我们提出一种从人类牙齿开始建立上皮类器官培养的方案。这些类器官具有强大的可扩增性，并能重现牙齿上皮干细胞的特性，包括其成釉细胞分化能力。这一独特的类器官模型为研究人类牙科（干细胞）生物学提供了有前景的工具，并有望应用于牙齿再生策略。
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摘要
摘要
牙齿在人类生活中具有重要作用，不仅关乎食物咀嚼和言语功能，也影响心理福祉。目前关于人类牙齿发育与生物学的知识仍十分有限，尤其是对牙源性上皮干细胞及其功能的了解甚少。我们成功建立了一种新型类器官模型，其起源于人类牙齿组织（即从拔除的智齿中分离的牙囊组织）。该类器官可长期稳定扩增，并在标志物表达及功能活性方面重现了拟议中的人类牙源性上皮干细胞区室特征。特别是，这些类器官能够启动成釉细胞分化过程，该过程与体内发生的成釉细胞分化相似 体内 在成釉过程中。这一独特的类器官模型不仅为研究人类牙齿发育和牙科病理学提供了强有力的工具，还可能为牙齿再生治疗开辟新途径。基于这一新型类器官模型，以生物牙替代缺失牙齿，可能成为当前合成材料种植牙标准疗法的一种极具吸引力的替代方案。
引言
牙齿在咀嚼食物、言语和心理福祉（自我形象）方面具有重要作用。1人类牙齿由矿化程度不同、密度和硬度各异的组织构成。牙釉质是牙冠的主要组成部分，也是人体中矿化程度最高的组织。在牙齿发育过程中，牙釉质形成（成釉作用）时，牙源性上皮干细胞（DESCs）会分化为成釉细胞（即釉质形成细胞）。一旦牙釉质形成，由于牙齿萌出初期成釉细胞发生凋亡而丢失，牙釉质极少能够被修复或再生。1目前，因外伤或细菌性疾病导致的牙釉质组织损伤主要通过使用合成材料进行修复；然而，这些材料存在诸多重要缺陷，如微渗漏、骨整合与固位能力较差、使用寿命有限，以及无法实现完全功能性修复等。2因此，建立一种稳定且可靠的人类DESCs培养体系，使其具备生成成釉细胞并产生矿化组织的潜能，将是牙科再生领域的一大重要进展。
关于人类DESC表型及其生物学功能的知识十分有限3,4,5有趣的是，有人提出人类牙齿的牙上皮干细胞（DESCs）可能存在于马拉瑟上皮剩余（ERM）中，这些细胞簇位于包围未萌出牙齿的牙囊（DF）内，并在牙齿萌出后仍存留于牙根周围的牙周膜中。1....
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方案
本研究所述所有方法均已获得鲁汶大学医院/鲁汶大学伦理委员会（13/0104U）批准。在获得患者知情同意后，收集拔除的第三磨牙（智齿）。
1. 准备工作
- 将一块48孔培养板在37 °C、1.9% CO2的培养箱中预温15-20小时。
- 在进行步骤2.1之前，将一份Matrigel（生长因子减少型，无酚红，下文简称基底膜基质，BMM）在冰上（4 °C）融化至少2小时。
注意：避免BMM反复冻融。可将BMM在冰上融化15-20小时后，以1 mL分装至微量离心管中，于-20 °C保存。 - 将离心机预冷至4 °C。
- 准备培养基，并通过0.22 µm滤器过滤。以下体积基于通常同时拔除的四颗第三磨牙所收集的牙囊组织（DFs）。
- 配制20 mL牙囊收集培养基（表1）：含10%胎牛血清（FBS）、0.5%两性霉素B和1%青霉素-链霉素的最低必需培养基（αMEM）。取4 mL牙囊收集培养基转移至15 mL离心管中，并将离心管置于冰上。
注意：每位患者采集样本时，一个15 mL离心管足以容纳四颗第三磨牙的样本。 - 使用无血清定义培养基（SFDM；表3）配制20 mL牙器官样培养基（下文简称TOM；表2
- 配制20 mL牙囊收集培养基（表1）：含10%胎牛血清（FBS）、0.5%两性霉素B和1%青霉素-链霉素的最低必需培养基（αMEM）。取4 mL牙囊收集培养基转移至15 mL离心管中，并将离心管置于冰上。
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结果
牙类器官的发育
我们提供了一种详细的方案，用于从智齿拔除后获得的人类牙囊（DF）组织中建立类器官培养体系（图1A）。分离的牙囊组织通过酶消化和机械法进行解离。所获得的细胞在基础培养基（BMM）中培养，培养基成分经经验性优化，以促进类器官的最佳发育与生长（牙类器官培养基；TOM）19。
类器官通常在DF细胞接种后2周内形成（P0；图2A）。这些类器官可长期扩增（目前已达11代）（图2B，显示为P4代）。每滴BMM中接种约20,000个细胞（P0代及后续传代均如此）可获得最佳类器官密度（图2C）；而接种细胞数量过高则会导致类器官生长不佳（即密度过高时类器官较小），因生长空间不足（图2D）。最终优化的培养.......
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讨论
本方案描述了从人牙组织高效且可重复地生成类器官的方法。据我们所知，这是首个从人牙组织建立当前概念（上皮性）类器官的技术方法。这些类器官可长期扩增，并表现出牙上皮干细胞特性，重现了先前在牙囊（DF）的ERM区室中报道的DESCs7。此外，该类器官还复制了功能性DESC/ERM特征，包括启动成釉细胞分化过程7,25,26。研究结果具有高度稳健性，因为在不同患者的独立类器官系中均获得了可比较的结果19。
在执行该牙类器官方案时，需注意以下几个关键点。首先，在初始接种以及每次传代后，必须添加Rho相关激酶（ROCK）抑制剂Y-27632，以防止单细胞发生失巢凋亡27。此外，在P0阶段的所有培养基更换过程中均需加入两性霉素B，以避免（口腔）真菌污染。第二，建议立即处.......
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披露
通讯作者需确保所有作者均已披露任何及所有利益冲突。
致谢
我们衷心感谢鲁汶大学医院口腔颌面外科（MKA）的所有工作人员以及患者，感谢他们在收集新鲜拔除的第三磨牙过程中提供的宝贵帮助。我们还要感谢Reinhilde Jacobs博士和Elisabeth Tijskens博士在样本采集方面给予的支持。本研究得到了鲁汶大学（KU Leuven，BOF）和弗兰德斯科学研究基金会（FWO-Flanders，G061819N）资助项目的资助。L.H. 为弗兰德斯科学研究基金会（FWO）博士研究员（1S84718N）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 微量离心管 | Eppendorf | 30120.086 | |
| 15 mL 离心管 | Corning | 430052 | |
| 2-巯基乙醇 | Sigma-Aldrich | M-6250 | |
| 48 孔平底板 | Corning | 3548 | |
| 50 mL 离心管 | Corning | 430290 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| 琼脂糖 | Lonza | 50004 | |
| 牛血清白蛋白（细胞培养级） | Serva | 47330.03 | |
| AMELX 抗体 | Santa Cruz | sc-365284 | |
| 两性霉素 B | Gibco | 15200018 | |
| B27（不含维生素 A） | Gibco | 12587-010 | |
| 包埋盒 | VWR | 7202191 | |
| 牛肝过氧化氢酶 | Sigma-Aldrich | C100 | |
| CD44 抗体 | Abcam | ab34485 | |
| 细胞筛，40 µm | Falcon | 352340 | |
| 霍乱毒素 | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| 柠檬酸 | Sigma-Aldrich | C0759 | |
| CK14 抗体 | Thermo Fisher Scientific | MA5-11599 | |
| 胶原酶 IV | Gibco | 17104-019 | |
| 盖玻片 | VWR | 6310146 | |
| 冻存盒 | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| 冻存管 | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| 分散酶 II | Sigma-Aldrich | D4693 | |
| DMEM 1:1 F12（无铁） | Invitrogen | 074-90715A | |
| 高糖 DMEM 干粉 | Gibco | 52100039 | |
| 脱氧核糖核酸酶（DNase） | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | |
| 驴血清 | Sigma-Aldrich | D9663 - 10ML | |
| 包埋工作站，220 至 240 Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| 无水乙醇，≥99.8%（EtOH） | Fisher Chemical | E/0650DF/15 | |
| 胎牛血清（FBS） | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| FGF2（= 碱性 FGF） | R&D Systems | 234-FSE-025 | |
| FGF8 | Peprotech | AF-100-25 | |
| GenElute 哺乳动物总 RNA 小量提取试剂盒 | Sigma-Aldrich | RTN350-1KT | 包含溶于裂解缓冲液中的 1% β-巯基乙醇 |
| 玻璃巴斯德吸管 | Niko Mechanisms | 170-40050 | |
| 甘氨酸 | VWR | 101194M | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| IGF-1 | PeproTech | 100-11 | |
| InSolution Y-27632（ROCK 抑制剂，RI） | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| 牛胰岛素 | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| ITGA6 抗体 | Sigma-Aldrich | HPA012696 | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030024 | |
| Matrigel（生长因子减少型；无酚红） | Corning | 15505739 | |
| 显微镜载玻片 | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Millex-GV 注射器滤器，0.22 μm | Millipore | SLGV033R | |
| 最低必需培养基伊格尔（αMEM） | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| 小鼠 IgG（Alexa 555）二抗 | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| N-乙酰-L-半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| 烟酰胺 | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| P63 抗体 | Abcam | ab124762 | |
| 防染笔（Pap Pen） | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | 标记笔 |
| 多聚甲醛（PFA），16% | Merck | 8.18715 | |
| 青霉素 G 钠盐 | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| 青霉素-链霉素（Pen/Strep） | Gibco | 15140-122 | |
| 培养皿 | Corning | 353002 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Gibco | 10010-015 | |
| 移液器（P20、P200、P1000） | Eppendorf 或其他品牌 | 2231300006 | |
| 塑料移液管（3.5 mL） | Sarstedt | 86.1171.001 | |
| 兔 IgG（Alexa 488）二抗 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| RSPO1 | PeproTech | 120-38 | |
| SB202190（p38i） | Biotechne (Tocris) | 1264 | |
| 手术刀（手术刀片） | Swann-Morton | 207 | |
| SHH | R&D Systems | 464-SH-200 | |
| 硅胶模具（加热块） | VWR | 720-1918 | |
| 氯化钠（NaCl） | BDH | 102415K | |
| 碳酸氢钠（NaHCO3） | Merck | 106329 | |
| 丙酮酸钠（C3H3NaO3） | Sigma-Aldrich | P-5280 | |
| SOX2 抗体 | Abcam | ab92494 | |
| StepOnePlus | Thermo Fisher Scientific | 实时荧光定量 PCR 系统 | |
| Stericup-GP，0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP 无菌离心管顶部滤器，0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| 带滤芯的无菌 1000 μL 移液器吸头 | Greiner | 740288 | |
| 带滤芯的无菌 20 μL 移液器吸头 | Greiner | 774288 | |
| 带或不带滤芯的无菌 200 μL 移液器吸头 | Greiner | 739288 | |
| 无菌 H2O | Fresenius | B230531 | |
| 硫酸链霉素 | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Superscript III 第一链合成预混液 | Invitrogen | 11752-050 | 逆转录试剂盒 |
| 组织处理仪 | Thermo Scientific | 12505356 | |
| 转铁蛋白 | Serva | 36760.01 | |
| 吐温 X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| TrypLE express | Gibco | 12605-010 | |
| Vectashield 封片剂 + DAPI | Labconsult NV | H-1200 | 含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂 |
| WNT3a | Biotechne (Tocris) | 5036-WN-500 | |
| 二甲苯，99%，用于生化与组织学 | VWR | 2,89,75,325 |
参考文献
- Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development (Cambridge). 147 (2), (2020).
- Arrow, P. Dental enamel defects, caries experience and oral health....
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