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方法文章

建立人类肺类器官及近端分化以生成成熟气道类器官

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DOI：

10.3791/63684

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2022年3月23日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Li Ka Shing Faculty of Medicine, The University of Hong Kong, 2Centre for Virology, Vaccinology and Therapeutics, Hong Kong Science and Technology Park, 3State Key Laboratory of Emerging Infectious Diseases, The University of Hong Kong

本文内容

摘要

本方案介绍了一种从原代肺组织中获取人肺类器官、扩增肺类器官并诱导其向近端分化，从而生成能够真实模拟人类气道上皮的三维和二维气道类器官的方法。

摘要

缺乏一种可靠的 体外 人呼吸道上皮模型的缺乏制约了对呼吸系统生物学与病理学的理解。本文描述了一种明确的实验方案，旨在从成人肺组织中的成体干细胞诱导生成人肺类器官，并进一步诱导其向近端气道分化，从而获得成熟的气道类器官。这些肺类器官可连续扩增超过一年，具有高度稳定性；而分化后的气道类器官则可在形态和功能上接近生理水平地模拟人类气道上皮。因此，我们建立了一个稳健的人气道上皮类器官模型。肺类器官及其分化后气道类器官的长期扩增提供了稳定且可再生的细胞来源，使科研人员能够在培养皿中重建并扩增人呼吸道上皮细胞。该人肺类器官系统提供了一个独特且具备生理活性的平台 体外 用于多种应用的模型，包括病毒-宿主相互作用研究、药物测试和疾病建模。

引言

类器官已成为一种强大且通用的工具 体外 器官发育建模及生物学与疾病研究。在含有特定生长因子的培养基中培养时，来自多种器官的成体干细胞（ASC）可在三维（3D）条件下扩增，并自组装形成由多种细胞类型组成的类器官样细胞簇，称为类器官。Clevers 实验室于 2009 年首次报道了由成体干细胞衍生的人肠道类器官。1,2随后，已成功建立多种人类器官和组织的ASC来源类器官，包括前列腺3,4肝脏5,6，胃7,8,9，胰腺10乳腺11和肺 12,13这些由ASC衍生的类器官保留了天然器官的关键细胞、结构和功能特性，并在长期扩增培养中维持了遗传和表型的稳定性14,15.

类器官也可以来源于多能干细胞（PSC），包括胚胎干细胞（ES细胞）和诱导性多能干细胞（iPS细胞）16。虽然PSC来源的类器官利用器官发育机制进行构建，但成体干细胞（ASCs）则可通过重建模拟生理组织自我更新或组织修复过程中干细胞微环境的条件而被诱导形成类器官。PSC来源的类器官是研究发育和器官发生过程的理想模型，但其成熟程度不及ASC来源的类器官。PSC来源类器官具有类似胎儿的成熟状态，且构建过程复杂，这些因素显著限制了其在成熟组织生物学与病理学研究中的广泛应用。

从鼻腔到终末细支气管，人类呼吸道内壁覆盖着气道上皮，也称为假复层纤毛上皮，由四种主要细胞类型组成，即纤毛细胞、杯状细胞、基底细胞和club细胞。我们与Clevers实验室合作，利用人肺组织建立了由气道干细胞（ASC）衍生的人肺类器官12,13。这些肺类器官可在扩增培养基中连续扩增超过一年；具体扩增时长因来自不同供体的类器官品系而异。然而，与天然气道上皮相比，这些可长期扩增的肺类器官尚未完全成熟，因为人类气道中占主导地位的纤毛细胞在这些类器官中所占比例偏低。因此，我们开发了一种近端分化方案，生成了在形态和功能上均接近生理状态的气道上皮的三维（3D）和二维（2D）气道类器官。

本文提供了一种从原代肺组织中衍生人类肺类器官、扩增肺类器官并诱导其向近端分化以生成三维和二维气道类器官的视频实验方案。

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方案

本文所述所有使用人体组织的实验均经香港大学/医院管理局港岛西联网机构审查委员会批准（编号：UW13-364 和 UW21-695）。在采集组织前，已从患者处获得知情同意。

1. 人类肺类器官的衍生

  1. 实验材料的准备
    1. 通过在高级DMEM/F12培养基中添加2 mM谷氨酰胺、10 mM HEPES、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素，制备基础培养基。
    2. 通过在基础培养基中添加10% R-spondin 1条件培养基、10% Noggin条件培养基、1× B27补充剂、1.25 mM N-乙酰半胱氨酸、10 mM烟酰胺、5 µM Y-27632、500 nM A-83-01、1 µM SB202190、5 ng/mL成纤维细胞生长因子（FGF）-7、20 ng/mL FGF-10和100 µg/mL Primocin，制备人肺类器官扩增培养基（见材料表）。
      注意：R-spondin 1和Noggin条件培养基可用市售的重组R-spondin 1（500 ng/mL）和Noggin（100 ng/mL）替代。
    3. 将24孔悬浮培养板在细胞培养孵育箱中预热。使用标准细胞培养孵育箱，条件为5% CO2、37 °C、加湿环境。在4 °C冰箱中解冻基底膜基质。实验过程中将基底膜基质和培养基保持在冰上。
  2. 从人肺组织中分离细胞用于三维类器官培养
    1. 从因各种疾病接受手术切除的患者中获取新鲜切除的人肺组织，大小约为0.5 cm。将肺组织置于30 mL基础培养基中，室温运输，并尽快在生物安全柜内处理。
    2. 在10 cm细胞培养皿中用无菌手术刀将肺组织切成小块（0.5–1 mm）。在15 mL离心管中用10 mL冷的基础培养基洗涤组织块，随后在4 °C下以400 × g离心5分钟 。
    3. 弃去上清液，将沉淀物重悬于8 mL含有胶原酶的基础培养基中，终浓度为2 mg/mL。在37 °C下以120 rpm振荡消化组织块30–40分钟。
    4. 使用10 mL移液管反复吹打20次，剪切消化后的组织块。将100 µm细胞筛置于50 mL离心管上，过滤悬液。
    5. 用基础培养基将筛网上残留的组织块回收，并转移至15 mL离心管，进行第二轮剪切和过滤。可根据需要额外进行1–2次剪切-过滤步骤以获得更多细胞，尤其是在获取的组织块较小时（例如，<0.5 cm）。
    6. 向滤过液中加入胎牛血清（FBS），终浓度为2%，以终止消化反应，随后在4 °C下以400 × g离心5分钟。
    7. 将细胞沉淀重悬于10 mL基础培养基中，再在4 °C下以400 × g离心5分钟。弃去上清液。
    8. （可选）若在沉淀中观察到大量红细胞（通过沉淀颜色估计），将细胞沉淀重悬于2 mL红细胞裂解缓冲液中，室温孵育5分钟。然后向管中加入10 mL基础培养基，再在4 °C下以400 × g离心5分钟。弃去上清液。
    9. 将沉淀重悬于冷的基底膜基质中，并保持在冰上。对于从约0.5 cm大小的肺组织中回收的细胞，加入80–160 µL基底膜基质；该体积足以接种2–4个液滴。
    10. 将40 µL悬液分配至预热的24孔悬浮培养板的每个孔中。将培养板在37 °C孵育10–15分钟，使基底膜基质凝固形成液滴。
    11. 向每孔加入500 µL含5 nM Heregulin beta-1的人肺类器官扩增培养基，并将培养板置于细胞培养孵育箱中孵育。
    12. 每3天更换一次培养基。更换时小心移除旧培养基，保留液滴完整，并轻柔加入新鲜培养基。在孵育10–14天后传代类器官。Heregulin beta-1仅用于首次传代前的初始培养。
    13. 在显微镜下观察类器官，确保类器官未因细胞密度过高而嵌入。若因细胞密度过高导致液滴解体，应回收类器官和细胞，使用更大体积的基底膜基质重新包埋，制备更多细胞密度较低且适宜的液滴。

2. 人类肺类器官的扩增

  1. 使用火焰（如本生灯）灼烧巴斯德移液管的尖端，将开口直径从1.5 mm缩小至约1.0 mm，制备成拉细的巴斯德移液管。移液管冷却后进行高压灭菌以实现消毒。使用基础培养基润洗移液管，以避免在机械剪切过程中发生细胞黏附和损失。
  2. 肺类器官通过机械剪切法传代
    1. 使用1 mL枪头反复吹打上述获得的类器官液滴以将其打散。随后将类器官连同培养基转移至15 mL离心管中，并用冷的基础培养基调整总体积至10 mL。在4 °C条件下以300 × g离心5分钟，弃去上清液。
    2. 再次用10 mL冷的基础培养基洗涤类器官。将类器官重悬于2 mL冷的基础培养基中，使用巴斯德移液管反复吹打，使类器官剪切为小片段。
    3. 补加基础培养基至总体积为10 mL，随后在4 °C条件下以300 × g离心5分钟。将类器官片段重悬于足量的冷基底膜基质中，以便实现1:3至1:5的传代比例。保持在冰上操作。
    4. 将40 µL类器官悬液加入预热的24孔板的每一孔中。将培养板置于37 °C孵育10–15分钟，使基底膜基质凝固。
    5. 向每孔加入500 µL肺类器官扩增培养基，并置于细胞培养箱中孵育。每3天更换一次培养基。每2周以1:3至1:5的比例对类器官进行传代。
  3. 肺类器官通过胰酶消化法传代
    注：当使用巴斯德移液管难以将肺类器官剪切为小片段，或类器官大小差异较大，或后续实验要求类器官尺寸更均一时，建议采用胰酶消化法。
    1. 按照步骤2.2.1的方法收获肺类器官。将类器官重悬于1 mL解离酶溶液中，在37 °C水浴中孵育3–5分钟。
    2. 向管中加入1 mL基础培养基。使用巴斯德移液管反复吹打，将类器官机械剪切为小片段。在4倍物镜下显微镜观察类器官片段的大小。然后加入40 µL胎牛血清（FBS）以终止消化反应。
      注：应根据实验设计在显微镜下评估类器官片段的大小。若实验需要更多类器官或尺寸更均一的类器官，可将类器官剪切为更小的片段甚至单细胞。此时类器官需要更长时间（可能约3周）才能达到可用于实验的状态。
    3. 补加基础培养基至终体积为10 mL，随后在4 °C条件下以300 × g离心5分钟。将类器官片段重悬于足量的冷基底膜基质中，以实现1:5–1:10的传代比例。保持在冰上操作。
    4. 将40 µL类器官悬液加入预热的24孔板的每一孔中。将培养板置于37 °C孵育10–15分钟，使基底膜基质凝固。
    5. 每孔补充500 µL肺类器官扩增培养基，并置于细胞培养箱中孵育。每3天更换一次扩增培养基。在2–3周后对类器官进行传代。
      ​注：约100个类器官被包埋于40 µL基底膜基质液滴中。肺类器官通常在相对较高的细胞密度下生长更佳。若液滴发生解体，或因细胞密度过高导致生长中的类器官相互黏连，应以较低细胞密度重新包埋类器官。

3. 近端分化以生成成熟的气道类器官

  1. 通过在气液界面基础培养基中添加1倍体积的气液界面添加剂、1倍体积的气液界面维持添加剂、4 µg/mL 肝素、1 µM 氢化可的松、10 µM Y-27632 和 10 µM DAPT，制备近端分化培养基（PD培养基）（参见 材料表).
  2. 三维气道类器官
    1. 传代后，将肺类器官在扩增培养基中培养 7–10 天 通过 机械剪切。将扩增培养基更换为PD培养基。将类器官置于细胞培养箱中，在PD培养基中培养14天。
    2. 弃去每孔中的 PD 培养基。加入细胞裂解液，收集已分化的气道类器官，用于 RNA 提取及通过 RT-qPCR 检测细胞基因表达。
    3. 或者，在添加10 mM EDTA后，将类器官在37 °C孵育60分钟，以将其解离为单细胞，随后进行流式细胞术分析以检测细胞群体。类器官此时可用于各种实验操作。
  3. 二维气道类器官
    1. 准备足够的3D肺类器官用于2D分化培养。共计1.3 × 105 和 4.5 x 105 分别需要用于24孔和12孔可渗透支持插入式培养板的细胞。
    2. 在3D肺类器官于扩增培养基中培养2周后，将类器官消化为单细胞，并接种至24孔和12孔培养插件中，以生成2D气道类器官。
    3. 将小室插入物在细胞培养箱中用基础培养基预孵育过夜。在24孔板的上室和下室中分别加入250 µL和500 µL基础培养基。对于12孔板，在上室和下室中分别加入500 µL和1,000 µL基础培养基。
    4. 按照步骤 2.2.1 所述收获 3D 肺类器官。用 1 mL 解离酶重悬类器官，并在 37 °C 水浴中孵育 3–5 分钟。
    5. 向离心管中加入1 mL基础培养基，使用巴斯德吸管反复吹打，将类器官剪切为单细胞，并在显微镜下观察细胞状态。随后，加入40 µL胎牛血清（FBS）以终止消化。
    6. 通过40 µm细胞筛将细胞过滤至50 mL离心管中。将过滤后的细胞悬液转移至15 mL离心管中，加入基础培养基至总体积10 mL，随后在300 x g 4 °C下离心5分钟。
    7. 将来自24滴（每滴40 µL）的沉淀物重悬于1–2.5 mL肺类器官扩增培养基中，具体体积根据液滴中的细胞密度确定。在显微镜下使用细胞计数仪对细胞数量进行计数。将细胞浓度调整至1.3 × 10⁵ cells/mL6/mL（适用于24孔小室）或9 × 105/mL（适用于12孔插件）。
    8. 移去上室和下室的基底培养基。在24孔插入式培养板和12孔插入式培养板的下室中，分别加入500 µL和1,000 µL扩增培养基。将步骤3.3.7中制备的细胞悬液分别取100 µL和500 µL接种至24孔插入式培养板和12孔插入式培养板的上室中。
    9. 在细胞培养箱中孵育2天。将培养板的顶室和底室中的扩增培养基更换为PD培养基。将类器官在细胞培养箱中继续孵育14天，每3天更换一次PD培养基。
      注意：在PD培养基中培养7天后，可在显微镜下观察到三维和二维类器官中的运动纤毛。在PD培养基中分化培养14天后，气道类器官已成熟，可用于多种实验操作。
    10. 每隔一天使用电阻测量系统，按照文献中描述的标准方案测量跨上皮电阻（TEER）。17.

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结果

本方案能够以较高的成功率获得人肺类器官。新鲜的人肺组织被切成小块后，用胶原酶进行消化。所得的单个细胞被包埋于基底膜基质中，并在含有多种微环境因子的肺类器官扩增培养基中孵育，以促进上皮干细胞的生长（步骤 1.1.2）。图1展示了将新鲜分离的肺细胞包埋于生长因子减少的2型基底膜基质（BME；图1A，左）后的显微照片。囊状类器官随时间逐渐出现并增大（图1A，右）。与此同时，无关的细胞逐渐发生细胞死亡。在前一至二代培养过程中可见成纤维细胞的存在。此后，培养物中仅含有来源于原始肺组织中上皮干细胞的上皮类器官，即肺类器官。这些肺类器官每2-3周通过机械剪切以1:3至1:5的比例传代，或通过胰酶消化以1:5至1:10的比例传代（步骤 2.2–2.3）。第四代肺类器官的代表性显微照片如图1B所示。机械剪切后，包埋于BME中的类器官碎片在数小时内形成囊状结构（图1B

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讨论

人体气道内壁覆盖着气道上皮，也称为假复层纤毛上皮。上呼吸道上皮的主要细胞类型包括纤毛细胞，其顶端纤毛可协调运动，推动黏液和吸入的颗粒物排出气道；杯状细胞，负责产生和分泌黏液；以及基底细胞，位于基底膜上，参与组织再生。在细支气管等小气道中，立方状气道上皮含有分泌型club细胞，且纤毛细胞数量较上呼吸道区域更少。本文描述了一种从人肺组织中的上皮干细胞高效建立人肺类器官的实验方案。这些人肺类器官可在扩增培养基中长期维持，并连续传代超过一年，保持高度稳定性。扩增培养基中的关键生长因子包括R-spondin（一种Wnt激动剂20）和Noggin（BMP信号通路的抑制剂21），以及FGF7和FGF10。既往研究表明，Wnt、FGF和BMP信号通路在呼吸上皮稳态中发挥关键作用22,23,24。扩增培养基通过引导类器官维持未成熟状态，实现其初始建立和长期扩增。我们进一步开发...

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披露

J. Z.、C.L. 和 M.C.C. 被列为气道类器官专利（公开号：US-2021-0207081-A1）的发明人。其他作者声明无竞争利益。

致谢

感谢香港大学李嘉诚医学院全景科学中心和电子显微镜单元在共聚焦成像和流式细胞术方面提供的协助。本工作部分得到了香港特别行政区政府食物及卫生局健康与医学研究基金（HMRF，17161272 和 19180392）、研究资助局一般研究基金（GRF，17105420）以及创新科技署 Health@InnoHK 项目的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
肺类器官培养试剂
Advanced DMEM/F12Invitrogen12634010-
A8301Tocris2939500nM
B27 补充剂Invitrogen17504-0441x
Cultrex 低生长因子基底膜基质，2 型（BME 2）Trevigen3533-010-070-80%
FGF-10Peprotech100-2620 ng/mL
FGF-7Peprotech100-195 ng/mL
GlutaMAX（谷氨酰胺）Invitrogen350500611x
HEPES 1MInvitrogen15630-05610 mM
Heregulin β-1Peprotech100-035 nM
N-乙酰半胱氨酸Sigma-AldrichA91651.25 mM
烟酰胺Sigma-AldrichN063610 mM
Noggin（条件培养基）自制-10x
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）Invitrogen15140-1221x
PrimocinInvivogenant-pm-1100 µg/mL
Rspondin1（条件培养基）自制-10x
SB202190Sigma-AldrichS70671 µM
Y-27632Tocris12545 µM
近端分化培养基
DAPTTocris263410 µM
肝素溶液StemCell Technology79804 µg/mL
氢化可的松储备液StemCell Technology79251 µM
PneumaCult-ALI 10X 补充剂气液界面补充剂
PneumaCult-ALI 基础培养基StemCell Technology05001气液界面基础培养基
PneumaCult-ALI 维持补充剂气液界面维持补充剂
Y-27632Tocris125410 µM
设备
生物安全柜Baker1-800-992-2537
Carl Zeiss LSM 780 或 800Zeiss共聚焦显微镜
CO2 培养箱Thermo Fisher Scientific42093483
体视显微镜Olympus CorporationCKX31SF
离心机Eppendorf5418BG040397
移液器Eppendorf
微量移液器Eppendorf
ZEN black 或 ZEN blue 软件Zeiss分析软件
耗材
12 mm Trans-wellStemCell Technology#38023
12 孔细胞培养板Cellstar665970
15 mL 和 50 mL 锥形管Thermo Fisher ScientificL6BF5Z8118
24 孔细胞培养板Cellstar662160
6.5 mm Trans-wellStemCell Technology#38024
医用注射器滤器，0.22 µmSigma-AldrichSLGPR33RB
微量离心管Eppendorf
微量移液器吸头Thermo Fisher ScientificTFLR140-200-Q21190531
巴斯德玻璃移液管Thermo Fisher Scientific22-378893
血清移液管（5 mL、10 mL、25 mL）Thermo Fisher ScientificBA08003, 08004, 08005
抗体
山羊抗小鼠 Alexa Fluor 594InvitrogenA11005
山羊抗小鼠 Alexa Fluor 488InvitrogenA11001
山羊抗兔 Alexa Fluor 488InvitrogenA11034
山羊抗兔 Alexa Fluor 594InvitrogenA11037
山羊抗大鼠 Alexa Fluor 594InvitrogenA11007
小鼠抗细胞角蛋白 5Abcamab128190
小鼠抗 FOX J1Invitrogen14-9965-82
小鼠抗黏蛋白 5ACAbcamab3649
小鼠抗β-微管蛋白 4SigmaT7941
兔抗 p63Abcamab124762
大鼠抗泌素/CC-10R&D SystemsMAB4218-SP
其他试剂
TrypLE Select 酶（10X）Thermo Fisher ScientificA1217701解离酶

参考文献

  1. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  2. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  3. Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
  4. Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).
  5. Hu, H., et al. Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
  6. Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
  7. Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
  8. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  9. Wroblewski, L. E., et al. Helicobacter pylori targets cancer-associated apical-junctional constituents in gastroids and gastric epithelial cells. Gut. 64 (5), 720-730 (2015).
  10. Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).
  11. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  12. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).
  13. Zhou, J., et al. Differentiated human airway organoids to assess infectivity of emerging influenza virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (26), 6822-6827 (2018).
  14. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  15. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
  16. Lancaster, M. A., Huch, M. Disease modelling in human organoids. Disease Model Mechanisms. 12 (7), (2019).
  17. Millicell ERS-2 User Guide. , Available from: https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5,nav?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F (2021).
  18. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. eLife. 4, 05098(2015).
  19. Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells. Current Pathobiology Reports. 4, 47-57 (2016).
  20. Glinka, A., et al. LGR4 and LGR5 are R-spondin receptors mediating Wnt/beta-catenin and Wnt/PCP signalling. EMBO Reports. 12 (10), 1055-1061 (2011).
  21. Groppe, J., et al. Structural basis of BMP signalling inhibition by the cystine knot protein Noggin. Nature. 420 (6916), 636-642 (2002).
  22. Tadokoro, T., Gao, X., Hong, C. C., Hotten, D., Hogan, B. L. BMP signaling and cellular dynamics during regeneration of airway epithelium from basal progenitors. Development. 143 (5), 764-773 (2016).
  23. Mou, H., et al. Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells. Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).
  24. Balasooriya, G. I., Goschorska, M., Piddini, E., Rawlins, E. L. FGFR2 is required for airway basal cell self-renewal and terminal differentiation. Development. 144 (9), 1600-1606 (2017).
  25. Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids in immunological research. Nature Reviews. Immunology. 20 (5), 279-293 (2019).
  26. Drost, J., Clevers, H. Translational applications of adult stem cell-derived organoids. Development. 144 (6), 968-975 (2017).
  27. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  28. Zhou, J., et al. Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2. Nature Medicine. 26 (7), 1077-1083 (2020).
  29. Salahudeen, A. A., et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids. Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).
  30. Han, Y., et al. Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids. Nature. 589 (7841), 270-275 (2020).
  31. Mykytyn, A. Z., et al. SARS-CoV-2 entry into human airway organoids is serine protease-mediated and facilitated by the multibasic cleavage site. eLife. 10, 64508(2021).
  32. Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
  33. Lamers, M. M., et al. SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science. 369 (6499), 50-54 (2020).
  34. Mallapaty, S. The mini lungs and other organoids helping to beat COVID. Nature. 593 (7860), 492-494 (2021).

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