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方法文章

量化在有无发色团存在下Cu(II)与肽残基之间的结合相互作用

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DOI：

10.3791/63668

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2022年4月5日

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of San Francisco, 2Department of Chemistry, University of California, Davis

本文内容

摘要

本文重点介绍利用电子吸收光谱法和等温滴定热法来研究并量化 Cu(II) 与肽和蛋白质结合的热力学过程。

摘要

铜(II) 是生物系统中一种必需的金属元素，能够赋予与其相互作用的生物分子独特的化学性质。已有研究报道，铜(II) 可直接结合多种肽类，在从介导分子结构、电子转移特性到赋予催化功能等过程中发挥必要及病理性的生物学作用。定量测定这些 Cu(II)-肽复合物的结合亲和力与热力学参数 体外 可揭示结合过程的热力学驱动力、不同金属离子对肽的竞争作用或不同肽对Cu(II)的竞争作用，以及Cu(II)-肽复合物的稳定性和存在优势 体内然而，由于存在多种因素，对结合热力学进行量化可能具有挑战性，包括在滴定实验中需考虑所有竞争平衡，尤其是在缺乏能够分别代表肽、d区金属离子及其相互作用的明确光谱信号时。

本文提供了一套可靠的实验方法，用于精确量化 Cu(II)-肽的热力学参数。文章重点介绍了在有或无发色配体的条件下，利用电子吸收光谱法对 Cu(II) 进行光谱检测，以及采用无标记等温滴定 calorimetry（ITC）的方法。在这两种实验技术中，均描述了如何考虑所有竞争平衡过程的分析流程。尽管本文主要关注 Cu(II)，但所描述的实验体系不仅适用于 Cu(II)-肽相互作用，还可为在生理相关条件下准确量化其他金属-肽体系提供通用框架。

引言

生物学已进化出利用生命所需的金属离子多样化学性质的能力，以适应并存活于周围环境。据估计，25%至50%的蛋白质在结构和功能上依赖金属离子1金属离子的特定作用及其氧化还原状态与其配位的生物配体的组成和几何结构直接相关。此外，对于铜离子（Cu(II)）等具有氧化还原活性的金属离子，必须进行严格调控，以防止其与氧化剂发生相互作用。 通过 类芬顿化学反应生成活性氧（ROS）2,3,4理解其生物化学过程中结合模式与亲和力的作用机制，将有助于阐明该金属离子的生物学功能。

研究金属与肽结合相互作用的方法有多种，主要包括光谱学技术，也包括分子动力学计算机模拟，例如通过分子动力学模拟研究Cu(II)与β-淀粉样蛋白片段（Aβ）的相互作用5。核磁共振（NMR）是一种广泛使用且许多高校均可开展的光谱学技术。Gaggelli等人利用Cu(II)的顺磁性，通过观察邻近原子核的弛豫效应，确定了金属离子在肽上的结合位点6。电子顺磁共振（EPR）也可用于探究顺磁性金属离子的结合位置及其结合模式7。其他光谱学技术，如圆二色光谱（CD），可用于描述三肽体系等系统中Cu(II)的配位结构8；而质谱法可通过碎片化模式揭示金属离子与哪些残基配位以及其化学计量关系9,10。

其中一些技术（如核磁共振，NMR）无需标记，但需要高浓度的肽，这为研究带来了挑战。另一种常用的技术是荧光光谱法，已被用于研究酪氨酸或色氨酸的位置与 Cu(II) 淬灭之间的关系11,12。类似地，该技术也可用于显示由于 Cu(II) 结合所引起的空间结构变化13。然而，这些金属-肽结合研究存在的问题是：它们依赖于含有生色氨基酸（如酪氨酸）的体系，而并非所有肽都含有此类氨基酸；此外，这些研究通常假设金属离子遵循经典的结合模型，且该技术可能不适用于生理条件。事实上，目前已发现多种肽既不含此类生色氨基酸，也不遵循经典的结合模型，因此限制了上述技术的应用14,15。本文详细介绍了在生理相关条件下评估这些特殊情况下结合特性的研究方法。

生物配体可能呈现不同的质子化状态，从而影响金属离子的结合，例如组氨酸上的咪唑环。如果pH值不能保持恒定，实验结果可能会变得复杂或相互矛盾。因此，缓冲液是研究金属-蛋白质/肽相互作用的重要组成部分。然而，许多缓冲液已被证明会与金属离子发生有利的相互作用16,17。除了与目标生物分子竞争结合金属离子外，缓冲液可能含有与肽或蛋白质中配位原子相似的配位原子，难以区分。本研究重点关注电子吸收光谱法和等温滴定量热法（ITC）作为研究Cu(II)-肽相互作用的两种互补技术，并特别考虑了缓冲液的选择问题。

电子吸收光谱是一种快速且广泛应用的技术，可用于研究金属结合相互作用。使用紫外（UV）或可见光波长的光照射时，可导致金属中心的d-d跃迁吸收带，从而提供有关配体分类、金属几何构型以及表观结合亲和力的重要信息18,19。对于这些配合物，通过将金属离子直接滴定至蛋白质或肽溶液中，可定量测定其结合化学计量比和表观结合亲和力。在某些情况下，例如d5或d10电子构型，配合物不吸收光（即在光谱上无信号）。对于这类光谱学上“沉默”的过渡金属配合物，可通过使用一种竞争性配体来克服这些限制，该配体在与金属离子配位后会产生可检测的电荷转移吸收带。无论哪种情况，该方法仅能用于定量化学计量比和表观结合亲和力，若无近似假设，则无法提供关于结合焓的任何信息。

与电子吸收光谱法获得的信息相辅相成，等温滴定量热法（ITC）是一种直接且严格量化结合焓变的吸引人技术20。ITC 可直接测量结合过程中释放或消耗的热量，由于滴定过程在恒定压力下进行，所测得的热量即为所有平衡的焓变（ΔHITC）。此外，该方法还可量化结合事件的化学计量比（n）和表观结合亲和力（KITC）。基于这些参数，可进一步确定自由能（ΔGITC）和熵变（ΔSITC），从而提供结合事件的完整热力学图景。由于不依赖光吸收，ITC 特别适用于光谱学上“静默”的物种，例如 d5 或 d10 金属离子配合物。然而，由于量热法测量的是热量，任何未匹配的缓冲体系或未被计入的平衡都可能对准确测定金属离子结合热力学产生不利影响，因此必须高度重视并妥善处理这些因素20。若以适当严谨性操作，ITC 是测定金属-蛋白质/肽复合物热力学性质的一种可靠技术。

本文利用一种无生色团的铜结合肽C-肽，展示了两种技术的互补应用。C-肽是胰岛素成熟过程中产生的一种由31个残基组成的裂解产物（EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ）；该肽不含生色团残基，但已被证明能够以生理相关的亲和力结合Cu(II)14,15。Cu(II)结合位点由一个谷氨酸和一个天冬氨酸的侧链以及肽链的N-末端组成14,15。这些配位原子与许多常用缓冲体系中的配位原子非常相似。本文展示了电子吸收光谱中d-d跃迁和电荷转移带与等温滴定量热法（ITC）联用，用于定量测定C-肽结合Cu(II)的热力学参数。该研究Cu(II)与C-肽结合的方法可推广应用于其他金属离子及蛋白质/肽体系。

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方案

1. 电子吸收光谱法：含缓冲液竞争的直接滴定

  1. 样品制备
    1. 使用超纯水（电阻率 >18 MΩ）配制 pH 7.4 的 50 mM 2-[双(2-羟乙基)氨基]-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇（bisTris）缓冲溶液。通过高亲和力树脂孵育至少 2 小时以去除痕量金属离子，随后进行过滤。
    2. 将已知量的肽溶解或稀释于去金属离子缓冲液中。
      注：当监测摩尔吸光系数较小的 d-d 跃迁吸收带时21，需使用较高浓度的肽。本实验中，缓冲液中 C-肽的终浓度为 300 µM（体积取决于比色皿大小）。C-肽通过固相肽合成法制备，具体方法见其他文献14。
    3. 将已知质量的 CuCl2 溶解于超纯水中，配制成 10–15 mM 的溶液。
      注：初始应将金属盐溶解于非缓冲水中，以防止沉淀。也可使用其他 Cu(II) 盐，但需注意阴离子应为弱配位性。
  2. 运行实验
    1. 打开紫外-可见分光光度计，使用前预热约 15–20 分钟。启动仪器配套软件，设置参数，如扫描范围（200–900 nm）、扫描速度（200 nm/s）及双光束基线校正（更多参数见补充文件）。
    2. 在光路中不放置比色皿或样品，采集基线。
    3. 在双光束分光光度计中使用两个匹配的比色皿，一个加入 115 µL 超纯水，另一个加入 115 µL 肽样品。确保比色皿内无气泡，以免干扰信号。
    4. 将装有超纯水的比色皿置于参比光束，装有肽样品的比色皿置于样品光束。
    5. 采集去金属（apo）肽的吸收光谱。
    6. 向装有肽样品的比色皿中加入亚化学计量的 Cu(II) 溶液（0.5 当量，150 µM）。确保加入体积小于 3 µL，并记录该体积以供后续分析。
    7. 轻柔吹打混匀溶液，避免产生气泡。让溶液反应并平衡 5 分钟后，记录吸收光谱。
    8. 重复步骤 1.2.6 的 Cu(II) 分步加入操作，依次加入以下当量的 Cu(II)：1.0、1.5、2.0、3.0 和 5.0（即终浓度分别为 300、450、600、900 和 1,500 µM）。务必记录累计加入的 Cu(II) 体积及比色皿中总体积。
      注：若需更高分辨率，可减小当量之间的间隔。
    9. 取出样品比色皿，并按照制造商说明彻底清洗。
    10. 加入不含肽的缓冲液，记录吸收光谱。重复步骤 1.2.5–1.2.8 的 Cu(II) 分步加入操作，每次加入后均记录相应当量下的吸收光谱。
    11. 将所有光谱导出为 csv 文件以供处理。根据制造商说明彻底清洗比色皿，并关闭分光光度计。
  3. 数据处理
    1. 将所有光谱数据导入电子表格程序。
    2. 从其余各光谱中减去仅含缓冲液（0 µM Cu(II)）的光谱，以消除缓冲液自身可能产生的吸光特征。
    3. 对每条光谱进行归一化处理，以校正因加入 Cu(II) 溶液导致的稀释效应（见步骤 1.2.6）。归一化方法示例见补充文件公式（1）14，其中 vinitial 为加入比色皿的肽体积（115 µL），vCu(II) 为步骤 1.2.6 中加入的 Cu(II) 溶液体积，Absbuffer subtracted spectrum 为步骤 1.2.7 获得的数据。
    4. 将所有光谱绘于同一图中，以识别变化区域。
      ​注：Cu(II) 配合物典型的 d-d 跃迁吸收带位于 500–750 nm 范围。由于 d-d 跃迁为八面体构型中的 Laporte 禁阻跃迁，其摩尔吸光系数较小，因此该光谱滴定可能具有挑战性21。若吸光度太弱，可采用另一种策略：使用生色配体，其与 Cu(II) 结合后产生电荷转移吸收带（见第 2 节）。

2. 电子吸收光谱法：染料配体与肽的竞争

  1. 样品制备
    1. 将1,10-菲咯啉（phen）溶解于超纯水中，得到终浓度约为1 mM的溶液。
    2. 除第1.1节中所述的肽（步骤1.1.2）和Cu(II)（步骤1.1.3）的样品制备外，另在缓冲液中配制10 µM Cu(II)和40 µM phen的溶液（[Cu(phen)3]2+）。确保溶液体积足以填满比色皿。
  2. 运行实验
    1. 启动电子吸收分光光度计，操作同步骤1.2.1和1.2.2，但将扫描范围设为200–400 nm。
    2. 在两个匹配的比色皿中，一个加入115 µL超纯水，另一个加入115 µL [Cu(phen)3]2+溶液。将盛水的比色皿置于参比光路，盛[Cu(phen)3]2+溶液的比色皿置于样品光路。
    3. 采集金属-配体配合物的吸收光谱。
    4. 向[Cu(phen)3]2+溶液中加入化学计量比（≈1当量，≈10 µM）的肽。轻轻吹打混匀，注意避免引入气泡。记录所加肽的体积，以供后续分析使用。
      注：使用容量为115 µL的比色皿时，加入3.83 µL 300 µM肽溶液，可得终浓度为9.7 µM的肽。
    5. 孵育溶液5分钟以达到平衡。记录吸收光谱。
      注：若金属-肽与金属-配体的结合亲和力相近，则需加入大量过量的肽。务必考虑所加肽的总体积，以便进行归一化校正。
    6. 继续向[Cu(phen)3]2+溶液中分次加入肽，使加入的肽当量依次约为：2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、22和26。记录每次加入的肽体积，以便确定稀释后的浓度。
    7. 取出样品，按照制造商说明彻底清洗比色皿。采集缓冲液的光谱，以及缓冲液中50 µM肽的光谱。
    8. 将所有数据导出为csv文件以供处理，并按照制造商说明清洗比色皿。
  3. 数据处理
    1. 在电子表格程序中载入光谱数据，并从其他光谱中减去缓冲液的光谱。
    2. 根据补充文件中的公式（2）14对光谱进行归一化处理。
    3. 利用[Cu(phen)3]2+在265 nm处的摩尔吸光系数（εmax = 90,000 M-1cm-1）22，确定每次加入肽后[Cu(phen)3]2+的浓度。
    4. 对于每次加入的肽，通过从初始[Cu(phen)3]2+浓度（0 µM肽时）减去步骤2.3.2中测定的剩余[Cu(phen)3]2+浓度，计算Cu(II)-肽配合物的浓度。
    5. 根据补充文件中的公式（3）14计算游离phen配体的浓度。
    6. 使用补充文件中的公式（4）14计算游离肽的浓度，其中[peptide]stock表示加入比色皿中的未稀释肽储备液，V1表示加入的肽储备液体积，V2表示比色皿的总体积，[Cu2+-peptide]由步骤2.3.4确定。
    7. 使用补充文件中的公式（5）23计算实验测得的结合亲和力（Kex）。
    8. 根据补充文件中的公式（6）23将Cu(II)-肽的解离常数与Kex关联，其中Kd,Cu(II)-phen = 1.0 × 10-9（见22）。从所有测定的解离常数中计算平均值和标准偏差。
      ​注：在phen:Cu(II)为4:1的条件下，溶液中存在[Cu(phen)3]2+、[Cu(phen)2]2+和[Cu(phen)]2+，肽将优先从结合最弱的物种[Cu(phen)]2+中螯合出Cu(II)22。

3. 等温滴定热力学

  1. 样品制备
    1. 使用超纯水配制 15 mM 3-吗啉丙烷-1-磺酸（MOPS）缓冲溶液，pH 调至 7.4>18 MΩ 抗性）。通过高亲和树脂孵育至少 2 h 以去除痕量金属离子，随后使用 0.45 μm 瓶顶滤器进行真空过滤 µm 膜
    2. 溶解已知质量的 CuCl₂·2H₂O，用超纯水配制成 10 mM 的储备溶液2 在超纯水中溶解以制备溶液 ≈50-100 mM。将该Cu(II)溶液用缓冲液稀释，得到体积为1.0 mL、Cu(II)终浓度为1.4 mM的溶液。记录所用CuCl₂的准确体积。2 所用溶液。
    3. 将肽溶液用缓冲液溶解或稀释至 450 µL 的 154 µM 肽溶液。确保加入与 3.1.2 步骤中相同比例的额外超纯水至肽溶液中，以降低稀释热并提高信噪比。
    4. 样品制备完成后，确保溶液处于相同的pH值，必要时进行相应调整。
    5. 可选步骤：对溶液进行脱气，以尽量减少等温滴定量热法（ITC）中引入的微小气泡。
  2. 运行实验
    1. 打开等温滴定量热仪（ITC），启动ITC软件以运行仪器。等待首次初始化完成，系统将提示重新校准滴定管；随后按照屏幕上的指示进行操作。
    2. 从参比池中移去盖子，清除参比池中的任何水分，并用450 µL 的脱气超纯水
    3. 缓慢吸取超纯水至450 µ加载注射器的 L 标记处，注意不要将气泡引入注射器中。将加载注射器插入参比池，直至其 ≈距底部1 mm处缓慢注入部分溶液，直至150 µL 保留在加样注射器中。快速上下移动加样注射器的活塞， ≈25 µL 多次，以清除细胞表面附着的气泡。缓慢注入，直至推杆到达 100 µL标记处，从而分配出总共350 µ将超纯水加入参考池中，并盖上参考池盖。
    4. 去除样品池中的残留溶液，并加入450 µ使用装有10 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的上样注射器清洗1 L，浸泡10分钟，以确保去除痕量金属离子，因为EDTA会结合这些痕量金属。
    5. 移除含有结合的痕量金属离子的EDTA溶液，并用大量超纯水彻底冲洗上样注射器。
    6. 按照制造商的说明清洗等温滴定量热仪，用超纯水冲洗样品池。
    7. 用450 μL的溶液冲洗样品池以进行预处理 µ缓冲液至少冲洗3次。
    8. 移除用于平衡样品池的缓冲液。使用加样注射器将肽溶液加入样品池中（遵循步骤3.2.3）。
    9. 用200 μL的溶液冲洗滴定注射器 µ缓冲溶液的 L。为此，先取出活塞，然后使用移液器将缓冲液通过玻璃滴定注射器顶部的孔注入，使其流经注射器并从下方的针头排出。
    10. 将活塞完全插入滴定注射器中。
    11. 将滴定注射器针头的尖端浸入金属溶液中，缓慢向上拉动活塞，使金属溶液充满注射器并产生结果 位于滴定注射器玻璃部分顶部的空腔内。将滴定注射器旋转至与地面平行，拔出推杆，轻轻将玻璃部分向地面方向倾斜，以尽量减少空腔体积。轻轻摇动滴定注射器，使溶液移至玻璃部分末端并填充大部分空腔，但需确保留有2-3 µ空体积剩余 L。保持注射器与地面平行，重新插入活塞。
    12. 将滴定注射器竖直握住，将针头末端重新浸入金属溶液中，推动活塞直至针头不再有气泡排出。通过缓慢向上拉动活塞至略高于50 μL刻度处，完成滴定注射器的加样。 µL 标记，同时保持针尖位于溶液中。
    13. 小心将滴定管注射器的玻璃部分插入滴定管中，并拧紧至手指拧不动为止。当因活塞受压而有少量溶液从滴定管注射器针尖流出时，使用轻型精细擦拭纸小心吸去溶液，注意不要触碰针尖。
    14. 将装有滴定注射器的滴定管插入样品池中，并牢固固定。
    15. 在ITC软件中设置参数。从 仪器控制，设置 搅拌速率 （典型的搅拌速率范围为 150 至 350 RPM）以及 温度 实验将在此温度下进行（通常为25 °C）。输入 注射器 和 细胞浓度 在 毫摩尔单位 在……之下 实验细节.
    16. 在 实验方法 部分，选择 逐级滴定. 单击 设置 并指定 20次注射 的 2.5 µL如果需要更高分辨率以观察结合事件，可增加注射次数并减少每次注射的体积。输入 时间间隔 每次注射之间留出足够长的时间，以确保信号达到平衡并恢复至基线水平，通常 300 秒.
    17. 点击 运行 单击按钮以开始实验，并指定数据保存位置。
    18. 实验结束后，清洗样品池和滴定注射器。
    19. 所有实验至少重复三次，以确保数据采集的精确性。
    20. 进行对照实验，将金属溶液滴定至缓冲溶液中（不含肽），以确保金属离子稀释热较小，且不存在未被计入的平衡体系。若稀释热较大，可考虑更换缓冲体系。
  3. 数据处理
    1. 启动等温滴定 calorimetry 分析软件并加载数据文件以进行分析。
    2. 导航至 基线 切换并检查热图。注意热图中是否存在由气泡或其他伪影引起的外源性热量释放或吸收。查找非金属溶液注射所导致的尖峰。
    3. 确保分析软件生成的基线跟随注射后并达到平衡的数据部分。如果出现偏离，则使用 基线枢轴点 调整基线。确保 积分区域 包含金属注射产生的峰，但遮蔽步骤2中热图里发现的任何气泡或伪影。从热图中减去基线。
      注意：只有在收集了多个热谱图之后，才建议进行此类操作，因为实验者需要先明确哪些是真实数据，哪些是人为假象，以便调整基线和 积分区域 可能会极大地影响数据。
    4. 导航至 建模 窗口以开始拟合数据，分析软件将显示每次加样后经积分并归一化浓度的数据。
    5. 左键单击第一次注射的数据点，将其从拟合算法中移除。
      注意：这种情况较为常见，因为在滴定剂与样品池溶液之间可能存在轻微混合，导致第一次注入时摩尔量分配不精确。
    6. 在 模型 部分，选择 空白（恒定） 在 格式 下拉菜单，该菜单基于最后一次注射的焓变，将从每个数据点中扣除，以校正稀释热的影响。此外，选择 独立 （或该系统的最佳模型）在第二步 样式 下拉菜单以拟合数据。
      注：对于标准的1:1结合相互作用，最常用的模型是独立模型。
    7. 使用绿色按钮，通过两个模型对数据进行拟合 发挥 按钮与一个 Σ.
      注意：另一种用于处理ITC数据的软件是SEDPHAT24.
    8. 在事后分析中考虑 Grossoehme 等人先前报道的所有竞争平衡.20.

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结果

本研究旨在利用电子吸收光谱和等温滴定量热法（ITC）这两种互补技术，定量分析并验证Cu(II)与C肽结合的热力学特性。由于电子吸收光谱具有较强的稳健性，因此直接对300 µM C肽溶液进行Cu(II)滴定（图1）。加入150 µM Cu(II)后，600 nm处的吸收带立即增强，该吸收带归属于Cu(II)的d-d跃迁带，并随着Cu(II)浓度增加至300 µM持续增强。当Cu(II)浓度超过300 µM后，d-d带的吸收不再增加，表明结合已达到饱和，且Cu(II)与C肽形成1:1的络合物。此外，由于双-Tris与Cu(II)具有较高的结合亲和力（log K = 5.27）16，因此Cu(II)/C肽的结合亲和力下限应处于微摩尔范围（log K > 6），才能将金属离子从缓冲液中螯合出来。然而，在该体系中，由于摩尔吸光系数较小，对吸收带进行精确定量存在困难。

为了克服d-d跃迁带消光系数较小的问题，采用了上述的生色配体phen。将C肽滴加到约10 µM的[Cu(phen)

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讨论

本文提供了一种用于定量测定 Cu(II) 与肽结合的亲和力及热力学参数的可靠方法。由于 Cu(II) 具有 d9 电子构型，其金属位点的 d-d 吸收带非常适合通过光谱进行监测。尽管其摩尔吸光系数较小，因而需要较高浓度的配合物才能获得可靠的信号，但将 Cu(II) 滴定至肽溶液中可快速获得结合化学计量比和近似结合亲和力的信息。然而，若金属被缓冲液和肽以相似的配位原子和几何构型所结合，则光谱差异可能难以分辨。为了定量测定结合亲和力，通常使用苯菲罗啉（phen）等生色配体，因其与金属离子之间存在对称性允许的电荷转移跃迁21。通过构建生色配体与非生色肽之间的竞争结合体系，并已知金属与该配体的结合亲和力，可直接测定金属-肽的结合亲和力。进一步利用电子吸收光谱法进行热力学分析则较为困难。若采用紫外-可见（UV-Vis）光谱等技术来量化结合焓变，必须在多个温度下测定结合亲和力，并进行范特霍夫（van't Hoff）分析。该分析假设结合过程的热容变化为零，但这一假设极少成立，因此仅能提供结合焓变的估算值20。

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

SC 感谢怀特黑德暑期研究奖学金的支持。MJS 感谢旧金山大学的启动资金和教师发展基金。MCH 承认获得美国国立卫生研究院（NIH MIRA 5R35GM133684-02）和美国国家科学基金会（NSF CAREER 2048265）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,10-邻菲罗啉Sigma Aldrich131377-25G
双-Tris缓冲液FisherBP301-100
瓶顶式0.45微米膜过滤器Nalgene296-4545任何能够去除树脂且不引入污染物的过滤系统均可接受
氯化铜(II)Alfa Aesar12458
EDTASigma AldrichEDS-500G
电子吸收分光光度计VarianCary 5000其他合适的高灵敏度分光光度计也可接受
高亲和力树脂Sigma AldrichC7901-25G
等温滴定微量热仪（ITC）TA InstrumentsNano ITC Low Volume
ITC分析软件TA InstrumentsNanoAnalyzeSEDPHAT（Methods. 2015, 76: 137–148）也可使用
ITC仪器控制软件TA InstrumentsITCRun
轻质精密擦拭纸Kimwipe34155
加样注射器HamiltonSyr 500 uL, 1750 TLL-SAL
配对石英比色皿Starna Cells, Inc16.100-Q-10/Z20确保小体积比色皿的窗口与分光光度计光束高度匹配
MOPS缓冲液Alfa AesarA12914
分光光度计软件CaryWinUV Scan
电子表格程序MicrosoftExcel任何合适的电子表格程序均可使用
滴定注射器TA Instruments5346
超纯水Millipore SigmaMilli-Q只要电阻率>18 MΩ，任何水源均可

参考文献

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量化在有无发色团存在下Cu(II)与肽残基之间的结合相互作用
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