方法文章

大鼠背部机械敏感性评估用于慢性背痛机制研究

DOI：

10.3791/63667

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2022年8月30日

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1Department of Anatomy, Université du Québec à Trois-Rivières, 2CogNAC Research Group, Université du Québec à Trois-Rivières, 3Division of Physiology, Department of Basic Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, University of Tabriz

本文内容

摘要

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为了开发用于预防和治疗背痛的新型治疗干预措施，需要借助动物模型从转化医学的角度来研究这些疗法的作用机制和有效性。本方案描述了BMS测试，即一种用于评估大鼠背部机械敏感性的标准化方法。

摘要

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腰痛是全球致残的首要原因，给个人、经济和社会带来巨大影响。为了开发新的治疗方法，需要借助动物模型从转化医学的角度研究新疗法的作用机制和有效性。目前的研究中使用了多种啮齿类动物腰痛模型。然而令人意外的是，尚无经过验证的标准化行为学测试可用于评估腰痛模型的机械敏感性。这一点至关重要，因为需要确认假定患有腰痛的动物是否对伤害性刺激表现出局部痛觉过敏，并在旨在缓解腰痛的干预过程中监测其敏感性变化。本研究的目的是建立一种简单且易于实施的测试方法，用于评估大鼠背部的机械敏感性。为此方法专门设计了一个测试笼，其尺寸为长×宽×高：50 × 20 × 7 cm，顶部设有不锈钢网。该测试笼可允许对动物背部施加机械刺激。进行测试前，需剃除动物目标区域的背部毛发，并标记测试区域，以便在不同日期重复测试。使用Von Frey纤维丝通过先前描述的上下法（up-down method）测定机械痛阈值，刺激部位为椎旁肌。阳性反应包括：（1）肌肉抽动，（2）弓背（背部伸展），（3）颈部转动，（4）抓挠或舔舐背部，以及（5）试图逃离。该行为学测试（背部机械敏感性（BMS）测试）对于利用啮齿类动物腰痛模型开展机制研究，以及开发预防和管理腰痛的治疗干预手段具有重要应用价值。

引言

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下背痛（LBP）是全球致残的首要原因，具有显著的个人、经济和社会后果1,2,3,4。每年约有37%的人口受到下背痛的影响5。下背痛通常在数周内自行缓解，但在24%–33%的个体中会复发，并在5%–10%的病例中转为慢性2。为了理解下背痛的机制和影响，以及不同治疗干预的效果，已采用多种动物模型来模拟临床状况或下背痛的某些组成部分6。这些小鼠和大鼠模型可归入以下一个或多个类别：（1）椎间盘源性下背痛7,8,，（2）根性下背痛8,9,10,11，（3）小关节骨关节炎12，以及（4）肌肉源性下背痛

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方案

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实验方案经魁北克大学三河分校动物护理委员会批准，并符合加拿大动物护理委员会指南以及国际疼痛研究协会（IASP）研究与伦理问题委员会的指南。本研究使用了六只雄性Wistar大鼠（体重：320–450 g；年龄：18–22周）。动物购自商业来源（见材料表）。这些大鼠的数据来自先前一项研究30的更大样本。

1. 实验准备

  1. 将动物饲养在温度可控的标准动物实验设施中，自由摄取食物和水 随意 14小时光照-10小时黑暗循环。确保所有动物在实验当天健康状况良好。
  2. 按照以下步骤建立慢性背痛动物模型。
    1. 为诱导慢性背痛，根据既往文献报道，向背部肌肉注射完全弗氏佐剂（Complete Freund Adjuvant, CFA）14,30,31.
    2. 使用异氟烷麻醉动物（诱导浓度为4%，维持浓度为2%–2.5%）。
    3. 使用27 G针头，向其中注射150 µL即用型水包油CFA乳剂（参见 材料表根据实验方案需求，将物质单侧或双侧注射至椎旁肌内。
      4. ....

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结果

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该方法已在先前的研究中使用，其中提供了完整的数据和统计结果，用于比较CFA组与对照组大鼠的背部机械敏感性30。来自先前研究中六只大鼠的代表性个体数据（左右侧阈值的平均值）如图3和表1所示。在基线水平时，各组之间的机械敏感性相似。向腰部肌肉注射CFA后，从注射后第7天至第28天，机械敏感性显著增加（阈值降低）。相比之下，对照（CTL）组大鼠未出现此类变化。如图3所示，正如此类行为学评估所预期的那样，动物个体内部及个体之间均存在变异性。然而，高敏感性的CFA大鼠表现出较低的变异性。根据先前的研究30，每组16只动物（8只CFA组和8只CTL组）足以在5个时间点上检测到随时间变化的组间显著效应（η2p = 0.38）。

本研究通过组织学检查证实，注射完全弗氏佐剂（CFA）的肌肉存在.......

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讨论

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关键步骤
BMS 检测是一种简单的方法，用于评估大鼠背部的机械敏感性，可在单个时间点或在数天至数周内重复进行，适用于预期发生改变的情况（如疼痛模型）或药物及非药物干预后。该方法的关键环节包括测试笼具，其尺寸必须确保大鼠舒适且活动受限。动物背部必须通过网状顶盖保持可接触，以实现可重复的机械刺激。为减少阈值评估的变异性，待检测的背部区域必须剃毛，以确保机械刺激直接作用于皮肤。此外，需对皮肤进行标记，以保证机械刺激始终作用于同一区域。最后，实验操作者必须从动物后方将纤维丝接近皮肤，以避免被动物看见。

与用于评估后肢足底机械敏感性的 Von Frey 实验相比15,16在BMS测试中产生阳性反应所需的机械力较低。应谨慎选择测试所用的纤维丝。使用以下规格的纤维丝可满足大多数实验需求（0.07、0.16、0.4、0.6、1、2、4、6、10、15 和 26 g），并避免出现天花板效应或地板效应。本实验中首次应用采用2 g纤维丝。可根.......

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披露

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作者声明不存在可能导致利益冲突的竞争性利益或关系。

致谢

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本工作获得了魁北克脊椎矫正基金会和加拿大自然科学与工程研究理事会（MP：资助号 #06659）的资助。HK 的贡献得到了三河城魁北克大学（PAIR 项目）的支持。BP 的贡献得到了魁北克健康研究基金会（FRQS）和魁北克脊椎矫正基金会的资助。TP 的贡献得到了加拿大自然科学与工程研究理事会的支持。NE 和 EK 的贡献得到了魁北克脊椎矫正基金会的资助。MP 的贡献得到了 FRQS 的支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
异氟烷（Aerrane，符合美国药典标准） - 仅限兽用BaxterNDC 10019-773-60吸入用麻醉剂；DIN 02225875，用于诱导麻醉
完全弗氏佐剂（CFA）Fisher Scientific#77140含灭活的Mycobacterium butyricum细胞的水包油型完全弗氏佐剂（CFA）乳剂
雄性Wistar大鼠Charles River Laboratories体重：320–450 g；年龄：18–22周
Penlon Sigma Delta 麻醉蒸发器Penlon990-VI5K-SVEEK用于麻醉的 Penlon Sigma Delta 麻醉蒸发器
Sharpie 永久性记号笔SharpieBC23636永久性记号笔，细头，黑色
测试笼定制宽度：20 cm；  长度：50 cm；底部至顶部高度：40 cm；底部网格至笼顶高度：7 cm；壁厚：5 mm；网格：1 mm 直径金属丝，丝间距 8 mm   
冯·弗雷细丝（Von Frey Filaments）Aesthesio，精确触觉感觉评估仪514000-20C细丝范围：0.07 g 至 26 g
Wahl Professional Animal，ARCO 无线宠物电推剪，修剪用美容工具 Wahl套装编号 #8786-1201动物毛发修剪器，用于剃毛，零号刀头 

参考文献

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  1. Hartvigsen, J., et al. What low back pain is and why we need to pay attention. Lancet. 391 (10137), 2356-2367 (2018).
  2. Manchikanti, L., Singh, V., Falco, F. J., Benyamin, R. M., Hirsch, J. A. Epidemiology of low back pain in adults. Neuromodulation. 17, Suppl 2 3-10 (2014).
  3. Urits....

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