透明化大脑中星形胶质细胞与神经元空间相互作用的研究

摘要

结合病毒载体转导与基于CLARITY方法的脑组织透明化技术，可实现对大量神经元和星形胶质细胞的同时观察与研究。

摘要

将病毒载体转导与基于CLARITY方法的组织透明化技术相结合，可实现对多种脑细胞类型及其相互作用的同步研究。病毒载体转导能够在同一组织内以不同的荧光颜色标记多种细胞类型，从而根据基因表达、细胞活动或投射特征对细胞进行鉴定。通过改进的CLARITY实验方案，星形胶质细胞和神经元的潜在样本量已扩大了2至3个数量级。应用CLARITY技术可实现对完整星形胶质细胞的成像，这类细胞体积过大，无法在组织切片中完整呈现，而该技术使得细胞体及其全部突起均可被观察。此外，该方法还提供了研究星形胶质细胞与不同神经元细胞类型之间空间相互作用的机会，例如每个星形胶质细胞功能域内的锥体神经元数量，或星形胶质细胞与特定抑制性神经元群体之间的空间邻近关系。本文详细描述了这些方法的具体应用步骤。

引言

近年来，关于星形胶质细胞功能及其与神经元回路相互作用的认识显著增加。星形胶质细胞能够影响可塑性^1,2，协助神经元损伤后的恢复^3,4，甚至诱导 从头合成 神经元的长时程增强，近期研究揭示了星形胶质细胞在记忆获取和奖赏行为中的重要作用，这些功能此前被认为仅由神经元介导^5,6,7星形胶质细胞研究中一个特别值得关注的特征是细胞的空间排布，这些细胞在海马体及其他脑结构中维持着独特的空间组织形式^8,9,10与在细胞胞体之间相互交织的神经元树突不同，海马星形胶质细胞占据视觉上可区分的区域，其突起之间仅有轻微重叠，形成明确的结构域^8,11,12....

方案

实验方案已获希伯来大学动物护理与使用委员会批准，并符合美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》的规定。

1. 病毒载体转导

注意：病毒载体转导用于在脑内表达荧光蛋白。

1. 使用图谱（例如 Allen 脑图谱）定位目标区域的相关坐标。
   注意：可在网络上找到三维图谱（例如， http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer）。
2. 通过立体定位手术，将病毒载体注射至相应的脑结构中。详细方案参见⁹。
3. 等待 3–6 周以实现荧光蛋白表达。
   注意：如果仅需标记细胞体，则较短时间即可；但如果研究问题涉及轴突投射，则需要更长时间，因为荧光蛋白在轴突中的表达所需时间更长，而轴突可长达数毫米。
4. 预先验证荧光蛋白表达的特异性和穿透性（包括病毒表达和转基因动物）（图 1A）。在进行 CLARITY 操作前，至少预留一个脑组织用于制备薄切片，并确保荧光蛋白表达在目标细胞特征上既强且特异。

2. CLARITY

结果

成功透明化较厚的脑组织切片后，可提出一系列新问题，这些问题涉及大群细胞的特性，而非单个细胞或邻近细胞群的特性。为获得理想结果，应严格遵循CLARITY实验方案，因为需要考虑多种参数以减少样本间的差异（例如透明度百分比、荧光信息、组织膨胀程度参数）。

图1 描述了从荧光蛋白表达验证到透明化方法各个阶段的完整透明化流程。图2 描述了如何为透明化组织制备成像用腔室，适用于双光子或共聚焦显微镜下的成像。本方案所需的材料与其他腔室制备方案相比极为廉价。

图3展示了视频1中描述的立方体，其中显示了小鼠海马CA1区域透明化脑片中超过300个星形胶质细胞。图4展示了视频2中描述的立方体，其中在厚的透明组织中同时显示了星形胶质细胞和兴奋性神经.......

讨论

组织透明化技术为脑科学研究提供了一种革命性工具，使得人们能够提出以往无法探究的问题。CLARITY技术如今能够利用特异性的荧光染料，对全细胞群体或长距离连接特征进行靶向研究，而不再局限于少数细胞、单个细胞甚至单个突触的特性分析。

荧光蛋白表达与CLARITY技术联用的结果并非非此即彼；多种因素可能干扰该过程，导致结果不理想。首先，必须预先验证荧光蛋白的表达情况。由于CLARITY过程会造成部分信息丢失，因此足够的荧光蛋白表达量对于CLARITY流程结束时图像的有效性至关重要。其次，经颅灌注操作必须谨慎进行，确保血液完全从脑组织中清除，因为血液的自发荧光会在厚切片中产生不可靠的数据。第三，方案中讨论的所有参数必须在透明化过程的每一步中精确控制，例如聚合前水凝胶溶液中的残余O₂或各阶段温度控制不准确，均会阻碍活性物质之间的化学反应发生。

既往方案^17,22建议在HS中使用不同浓度的丙烯酰胺。丙.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AAV1-GFAP::TdTomato	ELSC 载体核心设施 (EVCF)		用于检测星形胶质细胞的病毒载体
AAV5-CaMKII::eGFP	ELSC 载体核心设施 (EVCF)		用于检测神经元的病毒载体
AAV5-CaMKII::H2B-eGFP	ELSC 载体核心设施 (EVCF)		用于检测神经元细胞核的病毒载体
AAV5-CaMKII::TdTomato	ELSC 载体核心设施 (EVCF)		用于检测神经元的病毒载体
丙烯酰胺 (40%)	Bio-rad	#161-0140
双丙烯酰胺 (2%)	Bio-rad	#161-0142
硼酸	Sigma	#B7901	分子量 - 61.83 g/mol
共聚焦显微镜，扫描型，FV1000	Olympus		4x 物镜 (UPlanSApo, 0.16 NA)
Imaris 软件	Bitplane, 英国		一种可用于图像三维分析的软件
NaOH	Sigma	#S5881
PBS
4% PFA	EMS	#15710
RapiClear	SunJin 实验室	#RC147002
RapiClear CS	SunJin 实验室	#RCCS002
SDS	Sigma	#L3771
SyGlass 软件			一种可通过虚拟现实技术进行图像三维分析的软件
Tris 碱 1 M	Bio-rad	#002009239100	分子量 - 121.14 g/mol
吐温 X-100	ChemCruz	#sc-29112A
双光子显微镜	Neurolabware		钛宝石激光器 (Chameleon Discovery TPC, Coherent)，GaAsP 光电倍增管 (Hamamatsu, H10770-40)，带通滤光片 (Semrock)，水浸 16x 物镜 (Nikon, 0.8 NA)
VA-044 引发剂	Wako	#011-19365