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方法文章

建立人类牙齿类器官：推动机制研究与再生治疗的有力工具

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DOI：

10.3791/63671

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2022年4月13日

 ,  ,  , 
1Laboratory of Tissue Plasticity in Health and Disease, Cluster of Stem Cell and Developmental Biology, Department of Development and Regeneration, Leuven Stem Cell Institute, KU Leuven (University of Leuven), 2Biomedical Research Institute (BIOMED), UHasselt, Hasselt University

本文内容

摘要

我们提出一种从人类牙齿开始建立上皮类器官培养的方案。这些类器官具有强大的可扩增性，并能重现牙齿上皮干细胞的特性，包括其成釉细胞分化能力。这一独特的类器官模型为研究人类牙科（干细胞）生物学提供了有前景的工具，并有望应用于牙齿再生策略。

摘要

牙齿在人类生活中具有重要作用，不仅关乎食物咀嚼和言语功能，也影响心理福祉。目前关于人类牙齿发育与生物学的知识仍十分有限，尤其是对牙源性上皮干细胞及其功能的了解甚少。我们成功建立了一种新型类器官模型，其起源于人类牙齿组织（即从拔除的智齿中分离的牙囊组织）。该类器官可长期稳定扩增，并在标志物表达及功能活性方面重现了拟议中的人类牙源性上皮干细胞区室特征。特别是，这些类器官能够启动成釉细胞分化过程，该过程与体内发生的成釉细胞分化相似 体内 在成釉过程中。这一独特的类器官模型不仅为研究人类牙齿发育和牙科病理学提供了强有力的工具，还可能为牙齿再生治疗开辟新途径。基于这一新型类器官模型，以生物牙替代缺失牙齿，可能成为当前合成材料种植牙标准疗法的一种极具吸引力的替代方案。

引言

牙齿在咀嚼食物、言语和心理福祉（自我形象）方面具有重要作用。1人类牙齿由矿化程度不同、密度和硬度各异的组织构成。牙釉质是牙冠的主要组成部分，也是人体中矿化程度最高的组织。在牙齿发育过程中，牙釉质形成（成釉作用）时，牙源性上皮干细胞（DESCs）会分化为成釉细胞（即釉质形成细胞）。一旦牙釉质形成，由于牙齿萌出初期成釉细胞发生凋亡而丢失，牙釉质极少能够被修复或再生。1目前，因外伤或细菌性疾病导致的牙釉质组织损伤主要通过使用合成材料进行修复；然而，这些材料存在诸多重要缺陷，如微渗漏、骨整合与固位能力较差、使用寿命有限，以及无法实现完全功能性修复等。2因此，建立一种稳定且可靠的人类DESCs培养体系，使其具备生成成釉细胞并产生矿化组织的潜能，将是牙科再生领域的一大重要进展。

关于人类DESC表型及其生物学功能的知识十分有限3,4,5有趣的是，有人提出人类牙齿的牙上皮干细胞（DESCs）可能存在于马拉瑟上皮剩余（ERM）中，这些细胞簇位于包围未萌出牙齿的牙囊（DF）内，并在牙齿萌出后仍存留于牙根周围的牙周膜中。1与牙髓共同培养的ERM细胞可分化为成釉细胞样细胞，并生成类釉质组织6然而，由于缺乏可靠的研究模型，对ERM细胞在釉质（再）生中具体作用的深入研究一直受到限制7当前的ERM 体外 培养系统受限于在常规使用的二维条件下细胞寿命有限且表型迅速丢失8,9,10,11,12因此，一个易于处理的 体外 迫切需要一种能够可靠地扩增、研究和诱导人源DESCs分化的系统。

在过去的十年中，一种强大的技术被用于培养上皮干细胞 体外 已成功应用于多种（人类）上皮组织，用于研究其生物学特性及疾病机制13,14,15,16该技术可使组织上皮干细胞在接种于模拟细胞外基质（ECM）的支架（通常为Matrigel）并置于模拟组织干细胞微环境信号和/或胚胎发生过程的特定培养基中培养时，自发发育形成三维细胞结构（即类器官）。类器官发育通常所需的生长因子包括表皮生长因子（EGF）和WNT信号通路激活剂。14,15,16所获得的类器官能够长期稳定地模拟原始组织的上皮干细胞特性，同时在保持其表型和功能特性的情况下具有高度可扩增性，从而克服了临床获取的原代人组织常受限的问题。建立类器官时，无需在培养前从异质性组织（即包含间充质细胞等其他细胞类型）中分离上皮干细胞，因为间充质细胞无法在细胞外基质（ECM）中贴附或生长，最终可自然形成纯上皮来源的类器官。13,16,17,18,19这一前景广阔且用途多样的技术已推动了来自多种人体上皮组织的类器官模型的开发。然而，源自人类牙齿、对牙齿发育、再生及疾病深入研究具有重要价值的牙源性类器官，迄今尚未建立。20,21我们最近成功开发出一种新的类器官模型，该模型起源于青少年患者拔除的第三磨牙（智齿）中的牙滤泡组织。19.

本文描述了从成人牙齿（即第三磨牙的牙乳头组织）建立上皮类器官培养物的实验方案（图1A）。所获得的类器官长期可扩增，并表达与牙源性上皮干细胞（ERM）相关的干性标志物。有趣的是，与大多数其他类器官模型不同，通常必需的表皮生长因子（EGF）在此类器官的稳健发育和生长过程中是冗余的。值得注意的是，这些具有干性的类器官表现出成釉细胞分化特性，从而模拟了体内（in vivo）发生的ERM/牙源性上皮干细胞（DESC）特征及相关过程。本文所描述的这一新型且独特的类器官模型，为探索DESC的生物学特性、可塑性及分化潜能提供了平台，并为迈向牙齿再生策略的第一步打开了大门。

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方案

本研究所述所有方法均已获得鲁汶大学医院/鲁汶大学伦理委员会（13/0104U）批准。在获得患者知情同意后，收集拔除的第三磨牙（智齿）。

1. 准备工作

  1. 将一块48孔培养板在37 °C、1.9% CO2的培养箱中预温15-20小时。
  2. 在进行步骤2.1之前，将一份Matrigel（生长因子减少型，无酚红，下文简称基底膜基质，BMM）在冰上（4 °C）融化至少2小时。
    注意：避免BMM反复冻融。可将BMM在冰上融化15-20小时后，以1 mL分装至微量离心管中，于-20 °C保存。
  3. 将离心机预冷至4 °C。
  4. 准备培养基，并通过0.22 µm滤器过滤。以下体积基于通常同时拔除的四颗第三磨牙所收集的牙囊组织（DFs）。
    1. 配制20 mL牙囊收集培养基（表1）：含10%胎牛血清（FBS）、0.5%两性霉素B和1%青霉素-链霉素的最低必需培养基（αMEM）。取4 mL牙囊收集培养基转移至15 mL离心管中，并将离心管置于冰上。
      注意：每位患者采集样本时，一个15 mL离心管足以容纳四颗第三磨牙的样本。
    2. 使用无血清定义培养基（SFDM；表3）配制20 mL牙器官样培养基（下文简称TOM；表2）。TOM可在4 °C保存最多2周。
    3. 配制8 mL消化培养基（表4），即含胶原酶VI（3 mg/mL）和分散酶II（4 mg/mL）的磷酸盐缓冲液（PBS）。使用前，将消化培养基在37 °C水浴中预热至少10分钟，并分装至两个15 mL离心管中（每管4 mL），用于消化四份DF组织。
    4. 准备一块洗涤板（12孔板），其中三孔加入70%乙醇，三孔加入PBS，三孔加入牙囊收集培养基。
    5. 每份样本配制15 mL A培养基（即每位患者每两份DF组织配制5 mL；表5）。
      ​注意：以下步骤均需在无菌条件下操作。

2. 牙囊组织解离

  1. 将收集在收集液中（置于冰上）的伴有牙囊（DF）的第三磨牙转移至培养皿中。
  2. 用镊子夹住牙齿，使用手术刀小心分离牙囊组织。
    注意：此步骤需要熟练操作；使用刀片时务必小心。
  3. 为去除牙囊上残留的血液，将牙囊组织短暂放入70%乙醇（洗涤板）的第一孔中，持续20秒，随后转移至第二孔乙醇中20秒，再转移至第三孔乙醇中（在70%乙醇中总时间不超过1分钟；孵育时间过长会导致细胞活力下降）。
  4. 接着，在三个PBS孔中继续冲洗（总时间不超过2分钟）。
  5. 在剩余的三个牙囊收集液孔中冲洗牙囊（总时间最长不超过20分钟）。
  6. 将冲洗后的牙囊转移至新的培养皿中。
  7. 取其中一块牙囊组织的小片（约5 mm2）用于多聚甲醛（PFA）固定（见第7节），并将该组织置于含有500 µL牙囊收集液的微量离心管中，冰上保存（最多6小时），直至进行PFA固定。
  8. 将剩余的牙囊组织切成小块（约1 mm2）。
    注意：建议立即处理新鲜分离的牙囊组织，以获得最佳类器官形成和生长效率，而不建议使用冻存组织，因其效率较低。尽管如此，也可在此步骤对原代牙囊组织进行冻存（见第5节中的冻存液及冻存方案）。
  9. 将切碎的牙囊组织转移至含有4 mL预热解离液的15 mL离心管中，在37 °C水浴中孵育2小时。
    注意：每4 mL预热解离液中加入两个牙囊（一管），以确保最佳解离效果。
  10. 每隔15分钟，使用玻璃巴氏移液管将牙囊与解离液的混合物上下吹打，以加速组织解离。当不再观察到牙囊碎片时（通常在1小时后），改用火焰抛光后变窄的巴氏移液管继续进行牙囊解离。
    注意：为实现最佳牙囊解离，应在牙囊分离开始后不超过1小时即更换为火焰抛光变窄的巴氏移液管。
    1. 在此期间，准备含50 µL DNase（0.2 mg/mL；表5）的10 mL A培养基。
  11. 向每管已解离的牙囊组织中加入5 mL含DNase的A培养基，在室温（RT）下孵育1分钟。
  12. 将细胞悬液（含单个细胞和少量小细胞团块）通过40 µm细胞滤网过滤，以去除残留的大碎片和（大部分）纤维组织。
    1. 在此步骤中，合并来自同一患者的多个解离管中的牙囊组织。
  13. 用1 mL A培养基冲洗滤网。将滤过的细胞悬液在4 °C下以200 × g 离心10分钟。
  14. 弃去上清液，将沉淀重悬于1 mL SFDM（表3）中，并将细胞悬液转移至1.5 mL微量离心管中。
  15. 使用自动细胞计数仪计算细胞浓度。忽略仍存在的细胞团块。
  16. 在4 °C下以200 × g 离心5分钟。

3. 牙齿类器官培养体系的建立（图1A 和 图2A）

  1. 根据获得的细胞数量，计算可接种的孔数。每20 µL液滴应含有20,000个细胞。最终混合物由细胞悬液与BMM按30:70的比例组成。
  2. 移除适量上清液，并用预冷的BMM重悬，使BMM与细胞悬液的比例为70:30，用于接种。例如，当获得200,000个细胞时，接种10个20 µL液滴。因此，将上清液吸除至剩余60 µL细胞悬液，加入140 µL预冷的BMM并重悬。
    1. 缓慢重悬以避免产生气泡。一旦在BMM中重悬，需将微量离心管置于冰上。
      注意：将微量离心管置于冰上至关重要，以防止BMM凝固。
  3. 将20 µL BMM液滴移取至预热的48孔培养板各孔中央。
  4. 将培养板倒置，放入1.9% CO2培养箱（CO2浓度依据SFDM缓冲液要求设定），在37 °C下静置至少20分钟使其凝固。
  5. 向TOM培养基中添加ROCK抑制剂（RI；10 µM）和两性霉素B（0.1%），并在37 °C水浴中预热培养基。
    注意：两性霉素B对光敏感。
  6. 从培养箱中取出48孔板，正向放置，向每个含有BMM液滴/细胞的孔中加入250 µL预热的培养基，然后将培养板放回1.9% CO2培养箱。
  7. 为更换培养基（建议每2–3天一次），将48孔板倾斜约45°角，小心吸除旧培养基，避免触碰BMM液滴，随后加入250 µL新鲜预热的TOM培养基。
    注意：建议每周至少更换三次培养基，以避免关键营养物质和生长因子耗尽。ROCK抑制剂（RI）仅需在初次接种及每次传代初期（见第4节）添加至TOM培养基中，以防止细胞因失巢凋亡而死亡，并促进类器官生长。两性霉素B仅在传代0代（P0）期间添加至培养基中，以防止可能的真菌污染。

4. 牙齿类器官培养物的扩增与传代（图1B 和 图2B）

  1. 在培养第10至14天之间传代类器官。
    注意：避免培养时间过长，因为长期培养可能限制类器官的再生能力和传代能力。仅在初始发育阶段（P0），可根据其生长速率将类器官培养至最多20天（直至直径达到最大约±200 µm）。
  2. 移除需要传代的类器官孔中的培养基。在同一培养条件下，可合并最多四个汇合的孔（见图2C）。
  3. 为收集类器官，每孔直接向基底膜基质（BMM）液滴中加入400 µL冰冻的SFDM，并反复吹打培养基，直至整个BMM液滴完全脱离。
    1. 若需合并多个孔，将第一个孔中的400 µL转移至下一个孔（依此类推），以逐个脱离所有需合并孔中的含类器官的BMM液滴。
  4. 将脱离的BMM-类器官复合物转移至1.5 mL微量离心管中，并重复步骤4.3，直至从所有孔中完全收集类器官结构。
  5. 在4 °C条件下，以200 × g离心5分钟。
  6. 将一份TrypLE Express（添加5 µM RI）预热至37 °C水浴中。每个含类器官的微量离心管需使用400 µL TrypLE Express。
  7. 离心后，弃去上清液，并将沉淀重悬于400 µL TrypLE中。将悬液置于37 °C水浴中孵育12分钟。
  8. 加入400 µL冰冻的SFDM以灭活酶活性，并在4 °C条件下以200 × g离心5分钟。弃去上清液。
  9. 用冰冻的SFDM预包被移液枪头（体积见下文），并重悬类器官沉淀。
    1. 为避免类器官损失，在不影响无菌性的前提下，应尽可能重复使用同一支（已预包被）枪头。
      注意：重悬沉淀所需的SFDM体积取决于获得的类器官结构数量及当前传代次数。
    2. 一般而言，P0至P2-3代（通常类器官数量较少）使用200 µL SFDM；P3-4代或更高代次（通常类器官数量较多）使用700 µL SFDM。
      注意：上述两种操作分别称为“低代次传代法”和“高代次传代法”（见步骤4.10和4.11）。正确应用不同的方法对类器官高效传代至关重要。高代次传代法更容易造成类器官丢失，因此不适用于类器官数量较少的情况（即P0至P2-3代）。然而，当需要有效解离大量类器官时，必须采用高代次传代法。
  10. 低代次传代法：将沉淀重悬于200 µL冰冻的SFDM中。将完全排空的移液枪头尖端抵住微量离心管底部，以减小其开口直径。检查开口是否足够小（吸液速度变慢，液体流动偏移但未堵塞）。吹打5分钟以机械方式破坏类器官结构。
  11. 高代次传代法：使用P1000枪头将沉淀重悬于700 µL冰冻的SFDM中。将一个P200枪头（无滤芯）套在该P1000枪头上，并用冰冻的SFDM预包被。通过调节移液器的体积设定，确保吸取至少90%的液体体积（含类器官），以防止气泡形成。吹打5分钟以机械方式破坏类器官结构。
  12. 在光学显微镜下（4倍放大）观察，确认是否主要获得单细胞及仅有少量未分散的结构。
  13. 向微量离心管中加入500 µL冰冻的SFDM，并通过吹打轻轻混合解离后的细胞悬液与新鲜SFDM。
  14. 将微量离心管垂直置于冰上，静置10分钟，使较大的未分散结构自然沉降。
    注意：必须去除未分散的结构，因其会对类器官传代能力产生负面影响。在类器官起始培养（P0）时，此沉降步骤无需进行。
  15. 收集含有单细胞和小细胞团的上清液（约500–1,000 µL，取决于传代方法），转移至新的微量离心管中，并在4 °C条件下以190 × g离心10分钟。
  16. 使用自动细胞计数仪计算细胞浓度。忽略仍存在的细胞团块。
  17. 计算可接种的孔数，并按照上述方法（第3节）计算合适的细胞悬液与BMM比例。
  18. 向细胞沉淀中加入70%的BMM，并将微量离心管保持在冰上。
    注意：必须将微量离心管置于冰上，以防止BMM凝固。
  19. 继续执行步骤3.3至3.7，并在培养第10至14天之间再次进行传代。

5. 牙齿类器官的冷冻保存

  1. 按照上述传代步骤（步骤4）收集并解离类器官。将细胞悬液在4 °C下以200 × g 离心5分钟。
  2. 弃去上清液，将沉淀重悬于1 mL冻存液中，冻存液含有SFDM（70%）、FBS（20%）和DMSO（10%）。
  3. 将悬液转移至冻存管中，并置于冰上。将冻存管放入冻存盒，随后转移至-80 °C冰箱（至少4小时）。
  4. 在一个月内，将冷冻样品转移至液氮中进行长期（>12个月）保存。

6. 冻存牙类器官的解冻

  1. 开始解冻操作前，将每个冻存管对应一个15 mL离心管置于冰上，每管中加入含20%胎牛血清（FBS）的SFDM培养基10 mL。
  2. 从液氮中取出冻存管并立即置于冰上。
    注意：以下步骤应尽快完成，避免解冻时间过长（>5分钟）以及步骤间间隔时间过长（>5分钟），因为这些延长操作会降低细胞存活率。
  3. 将冻存管放入预热至37 °C的水浴中，直至完全解冻（约1-2分钟）。
  4. 立即将冻存管中的内容物转移至预冷的15 mL离心管中，在4 °C条件下以200 × g离心5分钟。
  5. 吸除9 mL上清液，将剩余的1 mL以200 × g在4 °C离心5分钟。弃去上清液，并用1 mL预冷的SFDM培养基重悬沉淀进行洗涤。
  6. 将细胞悬液转移至1.5 mL微量离心管中，使用自动细胞计数仪进行细胞计数。
  7. 计算可接种的孔数，并按照上述方法（第3节）计算合适的细胞悬液与BMM的比例。
  8. 在4 °C条件下以200 × g离心5分钟。将沉淀以BMM:TOM为70:30的比例重悬，并置于冰上保存。
  9. 继续执行步骤3.3至3.7，并在培养第10至第14天之间进行传代。

7. 牙齿类器官的固定与石蜡包埋

注意：此步骤（包括第8和第9节）也可应用于原代DF组织。

  1. 牙类器官的PFA固定
    1. 按照步骤4.2的方法，移除每个孔中的培养基。
    2. 通过松动BMM液滴（步骤4.3）收集类器官。将BMM-类器官混合物转移至1.5 mL微量离心管中。
    3. 在4 °C下以200 × g离心5分钟。
    4. 移除上清液，加入500 µL的4% PFA，在室温下于旋转摇床上轻柔混匀，孵育至少30分钟（最长1小时）。
      注意：操作PFA时需使用化学通风橱。
    5. 在4 °C下以200 × g离心5分钟。移除上清液，并用PBS在室温下轻轻振荡洗涤类器官沉淀10分钟。
    6. 再重复洗涤类器官沉淀两次（步骤7.1.5）。在4 °C下以200 × g离心5分钟，使固定后的类器官沉淀。
    7. 将沉淀重悬于500 µL的70%乙醇（溶于去离子水中）。可在4 °C下以70%乙醇保存类器官长达1个月。
  2. 牙类器官的琼脂糖包埋与石蜡包埋
    注意：为高效地将类器官包埋于石蜡中，需额外进行琼脂糖包埋步骤。
    1. 将经PFA固定的类器官在70%乙醇中于4 °C下以200 × g离心5分钟，移除上清液。
    2. 在玻璃瓶中用30 mL PBS配制2%琼脂糖溶液。将琼脂糖-PBS混合液放入微波炉加热，直至形成凝胶状结构（约600 W下加热2.5分钟）。
    3. 同时，在另一玻璃瓶中加入30 mL PBS，同样在微波炉中加热（约600 W下加热2.5分钟）。让琼脂糖溶液冷却1分钟。
    4. 剪去P200吸头末端，以便精确操作琼脂糖溶液并避免产生气泡。
    5. 通过在温热的PBS中反复吹打数次，预热P200吸头。
    6. 向类器官沉淀中加入150 µL预热的琼脂糖溶液，轻柔吹打使类器官-琼脂糖混合物悬浮（尽量减少重悬），同时避免引入气泡。
      注意：轻微重悬有助于在切片时更易定位类器官，因为类器官彼此更接近。
    7. 立即将类器官-琼脂糖混合物转移至同一微量离心管盖中，将管水平放置，让琼脂糖凝固（约20分钟，室温）。在此期间，标记包埋盒。
    8. 凝固后，用镊子将琼脂糖凝胶从微量离心管盖中取出，并转移至已标记的包埋盒中。
    9. 将含琼脂糖的包埋盒转移至盛有50%乙醇（溶于去离子水中）的烧杯中。用封口膜覆盖烧杯，防止乙醇蒸发。
      注意：烧杯体积取决于包埋盒的数量。
    10. 在组织处理仪中过夜处理样品。
      注意：由于石蜡在室温下会凝固，后续步骤必须迅速完成。
    11. 在包埋工作站中预热金属加热块15分钟。
    12. 取出包埋盒中含类器官的琼脂糖凝胶，置于预热的加热块上。取下包埋盒盖，暂放一旁以备后用。
    13. 用石蜡填充加热块的剩余空间。
      注意：用镊子检查含类器官的琼脂糖凝胶是否仍位于加热块底部。因其密度较低，可能开始漂浮，导致样本丢失。
    14. 将包埋盒盖置于加热块上方。在冷台上冷却30分钟使其凝固。取下加热块，将石蜡块在4 °C下保存。

8. 牙齿类器官的切片与染色（图2B 和 图3A-C）

  1. 含类器官的石蜡包埋块切片
    1. 使用切片机对石蜡包埋块中的牙类器官进行5 µm厚度的切片。
    2. 将石蜡切片转移至载玻片表面，将载玻片置于37 °C温板上，并用巴斯德吸管加入去离子水覆盖切片。
    3. 让载玻片在室温下过夜干燥。
  2. 牙类器官切片染色
    1. 将载玻片上的类器官切片置于烘箱中，在58 °C下脱蜡1小时。
    2. 在通风橱内，按照以下顺序使用递减浓度的乙醇系列对载玻片上的类器官切片进行再水化：
      二甲苯，2次，每次3分钟
      100% 乙醇，2次，每次3分钟
      95% 乙醇，2次，每次3分钟
      90% 乙醇，2次，每次3分钟
      70% 乙醇，3次，每次3分钟
      注意：使用二甲苯时必须在通风橱中操作。
    3. 在室温下用自来水冲洗载玻片5分钟，随后在室温下用PBS冲洗5分钟。
    4. 将载玻片上的类器官切片放入预热的柠檬酸缓冲液（10 mM 柠檬酸溶于去离子水中，pH 6；置于塑料容器中；在95 °C水浴中预热10分钟）中，在95 °C水浴中孵育30分钟，进行抗原修复。
    5. 让载玻片在室温下冷却20分钟，随后在室温下用PBS冲洗5分钟，再用含0.1% Triton-X的PBS（PBT）在室温下冲洗5分钟。
    6. 使用标记笔在每张载玻片边缘绘制疏水屏障。
    7. 在封闭缓冲液（含1.5 mg/mL甘氨酸、2 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）溶于PBT中）中加入10%驴血清，于室温下封闭至少1小时。
      注：通常每张载玻片需要300 µL封闭缓冲液加10%驴血清。
    8. 将载玻片放入湿盒中。使用一个密封盒，确保所有载玻片均可放入，并在盒底放置数片用水润湿的纸巾，以防止后续染色过程中切片干燥。
    9. 吸除封闭液，加入用封闭缓冲液加1%驴血清配制的一抗（表6），将载玻片覆盖后置于湿盒中，在4 °C下孵育过夜。如有需要，重新绘制标记笔边界。
    10. 在室温下用PBT在旋转摇床上轻轻振荡清洗载玻片3次，每次10分钟。
    11. 加入用封闭缓冲液加1%驴血清配制的二抗（表6），在湿盒中室温孵育1小时。
    12. 吸除封闭液，在室温下用PBT在旋转摇床上轻轻振荡清洗载玻片3次，每次10分钟。
    13. 在盖玻片上滴加含DAPI的抗荧光淬灭封片剂（1至3滴），覆盖于载玻片上的类器官切片上。立即进行成像；如需保存，可在4 °C下最多存放1周。

9. 牙齿类器官的RNA提取与RT-qPCR（图2B和图3D）

  1. 牙类器官的RNA提取
    1. 从每个孔中移除培养基（步骤4.2）。
    2. 通过分离BMM液滴收集类器官（步骤4.3），将BMM-类器官混合物转移至1.5 mL微量离心管中，在4 °C条件下以200 × g离心5分钟。
    3. 弃去上清液，加入350 µL含有1% β-巯基乙醇的裂解缓冲液（材料表），剧烈重悬，置于冰上。
      注意：所有含β-巯基乙醇的操作步骤均须在化学通风橱中进行。
      备注：样品在此步骤可于-80 °C保存最多1个月。继续步骤9.1.4前需将样品置于冰上解冻。
    4. 涡旋振荡样品，直至不再观察到类器官结构。
    5. 按照试剂盒说明书，使用RNA提取试剂盒（材料表）进行RNA提取。
  2. 牙类器官的RT-qPCR检测（表7）
    1. 使用逆转录试剂盒（材料表），按照制造商说明书对RNA19进行逆转录（RT）。
    2. 使用实时荧光定量PCR系统（材料表），基于SYBR Green法对所得cDNA样品进行定量PCR（qPCR）分析19。

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结果

牙类器官的发育
我们提供了一种详细的方案，用于从智齿拔除后获得的人类牙囊（DF）组织中建立类器官培养体系（图1A）。分离的牙囊组织通过酶消化和机械法进行解离。所获得的细胞在基础培养基（BMM）中培养，培养基成分经经验性优化，以促进类器官的最佳发育与生长（牙类器官培养基；TOM）19。

类器官通常在DF细胞接种后2周内形成（P0；图2A）。这些类器官可长期扩增（目前已达11代）（图2B，显示为P4代）。每滴BMM中接种约20,000个细胞（P0代及后续传代均如此）可获得最佳类器官密度（图2C）；而接种细胞数量过高则会导致类器官生长不佳（即密度过高时类器官较小），因生长空间不足（图2D）。最终优化的培养...

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讨论

本方案描述了从人牙组织高效且可重复地生成类器官的方法。据我们所知，这是首个从人牙组织建立当前概念（上皮性）类器官的技术方法。这些类器官可长期扩增，并表现出牙上皮干细胞特性，重现了先前在牙囊（DF）的ERM区室中报道的DESCs7。此外，该类器官还复制了功能性DESC/ERM特征，包括启动成釉细胞分化过程7,25,26。研究结果具有高度稳健性，因为在不同患者的独立类器官系中均获得了可比较的结果19。

在执行该牙类器官方案时，需注意以下几个关键点。首先，在初始接种以及每次传代后，必须添加Rho相关激酶（ROCK）抑制剂Y-27632，以防止单细胞发生失巢凋亡27。此外，在P0阶段的所有培养基更换过程中均需加入两性霉素B，以避免（口腔）真菌污染。第二，建议立即处...

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披露

通讯作者需确保所有作者均已披露任何及所有利益冲突。

致谢

我们衷心感谢鲁汶大学医院口腔颌面外科（MKA）的所有工作人员以及患者，感谢他们在收集新鲜拔除的第三磨牙过程中提供的宝贵帮助。我们还要感谢Reinhilde Jacobs博士和Elisabeth Tijskens博士在样本采集方面给予的支持。本研究得到了鲁汶大学（KU Leuven，BOF）和弗兰德斯科学研究基金会（FWO-Flanders，G061819N）资助项目的资助。L.H. 为弗兰德斯科学研究基金会（FWO）博士研究员（1S84718N）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 微量离心管Eppendorf30120.086
15 mL 离心管Corning430052
2-巯基乙醇Sigma-AldrichM-6250
48 孔平底板Corning3548
50 mL 离心管Corning430290
A83-01Sigma-AldrichSML0788
琼脂糖Lonza50004
牛血清白蛋白（细胞培养级）Serva47330.03
AMELX 抗体Santa Cruzsc-365284
两性霉素 BGibco15200018
B27（不含维生素 A）Gibco12587-010
包埋盒VWR7202191
牛肝过氧化氢酶Sigma-AldrichC100
CD44 抗体Abcamab34485
细胞筛，40 µmFalcon352340
霍乱毒素Sigma-AldrichC8052
柠檬酸Sigma-AldrichC0759
CK14 抗体Thermo Fisher ScientificMA5-11599
胶原酶 IVGibco17104-019
盖玻片VWR6310146
冻存盒Thermo Scientific5100-0001
冻存管Thermo Fisher Scientific375353
二甲基亚砜（DMSO）Sigma-AldrichD2650
分散酶 IISigma-AldrichD4693
DMEM 1:1 F12（无铁）Invitrogen074-90715A
高糖 DMEM 干粉Gibco52100039
脱氧核糖核酸酶（DNase）Sigma-AldrichD5025-15KU
驴血清Sigma-AldrichD9663 - 10ML
包埋工作站，220 至 240 VacThermo Fisher Scientific12587976
无水乙醇，≥99.8%（EtOH）Fisher ChemicalE/0650DF/15
胎牛血清（FBS）Sigma-AldrichF7524
FGF10Peprotech100-26
FGF2（= 碱性 FGF）R&D Systems234-FSE-025
FGF8PeprotechAF-100-25
GenElute 哺乳动物总 RNA 小量提取试剂盒Sigma-AldrichRTN350-1KT包含溶于裂解缓冲液中的 1% β-巯基乙醇
玻璃巴斯德吸管Niko Mechanisms170-40050
甘氨酸VWR101194M
HEPESSigma-AldrichH4034
IGF-1PeproTech100-11
InSolution Y-27632（ROCK 抑制剂，RI）Sigma-Aldrich688001
牛胰岛素Sigma-AldrichI6634
ITGA6 抗体Sigma-AldrichHPA012696
L-谷氨酰胺Gibco25030024
Matrigel（生长因子减少型；无酚红）Corning15505739
显微镜载玻片Thermo Fisher ScientificJ1800AMNZ
Millex-GV 注射器滤器，0.22 μmMilliporeSLGV033R
最低必需培养基伊格尔（αMEM）Sigma-AldrichM4526
小鼠 IgG（Alexa 555）二抗Thermo Fisher ScientificA-31570
N2Gibco17502-048
N-乙酰-L-半胱氨酸Sigma-AldrichA7250
烟酰胺Sigma-AldrichN0636
NogginPeproTech120-10C
P63 抗体Abcamab124762
防染笔（Pap Pen）Sigma-AldrichZ377821-1EA标记笔
多聚甲醛（PFA），16%Merck8.18715
青霉素 G 钠盐Sigma-AldrichP3032
青霉素-链霉素（Pen/Strep）Gibco15140-122
培养皿Corning353002
磷酸盐缓冲液（PBS）Gibco10010-015
移液器（P20、P200、P1000）Eppendorf 或其他品牌2231300006
塑料移液管（3.5 mL）Sarstedt86.1171.001
兔 IgG（Alexa 488）二抗Thermo Fisher ScientificA21206
RSPO1PeproTech120-38
SB202190（p38i）Biotechne (Tocris)1264
手术刀（手术刀片）Swann-Morton207
SHHR&D Systems464-SH-200
硅胶模具（加热块）VWR720-1918
氯化钠（NaCl）BDH102415K
碳酸氢钠（NaHCO3）Merck106329
丙酮酸钠（C3H3NaO3）Sigma-AldrichP-5280
SOX2 抗体Abcamab92494
StepOnePlusThermo Fisher Scientific实时荧光定量 PCR 系统
Stericup-GP，0.22 µmMilliporeSCGPU02RE
Steriflip-GP 无菌离心管顶部滤器，0.22 μmMilliporeSCGP00525
带滤芯的无菌 1000 μL 移液器吸头Greiner740288
带滤芯的无菌 20 μL 移液器吸头Greiner774288
带或不带滤芯的无菌 200 μL 移液器吸头Greiner739288
无菌 H2OFreseniusB230531
硫酸链霉素Sigma-AldrichS6501
Superscript III 第一链合成预混液Invitrogen11752-050逆转录试剂盒
组织处理仪Thermo Scientific12505356
转铁蛋白Serva36760.01
吐温 X-100SigmaT8787-50ML
TrypLE expressGibco12605-010
Vectashield 封片剂 + DAPILabconsult NVH-1200含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂
WNT3aBiotechne (Tocris)5036-WN-500
二甲苯，99%，用于生化与组织学VWR2,89,75,325

参考文献

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