本方案介绍了一种从原代肺组织中获取人肺类器官、扩增肺类器官并诱导其向近端分化，从而生成能够真实模拟人类气道上皮的三维和二维气道类器官的方法。
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本文内容
摘要
摘要
缺乏一种可靠的 体外 人呼吸道上皮模型的缺乏制约了对呼吸系统生物学与病理学的理解。本文描述了一种明确的实验方案，旨在从成人肺组织中的成体干细胞诱导生成人肺类器官，并进一步诱导其向近端气道分化，从而获得成熟的气道类器官。这些肺类器官可连续扩增超过一年，具有高度稳定性；而分化后的气道类器官则可在形态和功能上接近生理水平地模拟人类气道上皮。因此，我们建立了一个稳健的人气道上皮类器官模型。肺类器官及其分化后气道类器官的长期扩增提供了稳定且可再生的细胞来源，使科研人员能够在培养皿中重建并扩增人呼吸道上皮细胞。该人肺类器官系统提供了一个独特且具备生理活性的平台 体外 用于多种应用的模型，包括病毒-宿主相互作用研究、药物测试和疾病建模。
引言
类器官已成为一种强大且通用的工具 体外 器官发育建模及生物学与疾病研究。在含有特定生长因子的培养基中培养时，来自多种器官的成体干细胞（ASC）可在三维（3D）条件下扩增，并自组装形成由多种细胞类型组成的类器官样细胞簇，称为类器官。Clevers 实验室于 2009 年首次报道了由成体干细胞衍生的人肠道类器官。1,2随后，已成功建立多种人类器官和组织的ASC来源类器官，包括前列腺3,4肝脏5,6，胃7,8,9，胰腺10乳腺11和肺 12,13这些由ASC衍生的类器官保留了天然器官的关键细胞、结构和功能特性，并在长期扩增培养中维持了遗传和表型的稳定性
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方案
本文所述所有使用人体组织的实验均经香港大学/医院管理局港岛西联网机构审查委员会批准（编号：UW13-364 和 UW21-695）。在采集组织前，已从患者处获得知情同意。
1. 人类肺类器官的衍生
- 实验材料的准备
- 通过在高级DMEM/F12培养基中添加2 mM谷氨酰胺、10 mM HEPES、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素，制备基础培养基。
- 通过在基础培养基中添加10% R-spondin 1条件培养基、10% Noggin条件培养基、1× B27补充剂、1.25 mM N-乙酰半胱氨酸、10 mM烟酰胺、5 µM Y-27632、500 nM A-83-01、1 µM SB202190、5 ng/mL成纤维细胞生长因子（FGF）-7、20 ng/mL FGF-10和100 µg/mL Primocin，制备人肺类器官扩增培养基（见材料表）。
注意：R-spondin 1和Noggin条件培养基可用市售的重组R-spondin 1（500 ng/mL）和Noggin（100 ng/mL）替代。 - 将24孔悬浮培养板在细胞培养孵育箱中预热。使用标准细胞培养孵育箱，条件为5% CO2、37 °C、加湿环境。在4 °C冰箱中解冻基底膜基质。实验过程中将基底膜基质和培养基保....
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结果
本方案能够以较高的成功率获得人肺类器官。新鲜的人肺组织被切成小块后，用胶原酶进行消化。所得的单个细胞被包埋于基底膜基质中，并在含有多种微环境因子的肺类器官扩增培养基中孵育，以促进上皮干细胞的生长（步骤 1.1.2）。图1展示了将新鲜分离的肺细胞包埋于生长因子减少的2型基底膜基质（BME；图1A，左）后的显微照片。囊状类器官随时间逐渐出现并增大（图1A，右）。与此同时，无关的细胞逐渐发生细胞死亡。在前一至二代培养过程中可见成纤维细胞的存在。此后，培养物中仅含有来源于原始肺组织中上皮干细胞的上皮类器官，即肺类器官。这些肺类器官每2-3周通过机械剪切以1:3至1:5的比例传代，或通过胰酶消化以1:5至1:10的比例传代（步骤 2.2–2.3）。第四代肺类器官的代表性显微照片如图1B所示。机械剪切后，包埋于BME中的类器官碎片在数小时内形成囊状结构（图1B
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讨论
人体气道内壁覆盖着气道上皮，也称为假复层纤毛上皮。上呼吸道上皮的主要细胞类型包括纤毛细胞，其顶端纤毛可协调运动，推动黏液和吸入的颗粒物排出气道；杯状细胞，负责产生和分泌黏液；以及基底细胞，位于基底膜上，参与组织再生。在细支气管等小气道中，立方状气道上皮含有分泌型club细胞，且纤毛细胞数量较上呼吸道区域更少。本文描述了一种从人肺组织中的上皮干细胞高效建立人肺类器官的实验方案。这些人肺类器官可在扩增培养基中长期维持，并连续传代超过一年，保持高度稳定性。扩增培养基中的关键生长因子包括R-spondin（一种Wnt激动剂20）和Noggin（BMP信号通路的抑制剂21），以及FGF7和FGF10。既往研究表明，Wnt、FGF和BMP信号通路在呼吸上皮稳态中发挥关键作用22,23,24。扩增培养基通过引导类器官维持未成熟状态，实现其初始建立和长期扩增。我们进一步开发.......
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披露
J. Z.、C.L. 和 M.C.C. 被列为气道类器官专利（公开号：US-2021-0207081-A1）的发明人。其他作者声明无竞争利益。
致谢
感谢香港大学李嘉诚医学院全景科学中心和电子显微镜单元在共聚焦成像和流式细胞术方面提供的协助。本工作部分得到了香港特别行政区政府食物及卫生局健康与医学研究基金（HMRF，17161272 和 19180392）、研究资助局一般研究基金（GRF，17105420）以及创新科技署 Health@InnoHK 项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 肺类器官培养试剂 | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | - |
| A8301 | Tocris | 2939 | 500nM |
| B27 补充剂 | Invitrogen | 17504-044 | 1x |
| Cultrex 低生长因子基底膜基质，2 型（BME 2） | Trevigen | 3533-010-0 | 70-80% |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 20 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 5 ng/mL |
| GlutaMAX（谷氨酰胺） | Invitrogen | 35050061 | 1x |
| HEPES 1M | Invitrogen | 15630-056 | 10 mM |
| Heregulin β-1 | Peprotech | 100-03 | 5 nM |
| N-乙酰半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | A9165 | 1.25 mM |
| 烟酰胺 | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Noggin（条件培养基） | 自制 | - | 10x |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | Invitrogen | 15140-122 | 1x |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
| Rspondin1（条件培养基） | 自制 | - | 10x |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | 1 µM |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 5 µM |
| 近端分化培养基 | |||
| DAPT | Tocris | 2634 | 10 µM |
| 肝素溶液 | StemCell Technology | 7980 | 4 µg/mL |
| 氢化可的松储备液 | StemCell Technology | 7925 | 1 µM |
| PneumaCult-ALI 10X 补充剂 | 气液界面补充剂 | ||
| PneumaCult-ALI 基础培养基 | StemCell Technology | 05001 | 气液界面基础培养基 |
| PneumaCult-ALI 维持补充剂 | 气液界面维持补充剂 | ||
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 10 µM |
| 设备 | |||
| 生物安全柜 | Baker | 1-800-992-2537 | |
| Carl Zeiss LSM 780 或 800 | Zeiss | 共聚焦显微镜 | |
| CO2 培养箱 | Thermo Fisher Scientific | 42093483 | |
| 体视显微镜 | Olympus Corporation | CKX31SF | |
| 离心机 | Eppendorf | 5418BG040397 | |
| 移液器 | Eppendorf | ||
| 微量移液器 | Eppendorf | ||
| ZEN black 或 ZEN blue 软件 | Zeiss | 分析软件 | |
| 耗材 | |||
| 12 mm Trans-well | StemCell Technology | #38023 | |
| 12 孔细胞培养板 | Cellstar | 665970 | |
| 15 mL 和 50 mL 锥形管 | Thermo Fisher Scientific | L6BF5Z8118 | |
| 24 孔细胞培养板 | Cellstar | 662160 | |
| 6.5 mm Trans-well | StemCell Technology | #38024 | |
| 医用注射器滤器，0.22 µm | Sigma-Aldrich | SLGPR33RB | |
| 微量离心管 | Eppendorf | ||
| 微量移液器吸头 | Thermo Fisher Scientific | TFLR140-200-Q21190531 | |
| 巴斯德玻璃移液管 | Thermo Fisher Scientific | 22-378893 | |
| 血清移液管（5 mL、10 mL、25 mL） | Thermo Fisher Scientific | BA08003, 08004, 08005 | |
| 抗体 | |||
| 山羊抗小鼠 Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | |
| 山羊抗小鼠 Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| 山羊抗兔 Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | |
| 山羊抗兔 Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11037 | |
| 山羊抗大鼠 Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11007 | |
| 小鼠抗细胞角蛋白 5 | Abcam | ab128190 | |
| 小鼠抗 FOX J1 | Invitrogen | 14-9965-82 | |
| 小鼠抗黏蛋白 5AC | Abcam | ab3649 | |
| 小鼠抗β-微管蛋白 4 | Sigma | T7941 | |
| 兔抗 p63 | Abcam | ab124762 | |
| 大鼠抗泌素/CC-10 | R&D Systems | MAB4218-SP | |
| 其他试剂 | |||
| TrypLE Select 酶（10X） | Thermo Fisher Scientific | A1217701 | 解离酶 |
参考文献
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. S....
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