中子背散射谱学提供了一种无损且无需标记的方法，用于研究蛋白质及其水合水在皮秒至纳秒时间尺度上的动力学行为。本文通过两项关于淀粉样蛋白的研究展示了该方法的工作流程：一是溶菌酶在聚集过程中时间分辨的动力学研究，二是tau蛋白在形成纤维时其水合水动力学的研究。
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摘要
摘要
中子散射能够在无需除氘以外的标记、且非破坏性的条件下，以较宽的能量范围探测样品内部的动力学过程。特别是，中子背散射谱学可同时记录多个散射角的散射信号，非常适用于研究生物体系在皮秒至纳秒时间尺度上的动力学行为。通过使用D2O以及可能的氘代缓冲液组分，该方法能够同时监测液态下蛋白质的质心扩散以及主链和侧链运动（内部动力学）。
此外，通过使用经全氘代并以H2O水合的蛋白质粉末，可研究水合水的动力学。本文介绍了在位于法国劳厄-朗之万研究所（ILL）的IN16B仪器上用于研究蛋白质及水合水动力学的工作流程。文中阐述了利用蒸气交换法制备溶液样品和水合蛋白质粉末样品的方法，并针对中子背散射谱仪可获得的不同类型数据集（准弹性谱或固定窗口扫描），描述了蛋白质和水合水动力学的数据分析流程。
该方法通过两项涉及淀粉样蛋白的研究加以说明。溶菌酶聚集形成微米级球形聚集体（称为颗粒物）的过程被证实，在IN16B所探测的空间和时间尺度范围内，该过程以单步方式进行，同时其内部动力学保持不变。 µ微米级球形聚集体（称为颗粒物）在IN16B探测的空间和时间范围内表现为一步形成过程，同时其内部动力学保持不变。此外，利用全氘代蛋白的水合粉末样品研究了tau蛋白水合水的动力学，结果显示水的平动运动在淀粉样纤维形成时被激活。最后，讨论了实验方案中的关键步骤，并阐述了中子散射在研究动力学方面相对于其他实验生物物理方法所处的地位。
引言
中子是一种不带电且具有质量的粒子，多年来已成功用于从基础物理学到生物学等多个领域的样品探测1在生物学应用中，小角中子散射、非弹性中子散射、中子晶体学和中子反射测量被广泛使用2,3,4非弹性中子散射能够提供无需特定标记的、对动力学过程的系综平均测量, 且信号质量不依赖于分子大小或蛋白质5. 可使用高度复杂的环境来测量目标蛋白，该环境可模拟细胞内介质，例如氘代细菌裂解物，甚至 体内3,6,7. 可采用不同的实验装置来研究动力学过程，即：i) 飞行时间法——可探测亚皮秒至皮秒量级的动力学；ii) 背散射法——可探测皮秒至纳秒量级的动力学；iii) 自旋回波法——可探测纳秒至数百纳秒量级的动力学。中子背散射利用布拉格定律 2d sinθ = nλ，其中 d 表示晶体中晶面之间的距离， θ 散射角，n 为散射级次，以及 λ 波长。利用晶体将信号背散射至探测器，可实现较高的能....
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方案
1. 准备用于液态蛋白质的氘代缓冲液
- 将缓冲液的所有组分溶解于纯 D2O 中。
- 若 pH 电极是在 H2O 中校准的，则使用 NaOD 或 DCl34 根据公式 pD = pH + 0.4 调整 pD。
注意：使用 D2O 而非 H2O 可能会影响蛋白质的溶解度，可能需要调整缓冲条件（例如，通过轻微改变盐浓度）。
2. 准备用 H2O 水合的全氘代蛋白质粉末
- 准备样品架。
- 用清水和乙醇彻底清洗平底铝制样品架及其铟丝密封圈和螺丝，然后使其完全干燥。
注意：使用平底样品架可使粉末均匀分布在表面。粉末的量应足够多，能够被样品架壁固定住，在将样品架垂直放置时不会掉落。 - 使用精密天平分别称量样品架的各个部件——底部、盖子和铟丝。
- 将1 mm厚的铟丝密封圈放入样品架底部的凹槽中，两端连接处需留有轻微重叠（图2A）。
- 取适量冻干蛋白（通常约为100 mg蛋白），使其均匀覆盖样品架底部的内表面。
- 用清水和乙醇彻底清洗平底铝制样品架及其铟丝密封圈和螺丝，然后使其完全干燥。
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结果
在90 °C条件下，将溶菌酶在氘代缓冲液（pD 10.5的0.1 M NaCl）中以50 mg/mL的蛋白浓度孵育，使其聚集形成颗粒物。颗粒物的形成由温度升至90 °C触发，并在6小时内完成（补充图S8）。数据采集在IN16B仪器上进行，具体方法如上文方案所述（数据由ILL长期保存，可通过 http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04-811访问）。
在 7 °C 下采集 QENS 谱以充分表征初始状态。随后将温度升高至 90 °C（在 IN16B 上通常需要约 30 分钟，补充图 S9）以触发聚集过程。可通过 QENS 谱的滑动平均来追踪动力学过程，从而获得完整的能量转移范围，但在时间分辨率上受限。使用 EFWS 可将时间分辨率提高至约 1 分钟，使用 E/IFWS 在四个能量转移值下可提高至约 20 分钟5。
在本示例中，我们研究了 0、0.6、1.5 和 3 µe.......
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讨论
中子谱学是唯一一种可在使用氘代的情况下，不受蛋白质大小或溶液复杂性限制，探测蛋白质样品在皮秒至纳秒时间尺度上系综平均动力学的方法6。具体而言，通过探测溶液中蛋白质组装体的自扩散行为，可明确测定此类组装体的流体动力学尺寸。然而，该方法通常受限于中子通量较低，这意味着需要较长的采集时间，并且在分配的束流时间内获得良好信噪比通常需要大量样品（通常为100 mg蛋白质）。
样品制备（实验方案步骤1和2）。对于液态样品，可使用的最低浓度约为50 mg/mL（浓度较低时也可使用，但会延长采集时间）。高蛋白浓度与较快的纤维化速率相关，这有助于在分配的束流时间内完成测量，但也可能影响聚集途径44。因此，必须结合原子力显微镜或电子显微镜等互补方法对样品进行充分表征。
在制备样品时，样品架的材料也是一个需要考虑的问题，因为铝合金容易发生腐蚀45。一种具有较好耐腐蚀性且中子.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢德国加兴海因茨·迈尔-莱布尼茨中心（Heinz Maier-Leibnitz Zentrum）于利希中子科学中心（Jülich Centre for Neutron Science）的 Michaela Zamponi，其参与了在 SPHERES 仪器上进行的部分中子散射实验。本研究受益于欧盟资助合同 HPRI-2001-50065 和 RII3-CT-2003-505925 支持下的氘化实验室（Deuteration Laboratory, DLAB）联盟的相关工作，同时也受益于英国工程与物理科学研究委员会（EPSRC）资助、在劳厄-朗之万研究所（Institut Laue Langevin）与欧洲分子生物学实验室（EMBL）联合 DLAB 框架下开展的研究（资助编号 GR/R99393/01 和 EP/C015452/1）。特此致谢欧洲委员会第七框架计划下“加强欧洲研究区，研究基础设施”重点行动所提供的支持 [合同编号 226507 (NMI3)]。Kevin Pounot 和 Christian Beck 感谢德国联邦教育与研究部（BMBF，资助编号 05K19VTB）对其博士后奖学金的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 铝制样品架 | 无商业供应。可由仪器本地联系人提供，或根据本地联系人提供的技术图纸自行加工制造。 | ||
| 氯化氘，D2O 中 35 wt. %，≥99 atom % D | Sigma-Aldrich | 543047 | |
| 氧化氘（D，99.9%） | Eurisotop | DLM-4DR-PK | |
| 道康宁高真空硅脂 | Sigma-Aldrich | Z273554-1EA | |
| 乙醇 96%，EMSURE Reag. Ph Eur | Sigma-Aldrich | 1.5901 | |
| 玻璃干燥器 | VWR | 75871-660 | |
| 玻璃干燥器托盘，140 mm | VWR | 89038-068 | |
| 铟丝，直径 1.0 mm（0.04 in），Puratronic，99.999% | Alfa Aesar | 00470.G1 | |
| 来自鸡蛋清的溶菌酶，透析后冻干粉末，~100,000 U/mg | Sigma-Aldrich | 62970 | |
| nPDyn | v3.x | 见 github.com/kpounot/nPDyn，软件中也包含用于拟合的模型函数 | |
| OHAUS AX324 Adventurer 天平，内置校准 | Dutscher | 92641 | |
| 五氧化二磷，ReagentPlus，99% | Sigma-Aldrich | 214701 | |
| ErgoOne 移液器，0.5–10 μL | Starlab | S7100-0510 | |
| ErgoOne 移液器，100–1,000 μL | Starlab | S7100-1000 | |
| ErgoOne 移液器，20–200 μL | Starlab | S7100-2200 | |
| TipOne 吸头，1,000 μL | Starlab | S1111-6001 | |
| TipOne 吸头，10 μL | Starlab | S1111-3200 | |
| TipOne 吸头，200 μL | Starlab | S1111-0206 | |
| 氘氧化钠溶液，D2O 中 40 wt. %，99.5 atom % D | Sigma-Aldrich | 372072 |
参考文献
- Jacrot, B. Des neutrons pour la science: Histoire de l'Institut Laue-Langevin. Des neutrons pour la science. EDP Sciences. , (2021).
- Mahieu, E., Gabel, F. Biological small-angle neutron scattering: recent results and development. A....
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重印与许可
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