓冲液”，分别。

    # 用于带比例因子的空白细胞减除
    #（误差会自动传播）
    >>> 样本 = 样本 - 0.95 × 空细胞

    # 用于校正 Paalman-Ping 系数
    （与上述示例互斥）
    >>> sample = sample.吸收校正(empty_cell)

    # 用于归一化
    >>> 样品 = 样品.用钒归一化

    # 用于沿可观测轴进行分箱
    # 可观察指标为此处的聚集时间
    >>> sample = sample.bin(3, axis=0)
  3. 拟合校准数据。可使用内置模型或用户自定义模型（参见 nPDyn 文档）对数据集样本、空样品池、氘代缓冲液（如需要）和钒进行拟合：
    >>> 来自 nPDyn.models.builtins 的导入（
    ... 模型PVoigt,
    ... modelWater,
    ...模型校准D2O,
    ...     )

    # 内置模型使用动量的列向量
    # 转移 q 值
    >>> q = vanadium.q[:, None]

    # 使用伪沃伊格型轮廓拟合钒元素
    >>> vanadium.拟合(modelPVoigt(q))
  4. 使用名为 'modelWater' 的内置水合水模型。该模型的读取方式如公式 (Eq) 所示4)17
    用于数据分析的符号表示散射函数公式 S(q,ω)。 (4)
    何处0，一个r，以及一个t 分别为弹性信号、旋转运动和平移运动相对贡献的标量；j1（qd）是lth 阶球形贝塞尔函数，其中 q 为动量转移；d 为水分子中的 O-H 距离；δ(ω) 是狄拉克δ函数，此处乘以 EISF；N 为所用球形贝塞尔函数的最高阶数（通常约为 5）； 数学表达式：L 下标 (1+1) 乘以 γ 下标 R；方程可视化。 和 李雅普诺夫函数的数学符号，动态系统稳定性分析，方程片段。 分别为洛伦兹转动和移动运动；b(q) 是一个平坦的背景项。球贝塞尔函数给出了水分子各个角动量态的相对贡献，而项数 N 则根据动量转移 q 的范围确定。对于典型的非弹性中子散射谱仪，取至 N = 4 的项已几乎完全可以解释信号补充图 S7).
    # 此处使用公式2计算水合水
    # 与分辨率函数的卷积及加和
    # D2O 背景由仪器自动完成
    # 提供的参数
    >>> sample.fit(modelWater(q),
    ... res=钒,
    … bkgd=缓冲液，
    ... 体积分数_bkgd=0.95
    ... )
    注意：从严格意义上讲，旋转运动和平移运动的贡献应通过卷积方式进行处理。加和性模型之所以成功，应归因于蛋白质表面存在不同的水分子群体，以及可及的能量范围有限。
  5. 使用以下方法绘制数据图4):
    >>> 从 nPDyn.plot 导入 plot
    >>> 绘制样本图

5. 数据分析 - 温度梯度扫描、弹性固定窗口扫描（EFWS）

  1. 采用与第4节类似的方法，通过最低温度（通常为10 K）下的信号对温度 ramp 数据进行归一化处理：
    >>> 从 nPDyn.dataParsers 导入 IN16B_FWS

    >>> 样本 = IN16B_FWS(
    ... <数据文件路径>,
    ... detGroup=[detGroup=]
    ... ).process()

    # 使用可观测部分的前5个点进行归一化
    轴，对应于温度
    >>> 样本 /= 样本[:5].mean(0)

    所用的动量转移 q 范围更小
    # 因所用模型仅在低 q 下有效
    >>> sample = sample.get_q_range(0.2, 0.8)
  2. 使用一个简单的高斯模型开始，其宽度由所谓的均方位移（MSD）给出。使用以下命令构建并拟合该模型：
    >>> import numpy as np
    >>> 来自 nPDyn.models 导入 参数, 模型, 组分

    # a 是一个缩放因子
    >>> 参数 = 参数(
    ... a={'value': 1, 'bounds': (0, np.inf)},
    ... msd={'value': 1, 'bounds': (0, np.inf)}
    ... )

    >>> model = Model(参数)
    >>> model.addComponent(组件(
    … 'gaussian'
    … lambda x, a, msd: a * np.exp(-x ** 2 * msd / 6)
    … ))

    >>> sample.fit(model, x=sample.q[:, None])

    >>> 绘制样本图
    注意：对于 q，高斯近似始终成立2MSD << 1，但样品间的相对比较可采用更宽的动量转移范围。已有超越高斯近似法的更复杂模型被开发出来37,38,39.

6. 数据分析——弹性与非弹性固定窗口扫描（E/IFWS）

  1. 与步骤4类似，导入数据集，但使用“IN16B_FWS”类别：
    >>> 来自 nPDyn.dataParsers 的 IN16B_FWS

    >>> 样本 = IN16B_FWS(
    ...<数据文件路径>
    ... [detGroup=]
    ... ).process()

    >>> sample = sample.get_q_range(0.3, 1.8)
  2. 拟合校准数据和样本数据。
    1. 使用广义均方位移分析 E/IFWS 数据40 或将其视为粗略的QENS谱（在能量轴上仅有少量数据点）。当将E/IFWS视为粗略QENS时，可采用适用于QENS的模型对整个E/IFWS数据集进行全局拟合（同时拟合能量转移和动量转移）。
      注意：此处采用后一种基于模型的QENS方法分析E/IFWS数据，其中引入了质心动量转移依赖性以及蛋白质内部动力学。
    2. 使用以下公式（方程）模拟液体中蛋白质的动力学行为5) （nPDyn 中的 'modelProteinJumpDiff'）
      用于物理研究分析的含变量 S(q,ω)、R(q,ω) 的静力学平衡方程 (5)
      其中 R(q，ω) 是分辨率函数；β 是每个动量转移 q 对应的独立标量； a0 是弹性非相干结构因子（EISF）； 拉格朗日方程公式，用于物理动力学分析的符号，手写风格。 一个洛伦兹函数，用于描述质心扩散，其宽度由公式 (6); 理论物理研究中常用的拉格朗日密度公式的数学符号。 是一个包含质心扩散和遵循跳跃扩散模型贡献的洛伦兹函数14 考虑内部动力学（方程（7); 与平衡常数方程相关的静态平衡符号，βD₂O 和 𝓛D₂O。 来自 D 的拟合信号2O 根据其在样品中的体积分数进行归一化处理。
      γ = Dsq2  (6)
      Ds 自扩散系数。
      衰减速率方程 Γ = Diq²/(1 + Diq²τ)，用于动态光散射分析。 (7)
      Di 表观扩散系数，用于描述内部动力学过程 τ 扩散运动的弛豫时间。
      >>> 来自 nPDyn.models.builtins 的导入（
      ... 模型PVoigt,
      ... 模型蛋白跳跃扩散，
      ...模型校准D2O，
      ... )

      # 内置模型使用动量的列向量
      # 转移 q 值
      >>> q = vanadium.q[:, None]

      # 采用伪沃伊特轮廓拟合钒元素
      >>> vanadium.fit(modelPVoigt(q))

      # 用于纯D2O的、具有校准线宽的模型
      # 不同温度下的数据包含在 nPDyn 中
      >>> buffer.fit(模型校准D2O(q, 温度=363))

      # 此处对液体样品使用公式3
      # 与分辨率函数的卷积及加和
      # D2O 背景校正将使用提供的参数自动完成
      >>> sample.fit(模型蛋白跳跃扩散(q),
      ... 结果=钒,
      … bkgd=缓冲液，
      ... 体积分数_bkgd=0.95
      ... )
  3. 使用以下方法绘制拟合后的数据：
    >>> 从 nPDyn.plot 导入 plot
    >>> 绘制样本图

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结果

在90 °C条件下，将溶菌酶在氘代缓冲液（pD 10.5的0.1 M NaCl）中以50 mg/mL的蛋白浓度孵育，使其聚集形成颗粒物。颗粒物的形成由温度升至90 °C触发，并在6小时内完成（补充图S8）。数据采集在IN16B仪器上进行，具体方法如上文方案所述（数据由ILL长期保存，可通过 http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04-811访问）。

在 7 °C 下采集 QENS 谱以充分表征初始状态。随后将温度升高至 90 °C（在 IN16B 上通常需要约 30 分钟，补充图 S9）以触发聚集过程。可通过 QENS 谱的滑动平均来追踪动力学过程，从而获得完整的能量转移范围，但在时间分辨率上受限。使用 EFWS 可将时间分辨率提高至约 1 分钟，使用 E/IFWS 在四个能量转移值下可提高至约 20 分钟5。

在本示例中，我们研究了 0、0.6、1.5 和 3 µe...

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讨论

中子谱学是唯一一种可在使用氘代的情况下，不受蛋白质大小或溶液复杂性限制，探测蛋白质样品在皮秒至纳秒时间尺度上系综平均动力学的方法6。具体而言，通过探测溶液中蛋白质组装体的自扩散行为，可明确测定此类组装体的流体动力学尺寸。然而，该方法通常受限于中子通量较低，这意味着需要较长的采集时间，并且在分配的束流时间内获得良好信噪比通常需要大量样品（通常为100 mg蛋白质）。

样品制备（实验方案步骤1和2）。对于液态样品，可使用的最低浓度约为50 mg/mL（浓度较低时也可使用，但会延长采集时间）。高蛋白浓度与较快的纤维化速率相关，这有助于在分配的束流时间内完成测量，但也可能影响聚集途径44。因此，必须结合原子力显微镜或电子显微镜等互补方法对样品进行充分表征。

在制备样品时，样品架的材料也是一个需要考虑的问题，因为铝合金容易发生腐蚀45。一种具有较好耐腐蚀性且中子...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢德国加兴海因茨·迈尔-莱布尼茨中心（Heinz Maier-Leibnitz Zentrum）于利希中子科学中心（Jülich Centre for Neutron Science）的 Michaela Zamponi，其参与了在 SPHERES 仪器上进行的部分中子散射实验。本研究受益于欧盟资助合同 HPRI-2001-50065 和 RII3-CT-2003-505925 支持下的氘化实验室（Deuteration Laboratory, DLAB）联盟的相关工作，同时也受益于英国工程与物理科学研究委员会（EPSRC）资助、在劳厄-朗之万研究所（Institut Laue Langevin）与欧洲分子生物学实验室（EMBL）联合 DLAB 框架下开展的研究（资助编号 GR/R99393/01 和 EP/C015452/1）。特此致谢欧洲委员会第七框架计划下“加强欧洲研究区，研究基础设施”重点行动所提供的支持 [合同编号 226507 (NMI3)]。Kevin Pounot 和 Christian Beck 感谢德国联邦教育与研究部（BMBF，资助编号 05K19VTB）对其博士后奖学金的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
铝制样品架无商业供应。可由仪器本地联系人提供，或根据本地联系人提供的技术图纸自行加工制造。
氯化氘，D2O 中 35 wt. %，≥99 atom % DSigma-Aldrich
543047
氧化氘（D，99.9%）EurisotopDLM-4DR-PK
道康宁高真空硅脂Sigma-AldrichZ273554-1EA
乙醇 96%，EMSURE Reag. Ph EurSigma-Aldrich1.5901
玻璃干燥器VWR  75871-660
玻璃干燥器托盘，140 mmVWR89038-068
铟丝，直径 1.0 mm（0.04 in），Puratronic，99.999%Alfa Aesar00470.G1
来自鸡蛋清的溶菌酶，透析后冻干粉末，~100,000 U/mgSigma-Aldrich62970
nPDynv3.x见 github.com/kpounot/nPDyn，软件中也包含用于拟合的模型函数
OHAUS AX324 Adventurer 天平，内置校准Dutscher92641
五氧化二磷，ReagentPlus，99%Sigma-Aldrich214701
ErgoOne 移液器，0.5–10 μLStarlabS7100-0510
ErgoOne 移液器，100–1,000 μLStarlabS7100-1000
ErgoOne 移液器，20–200 μLStarlabS7100-2200
TipOne 吸头，1,000 μLStarlabS1111-6001
TipOne 吸头，10 μLStarlabS1111-3200
TipOne 吸头，200 μLStarlabS1111-0206
氘氧化钠溶液，D2O 中 40 wt. %，99.5 atom % DSigma-Aldrich372072

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