本文直接比较了集成在同一显微镜平台上的受激拉曼散射（SRS）和相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）在分辨率、灵敏度和成像对比度方面的性能。结果表明，CARS 具有更高的空间分辨率，SRS 能提供更优的对比度和光谱分辨率，而两种方法的灵敏度相似。
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本文内容
摘要
摘要
受激拉曼散射（SRS）和相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微技术是目前应用最广泛的相干拉曼散射成像技术。高光谱SRS和CARS成像可在每个像素点提供拉曼光谱信息，从而更有效地分辨不同化学成分。尽管这两种技术均需要两束激发激光，但它们的信号检测方式和光谱特性存在显著差异。本实验方案的目标是在同一平台上实现高光谱SRS和CARS成像，并对这两种显微技术在不同生物样品成像中的表现进行比较。采用光谱聚焦方法，利用飞秒激光器获取光谱信息。通过标准化学样品，在相同的激发条件下（即样品处的激光功率、像素驻留时间、物镜、脉冲能量），比较SRS与CARS的灵敏度、空间分辨率和光谱分辨率。同时并列对比CARS与SRS在生物样品成像中的对比度差异。对CARS与SRS性能的直接比较将有助于为化学成像选择最优的成像模式。
引言
拉曼散射现象最早于1928年由C. V. Raman观察到1。当入射光子与样品相互作用时，可能发生自发的非弹性散射事件，其中光子的能量变化与被分析化学物质的振动跃迁相匹配。该过程无需使用化学标记物，因此成为一种多功能、无标记的化学分析工具，同时可最大限度地减少对样品的干扰。尽管具有上述优势，自发拉曼散射的散射截面较低（通常比红外[IR]吸收截面低1011倍），这导致分析需要较长的采集时间2。因此，提高拉曼散射过程的灵敏度对于推动拉曼技术在实时成像中的应用至关重要。
显著增强拉曼散射灵敏度的有效方法之一是利用相干拉曼散射（CRS）过程，该过程通常使用两束激光脉冲激发分子的振动跃迁3,4。当两束激光之间的光子能量差与样品分子的振动模式相匹配时，将产生强烈的拉曼信号。用于成像的两种最常见的CRS过程是相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）和受激拉曼散射（SRS）5。在过去的二十年中，技术的发展已使CARS和SRS显微技术成为对生物样品中化学变化进行无标记定量分析和解析的有力工具。
基于CARS显微技术的化学成....
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方案
1. 高光谱 CRS 成像的仪器设置
注意：产生相干拉曼散射（CRS）信号需要使用高功率（即3B类或4类）激光器。在如此高峰值功率下工作时，必须遵守安全规程，并始终佩戴适当的个人防护装备（PPE）。实验前请查阅相关安全文档。本方案重点介绍光路设计、飞秒脉冲的啁啾调节以及成像条件的优化。本超光谱CRS显微镜的一般光学布局如图1所示。此处展示的配置是CRS显微镜多种现有配置之一。本方案所使用的CRS显微镜系统基于双输出飞秒激光源和激光扫描显微镜构建。
- 确保激光光源提供两束飞秒脉冲序列（脉宽120 fs），重复频率为80 MHz，其中一束波长固定在1,045 nm，用作斯托克斯光束，另一束波长可在680至1,300 nm范围内调谐，用作泵浦光束。通过光路延迟差对输出脉冲进行同步。使用显微镜框架构建成像平台。
- 设计光路
- 为控制样品处的激光功率，对每束激光使用半波片和偏振分束器（PBS）组合。
- 在斯托克斯激光光路中安装一个声光调制器（AOM）。使用焦距为150 mm的透镜将光束聚焦进入AOM，并对0级衍射光进行重新准直th 使用焦距为400 mm的透镜进行有序输出。
- 使用相同的透镜组合（150 mm 和 400 mm 焦距）扩泵浦光束，使泵浦光束尺寸与斯托克斯光....
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结果
光谱分辨率的比较
图2比较了使用DMSO样品时，高光谱受激拉曼散射（SRS）（图2A）与相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）（图2B）显微技术的光谱分辨率。对于SRS光谱，采用两个洛伦兹函数（见实验方案步骤2.3）对光谱进行拟合，并利用2,913 cm-1峰得到14.6 cm-1的分辨率。对于CARS，则使用带有高斯背景的双峰拟合函数（见实验方案步骤2.3）进行拟合，获得17.1 cm-1的光谱分辨率。这些结果表明，在相同的测量条件下，SRS的光谱分辨率优于CARS。CARS光谱分辨率降低主要归因于非共振背景的参与。此外，发现SRS和CARS的对称峰（2,913 cm-1）与非对称峰（2,995 cm-1）的峰强比存在显著差异。这是由于信号与三阶非线性光学 susceptibilit y之间的相关性不同所致，如公.......
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讨论
本文所述方案介绍了多模态相干拉曼散射（CRS）显微镜的构建方法，以及相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）与受激拉曼散射（SRS）成像的直接比较。在显微镜构建过程中，关键步骤包括空间与时间上的光束重叠以及光束尺寸优化。建议在进行生物成像前，使用DMSO等标准样品优化信噪比并校准拉曼位移。CARS与SRS图像的直接比较表明，CARS具有更高的空间分辨率，而SRS则提供更优的光谱分辨率和更清晰的化学对比度。CARS与SRS的检测限相似。
CARS 和 SRS 成像采用高能量脉冲激光进行激发。这使得该平台能够整合其他非线性光学成像模式，如多光子激发荧光、谐波产生和瞬态吸收，以实现额外的化学对比度28,39。
CARS 和 SRS 已被广泛用于高化学选择性地研究脂质组成。然而，这些技术的应用不仅限于脂质的定量分析。SRS 已被应用于药物分布42、蛋白质合成
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究得到了普渡大学化学系启动基金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 二维振镜扫描系统 | Thorlabs | GVS002 | |
| 声光调制器 | Isomet | M1205-P80L-0.5 | |
| 声光调制器驱动器 | Isomet | 532B-2 | |
| 数据采集卡 | National Instruments | PCle 6363 | 定制滤光片（980 sp） |
| 延迟线平台 | Zaber | X-LSM050A | |
| 重水 | Millipore Sigma | 151882-100G | |
| 用于光束合束的二向色镜 | Thorlabs | DMLP1000 | |
| 用于信号分离的二向色镜 | Semrock | FF776-Di01-25x36 | |
| 二甲基亚砜 | MiliporeSigma | 200-664-3 | |
| MIA PaCa-2 细胞 | ATCC | CRL-1420 | |
| 飞秒激光系统 | Spectral Physics | InSightX3+ | |
| 用于CARS的滤光片 | Chroma | AT655/30m | |
| 用于SRS的滤光片 | Chroma | ET980sp | |
| 函数发生器 | Rigol | DG1022Z | |
| 玻璃棒 | Lattice Electro Optics | SF-57 | |
| 半波片 | Newport | 10RP02-51; 10RP02-46 | |
| LabVIEW 2020 | National Instruments | 这是图像采集软件 | |
| 锁相放大器 | Zurich Instrument | HF2LI | |
| 显微镜机身 | Olympus | BX51W1 | |
| 物镜 | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Origin Pro 2019b | OriginLab Corporation | 这是光谱拟合软件 | |
| 示波器 | Tektronix | TBS2204B | |
| 光电二极管 | Hamamatsu | S3994-01 | |
| PMT探测器 | Hamamatsu | H7422P-40 | |
| PMT电压放大器 | Advanced Research Instrument Corp. | PMT4V3 | |
| 偏振分束立方体 | Thorlabs | PBS255 | |
| 接线端子板 | National Instruments | BNC-2110 |
参考文献
- Raman, C. V. A change of wave-length in light scattering. Nature. 121 (3051), 619(1928).
- Li, S., Li, Y., Yi, R., Liu, L., Qu, J. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy and its applications. Frontiers in Physics. 8, 515(2020).
- Evans, C. L., Xie, X. S.
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重印与许可
