高光谱受激拉曼散射与相干反斯托克斯拉曼散射显微镜在化学成像中的应用的直接比较

Summary

本文直接比较了集成到同一显微镜平台中的受激拉曼散射（SRS）和相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）的分辨率、灵敏度和成像对比度。结果表明，CARS具有更好的空间分辨率，SRS具有更好的对比度和光谱分辨率，并且两种方法具有相似的灵敏度。

Abstract

受激拉曼散射（SRS）和相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微镜是使用最广泛的相干拉曼散射成像技术。高光谱SRS和CARS成像在每个像素处提供拉曼光谱信息，从而可以更好地分离不同的化学成分。虽然这两种技术都需要两个激发激光器，但它们的信号检测方案和光谱特性却大不相同。该协议的目标是在单个平台上执行高光谱SRS和CARS成像，并比较用于成像不同生物样品的两种显微镜技术。采用光谱聚焦方法，利用飞秒激光器获取光谱信息。通过使用标准化学样品，比较了SRS和CARS在相同激发条件下的灵敏度，空间分辨率和光谱分辨率（即样品处的功率，像素停留时间，物镜，脉冲能量）。将CARS和SRS的成像对比度并列并进行比较。直接比较CARS和SRS性能将允许最佳选择化学成像模式。

Introduction

拉曼散射现象于1928年由C.V.拉曼¹首次观测到。当入射光子与样品相互作用时，可以自发发生非弹性散射事件，其中光子的能量变化与所分析化学物质的振动跃迁相匹配。该过程不需要使用化学标签，使其成为多功能，无标签的化学分析工具，同时最大限度地减少样品扰动。尽管有其优点，但自发拉曼散射的散射截面较低（通常比红外[IR]吸收横截面低^{10 11} ），这需要较长的采集时间进行分析²。因此，寻求提高拉曼散射过程的灵敏度对于推动拉曼技术进行实时成像至关重要。

大大提高拉曼散射灵敏度的一种有效方法是通过相干拉曼散射（CRS）过程，其中两个激光脉冲通常用于激发分子振动转变^3，4。当两种激光器之间的光子能量差与样品分子的振动模式相匹配时，将产生强烈的拉曼信号。用于成像的两种最常用的稀而实过程是相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）和受激拉曼散射（SRS）⁵。在过去的二十年中，技术发展已经使CARS和SRS显微镜技术成为无标记定量和阐明生物样品中化学变化的强大工具。

CARS显微镜的化学成像可以追溯到1982年，当时激光扫描首....

Protocol

1. 用于高光谱稀而实成像的仪器设置

注意:CRS信号的产生需要使用高功率（即3B级或4级）激光器。在如此高的峰值功率下工作时，必须解决安全协议问题，并且必须始终穿戴适当的个人防护装备（PPE）。在试验前查阅适当的文档。该协议侧重于设计光束路径、啁啾飞秒脉冲和优化成像条件。该高光谱稀而实显微镜的一般光学布局如图 1所示。此处显示的配置是稀而实显微镜的众多现有配置之一。该协议中使用的CRS显微镜系统基于双输出飞秒激光源和激光扫描显微镜。

1. 确保激光源提供两个飞秒脉冲序列（120 fs宽度），重复率为80 MHz，包括1，045 nm处的固定波长用作斯托克斯光束，以及680至1，300 nm的可调波长用作泵浦光束。将输出脉冲与光学延迟差同步。使用显微镜框架构建成像平台。
2. 设计光束路径
   1. 要控制样品的激光功率，请对每个激光束使用半波片和偏振分束器（PBS）组合。
   2. 在斯托克斯激光束路径中安装声光调制器（AOM）。将焦距为 150 mm 的镜头的光束聚焦到 AOM 中，并使用⁴⁰⁰ mm 焦距镜头重新组合 0 阶输出。
   3. 使用相同的透镜对（150 mm 和 400 mm 焦距）扩展泵浦光束，使激光束尺寸与 Stokes 相匹配。
   4. 将泵和斯托克斯光束路径中的4....

Results

光谱分辨率的比较
图2 比较了使用DMSO样品的高光谱SRS（图2A）和CARS（图2B）显微镜的光谱分辨率。对于SRS频谱，应用两个洛伦兹函数（参见协议步骤2.3）来拟合光谱，并使用2，^{913 cm-1} 峰获得14.6 ^cm-1 的分辨率。对于CARS，使用具有高斯背景的双峰拟合函数（参见协议步骤2.3）进行拟合，其光谱分辨率为17.1 ^cm-1。这些结果表明，在相同的测量条件下，SRS具有比CARS更好的光谱分辨率。CARS中光谱分辨率的降低主要是由于非共振背景的参与。此外，还发现SRS和CARS的对称（2，^{913 cm-1}）和不对称（2，995 ^cm-1）峰比差异很大。这是由于信号与三阶非线性光学敏感性的相关性不同，如方程式（1）和（2）所.......

Discussion

这里介绍的协议描述了多模态稀而实显微镜的构造以及CARS和SRS成像之间的直接比较。对于显微镜结构，关键步骤是空间和时间光束重叠以及光束尺寸优化。建议在生物成像之前使用DMSO等标准样品，以优化SNR和校准拉曼位移。CARS和SRS图像之间的直接比较表明，CARS具有更好的空间分辨率，而SRS具有更好的光谱分辨率和更少的复杂化学对比度。汽车和SRS都有相似的检测限。

CARS和SRS成像使用高能脉冲激光器进行激发。这使得该平台能够集成其他非线性光学成像模式，例如多光子激发荧光，谐波产生和瞬态吸收，以获得额外的化学对比度^28，39。

CARS和SRS已被广泛用于研究具有高化学选择性的脂质组成。然而，这些技术并不局限于量化脂质。SRS已被应用于绘制药物分布^图42，蛋白质合成⁴³和DNA^.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2D振镜扫描仪套装	Thorlabs	GVS002
声光调制器	Isomet	M1205-P80L-0.5
AOM驱动器	Isomet	532B-2
数据采集卡	National Instruments	PCle 6363	定制订购滤波器（980 sp）
延迟级	Zaber	X-LSM050A
Deuterium氧化物	Millipore Sigma	151882-100G
用于光束组合的二向色镜	Thorlabs	DMLP1000
用于信号分离的二向色镜	Semrock	FF776-Di01-25x36
DMSO	MiliporeSigma	200-664-3
MIA PaCa 2 Cells	ATCC	CRL-1420
飞秒激光系统	光谱物理	InSightX3+
滤光片 CARS	Chroma	AT655/30m
滤光片 SRS	Chroma	ET980sp
函数发生器	Rigol	DG1022Z
玻璃棒	晶格电光	SF-57
半波片	Newport	10RP02-51;10RP02-46
LabVIEW 2020	美国国家仪器公司		这是图像采集软件
锁相放大器	苏黎世仪器	HF2LI
显微镜外壳	奥林巴斯	BX51W1
物镜	奥林巴斯	UPLSAPO60XW
Origin Pro 2019b	OriginLab Corporation		这是光谱拟合软件
示波器	泰克	TBS2204B
光电二极管	滨松	S3994-01
PMT 探测器	滨松	H7422P-40
PMT 电压放大器	Advanced Research Instrument Corp.	PMT4V3
偏振分光镜立方体	Thorlabs	PBS255
接线端子	National Instruments	BNC-2110