为了开发用于预防和治疗背痛的新型治疗干预措施，需要借助动物模型从转化医学的角度来研究这些疗法的作用机制和有效性。本方案描述了BMS测试，即一种用于评估大鼠背部机械敏感性的标准化方法。
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摘要
摘要
腰痛是全球致残的首要原因，给个人、经济和社会带来巨大影响。为了开发新的治疗方法，需要借助动物模型从转化医学的角度研究新疗法的作用机制和有效性。目前的研究中使用了多种啮齿类动物腰痛模型。然而令人意外的是，尚无经过验证的标准化行为学测试可用于评估腰痛模型的机械敏感性。这一点至关重要，因为需要确认假定患有腰痛的动物是否对伤害性刺激表现出局部痛觉过敏，并在旨在缓解腰痛的干预过程中监测其敏感性变化。本研究的目的是建立一种简单且易于实施的测试方法，用于评估大鼠背部的机械敏感性。为此方法专门设计了一个测试笼，其尺寸为长×宽×高：50 × 20 × 7 cm，顶部设有不锈钢网。该测试笼可允许对动物背部施加机械刺激。进行测试前，需剃除动物目标区域的背部毛发，并标记测试区域，以便在不同日期重复测试。使用Von Frey纤维丝通过先前描述的上下法（up-down method）测定机械痛阈值，刺激部位为椎旁肌。阳性反应包括：（1）肌肉抽动，（2）弓背（背部伸展），（3）颈部转动，（4）抓挠或舔舐背部，以及（5）试图逃离。该行为学测试（背部机械敏感性（BMS）测试）对于利用啮齿类动物腰痛模型开展机制研究，以及开发预防和管理腰痛的治疗干预手段具有重要应用价值。
引言
下背痛（LBP）是全球致残的首要原因，具有显著的个人、经济和社会后果1,2,3,4。每年约有37%的人口受到下背痛的影响5。下背痛通常在数周内自行缓解，但在24%–33%的个体中会复发，并在5%–10%的病例中转为慢性2。为了理解下背痛的机制和影响，以及不同治疗干预的效果，已采用多种动物模型来模拟临床状况或下背痛的某些组成部分6。这些小鼠和大鼠模型可归入以下一个或多个类别：（1）椎间盘源性下背痛7,8,，（2）根性下背痛8,9,10,11，（3）小关节骨关节炎12，以及（4）肌肉源性下背痛13,14。由于无法直接测量非人类物种的疼痛，研究人员已开发出多种测试方法，用于量化这些模型中的类似疼痛行为8。这些测试评估由有害刺激（机械力15,16,17、热刺激18,19,20,21,22,23,24,25）诱发的行为或自发产生的行为26,27,28,29。
使用机械刺激的方法包括 Von Frey 试验15,16 和 Randall-Selitto 试验17。使用热刺激的方法包括尾 flick 试验18、热板试验19、Hargreaves 试验20 以及热探针试验21。使用冷刺激的方法包括冷板试验22、丙酮蒸发试验23 和冷足底试验24。用于自发行为的检测方法包括面部疼痛评分量表26、挖掘行为检测27、负重与步态分析28，以及自动化行为分析29。尽管已有大量可用的检测方法，但其中没有一种是专门为背痛模型设计的。
本研究的目的是建立一种简单且易于操作的检测方法，用于评估大鼠背部的机械敏感性。该技术主要基于应用于后肢足底表面的Von Frey试验15,16。Von Frey试验的基本原理是将一系列单丝纤维施加于目标区域，以传递恒定且预先设定的力。当大鼠出现伤害性防御行为时，视为阳性反应。随后可根据引发反应的纤维计算出机械阈值。在本研究中，提供了一种源自Von Frey试验的简单且易于实施的方法，用于测定大鼠背部的机械敏感性。
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方案
实验方案经魁北克大学三河分校动物护理委员会批准，并符合加拿大动物护理委员会指南以及国际疼痛研究协会（IASP）研究与伦理问题委员会的指南。本研究使用了六只雄性Wistar大鼠（体重：320–450 g；年龄：18–22周）。动物购自商业来源（见材料表）。这些大鼠的数据来自先前一项研究30的更大样本。
1. 实验准备
- 将动物饲养在温度可控的标准动物实验设施中，自由摄取食物和水 随意 14小时光照-10小时黑暗循环。确保所有动物在实验当天健康状况良好。
- 按照以下步骤建立慢性背痛动物模型。
- 为诱导慢性背痛，根据既往文献报道，向背部肌肉注射完全弗氏佐剂（Complete Freund Adjuvant, CFA）14,30,31.
- 使用异氟烷麻醉动物（诱导浓度为4%，维持浓度为2%–2.5%）。
- 使用27 G针头，向其中注射150 µL即用型水包油CFA乳剂（参见 材料表根据实验方案需求，将物质单侧或双侧注射至椎旁肌内。
- 注射完成后，将注射针头在原位保留至少3分钟。对于对照组动物，采用相同的实验步骤。30，但注入无菌生理盐水溶液（150 µL，0.9%）替代CFA。
- 制备测试笼。
- 为两只动物制作一个测试笼，其中每只动物各有一个独立的隔间。
注意：本研究中，每个腔室的尺寸如下：长 × 宽 × 高：50 × 20 × 7 cm（见 材料表). - 将两个相邻的实验舱固定在四根长33 cm的有机玻璃腿上。实验舱的侧壁使用透明有机玻璃，而分隔两个实验舱的部分使用黑色有机玻璃，以防止动物相互看见。
- 使用由1 mm金属丝制成、金属丝间距为8 mm的不锈钢网制作测试笼的底面和顶面图1).
- 为两只动物制作一个测试笼，其中每只动物各有一个独立的隔间。
2. 背部机械敏感性（BMS）测试
- 在首次测试前连续5至7天，每天让动物在测试笼中适应30分钟。根据需要重复测试。
- 使用 2% 异氟烷对动物进行麻醉31 （参见 材料表).
- 在异氟烷麻醉下取俯卧位，使用动物毛发修剪器剃除目标区域（T6至L6椎体水平）背部的毛发（参见 材料表）。对于重复测量，每3天在不进行行为学评估的日子剃除背部毛发，以确保刺激始终直接作用于皮肤。使用永久性标记笔在皮肤上画一个黑点，以确保在不同天重复测试时，纤维丝始终作用于同一区域。
- 测试当天，将动物放入测试笼中适应15-30分钟，直至动物状态平静。
- 测试过程中，将Von Frey纤维丝（0.07、0.16、0.4、0.6、1、2、4、6、10、15和26 g）垂直作用于背部，始终从2 g纤维丝开始，并采用上下法15 （参见 材料表从动物后方缓慢接近，并将纤维丝从动物背后靠近。
- 仅在动物清醒、四肢站立且静止不动时施加纤维丝。将纤维丝双侧施加于目标区域，距离棘突10 mm，持续2秒。图2），每15-30秒一次。
注意：若动物在刺激丝施加期间或施加后立即出现以下任一或多种行为，则视为阳性反应：（1）肌肉抽动，（2）弓背（背部伸展），（3）转颈观察背部，（4）抓挠或舔舐背部，（5）逃避。
- 仅在动物清醒、四肢站立且静止不动时施加纤维丝。将纤维丝双侧施加于目标区域，距离棘突10 mm，持续2秒。图2），每15-30秒一次。
- 如前所述15，如果施加纤维丝后未观察到反应，则使用系列中下一根力度更大的纤维丝。如果观察到反应，则使用系列中下一根力度更小的纤维丝。重复此过程，直至在首次行为变化（一系列无反应后出现反应）之后获得四次读数 "无响应" 或在一系列刺激后无反应 "反应").
- 数据采集完成后，按照 Chaplan 等人的方法，计算代表机械阈值 50% 的数值。15，使用此公式：
50% 阈值（g）= 10(Xf+kδ)/10 000
注意：在此公式中， "Xf” 是指最后使用的 von Frey 纤维丝的标记。 "k" 是基于动物反应模式的表格值15，“δ”表示Von Frey纤维丝之间手柄标记增量的平均值。根据实验设计和实验需求，可仅评估脊柱一侧以报告一个阈值，也可评估两侧，并分别报告阈值或取均值报告。参见 补充表1 用于计算模板32.
3. 动物恢复
- 肌肉注射完成后，停止麻醉，将动物单独放置于标准饲养笼中进行恢复。
- 在恢复期间，观察动物的行为，不得使其无人看管。
- 确认动物在5分钟内从麻醉状态恢复并能正常活动后，将其放回与其他动物共同饲养的常规笼具中。
注意：实验结束时，在深度异氟烷麻醉（5%）下经心脏灌注10%甲醛溶液。随后取注射部位的背部肌肉组织，用于组织学检查及炎症改变的确认。
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结果
该方法已在先前的研究中使用，其中提供了完整的数据和统计结果，用于比较CFA组与对照组大鼠的背部机械敏感性30。来自先前研究中六只大鼠的代表性个体数据（左右侧阈值的平均值）如图3和表1所示。在基线时，各组之间的机械敏感性相似。向腰部肌肉注射CFA后，从注射后第7天至第28天，机械敏感性显著增加（阈值降低）。相比之下，对照（CTL）组大鼠未出现此类变化。如图3所示，由于此类行为学评估的特性，动物个体内部及个体之间均存在一定的变异性。然而，CFA诱导的高敏感性大鼠表现出较低的变异性。根据先前的研究30，每组8只大鼠（共16只，包括8只CFA组和8只CTL组）足以在5个时间点上检测到随时间变化的组间显著效应（η2p = 0.38）。
本研究通过组织学检查证实，注射完全弗氏佐剂（CFA...
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讨论
关键步骤
BMS 检测是一种简单的方法，用于评估大鼠背部的机械敏感性，可在单个时间点或在数天至数周内重复进行，适用于预期发生改变的情况（如疼痛模型）或药物及非药物干预后。该方法的关键环节包括测试笼具，其尺寸必须确保大鼠舒适且活动受限。动物背部必须通过网状顶盖保持可接触，以实现可重复的机械刺激。为减少阈值评估的变异性，待检测的背部区域必须剃毛，以确保机械刺激直接作用于皮肤。此外，需对皮肤进行标记，以保证机械刺激始终作用于同一区域。最后，实验操作者必须从动物后方将纤维丝接近皮肤，以避免被动物看见。
与用于评估后肢足底机械敏感性的 Von Frey 实验相比15,16在BMS测试中产生阳性反应所需的机械力较低。应谨慎选择测试所用的纤维丝。使用以下规格的纤维丝可满足大多数实验需求（0.07、0.16、0.4、0.6、1、2、4、6、10、15 和 26 g），并避免出现天花板效应或地板效应。本实验中首次应用采用2 g纤维丝。可根...
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披露
作者声明不存在可能导致利益冲突的竞争性利益或关系。
致谢
本工作获得了魁北克脊椎矫正基金会和加拿大自然科学与工程研究理事会（MP：资助号 #06659）的资助。HK 的贡献得到了三河城魁北克大学（PAIR 项目）的支持。BP 的贡献得到了魁北克健康研究基金会（FRQS）和魁北克脊椎矫正基金会的资助。TP 的贡献得到了加拿大自然科学与工程研究理事会的支持。NE 和 EK 的贡献得到了魁北克脊椎矫正基金会的资助。MP 的贡献得到了 FRQS 的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 异氟烷（Aerrane，符合美国药典标准） - 仅限兽用 | Baxter | NDC 10019-773-60 | 吸入用麻醉剂；DIN 02225875，用于诱导麻醉 |
| 完全弗氏佐剂（CFA） | Fisher Scientific | #77140 | 含灭活的Mycobacterium butyricum细胞的水包油型完全弗氏佐剂（CFA）乳剂 |
| 雄性Wistar大鼠 | Charles River Laboratories | 体重：320–450 g；年龄：18–22周 | |
| Penlon Sigma Delta 麻醉蒸发器 | Penlon | 990-VI5K-SVEEK | 用于麻醉的 Penlon Sigma Delta 麻醉蒸发器 |
| Sharpie 永久性记号笔 | Sharpie | BC23636 | 永久性记号笔，细头，黑色 |
| 测试笼 | 定制 | 宽度：20 cm； 长度：50 cm；底部至顶部高度：40 cm；底部网格至笼顶高度：7 cm；壁厚：5 mm；网格：1 mm 直径金属丝，丝间距 8 mm | |
| 冯·弗雷细丝（Von Frey Filaments） | Aesthesio，精确触觉感觉评估仪 | 514000-20C | 细丝范围：0.07 g 至 26 g |
| Wahl Professional Animal，ARCO 无线宠物电推剪，修剪用美容工具 | Wahl | 套装编号 #8786-1201 | 动物毛发修剪器，用于剃毛，零号刀头 |
参考文献
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