本方案描述了在小鼠模型系统中诱导革兰氏阴性单菌性败血症的方法。该模型可用于研究败血症期间的炎症反应及致死性宿主反应。
本文内容
摘要
摘要
脓毒症是一种针对微生物入侵或组织损伤的失调性宿主免疫反应，可导致远离感染或损伤部位的器官损伤。目前广泛使用的脓毒症小鼠模型包括脂多糖（LPS）诱导的内毒素血症、盲肠结扎穿刺（CLP）以及单菌感染模型系统。本方案描述了一种研究宿主在脓毒症期间免疫反应的方法。 沙门氏菌 小鼠伤寒沙门菌感染诱导的脓毒性腹膜炎 S. 鼠伤寒沙门氏菌（Typhimurium）是一种革兰氏阴性胞内病原菌，可在小鼠中引起类似伤寒的疾病。
本方案详细阐述了小鼠腹膜炎败血症的培养制备、通过腹腔注射诱导败血症的方法，以及研究全身宿主反应的技术。此外，还介绍了检测不同器官中细菌负荷量的方法，以及通过流式细胞术分析腹腔灌洗液中中性粒细胞数量增加的情况。Salmonella Typhimurium诱导的小鼠败血症可导致促炎性细胞因子水平升高，并引起中性粒细胞迅速浸润腹腔，从而降低存活率。
本方案中的每一步均已优化，可高度可重复地再现脓毒症性腹膜炎的发病过程。该模型可用于研究细菌性脓毒症期间的免疫应答、不同基因在疾病进展中的作用，以及药物对脓毒症的缓解效果。
引言
脓毒症被定义为由微生物侵入或组织损伤引发的全身性炎症和免疫反应失调，导致远离感染或损伤部位的器官损伤。脓毒性休克是脓毒症的一个亚型，其特征是在液体复苏过程中持续存在的低血压，并伴有显著升高的死亡风险1。在新冠疫情期间，公众对该疾病的认识有所提高。尽管脓毒症相关死亡率很高，但由于其诊断复杂，目前仍缺乏关于其全球疾病负担的全面流行病学数据。2017年，全球有4890万例脓毒症病例和1100万例死亡，占全球总死亡人数的19.7%2。此外，一项关于重症监护病房患者感染及其相关脓毒症扩展流行情况的研究发现，患者中分离出的阳性病原体有62%为革兰氏阴性菌3。
最初，脓毒症的研究主要集中在阐明微生物的致病机制。然而，随着对“"危险假说"”的理解，即宿主如何区分自身与非自身成分，脓毒症研究的重心逐渐转向理解宿主对入侵病原体的反应。目前广泛使用的脓毒症小鼠模型包括脂多糖（LPS）诱导的内毒素血症模型、多微生物脓毒症模型、盲肠结扎穿刺（CLP）和升结肠支架诱导腹膜炎（CASP）模型，以及单细菌感染模型4。
我们通过诱导腹膜脓毒症建立了一种标准化的小鼠模型系统 沙门氏菌 伤寒沙门氏菌。该模型相较于其他模型具有优势，因为 沙门氏菌 鼠伤寒沙门氏菌是一种胞内病原体，可模拟临床上具有重要意义的革兰氏阴性菌败血症状况。在此模型中，腹膜炎性败血症的病程呈全身性发展，感染后96小时内死亡率达100%。因此，该模型对于研究宿主的炎症反应及致死性免疫应答具有重要价值。在此模型中，败血症通过腹腔注射0.5百万菌落形成单位（CFU）的鼠伤寒沙门氏菌来诱导 沙门氏菌 将鼠伤寒沙门氏菌注入8-10周龄的C57BL/6小鼠。感染后约16小时，通过评估器官中的细菌负荷可确认系统性感染。本文展示了 沙门氏菌 小鼠伤寒沙门菌诱导的腹膜炎败血症模型，表征腹腔细胞组成的变化，并定量不同器官中的细菌负荷。
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方案
所有使用鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）的实验均在生物安全二级（BSL-2）实验室中进行。操作时必须采取适当个人防护装备（PPE），确保安全，并遵循标准的BSL-2生物危害物处理方法。所有小鼠实验均依照印度科学理工学院（IISc）机构动物伦理委员会规定的指南进行。小鼠在印度科学理工学院中央动物设施中心（注册编号：48/1999/CPCSEA，日期：1999年3月1日）繁育和饲养，该设施已获印度政府环境与森林部批准。实验方案已获实验动物使用与监管委员会批准，批准许可编号为CAF/Ethics/797/2020。
BSL2 的定义：BSL2 级别表示生物危害性因子对环境和实验室工作人员构成中等程度的威胁5。
1. 鼠伤寒沙门氏菌 培养物的制备
- 添加 100 µL 的 沙门氏菌 将鼠伤寒沙门氏菌 NCTC 12023 甘油菌种接种至 3 mL 液体 Luria Bertani (LB) 培养基中。在 160 rpm 条件下培养菌液。 37 °C 过夜。
- 划线 50 µL 将过夜培养的LB肉汤菌液接种至沙门氏菌-志贺菌（SS）琼脂平板上，37℃培养 37 °C 约 12 小时。将含有细菌菌落的 SS 琼脂平板保存于 4 °C 数天前 体内 感染实验
- 使用微量移液器吸头从划线的SS琼脂平板上挑取单个菌落。将吸头弃入3 mL LB肉汤中，在160 rpm条件下培养 37 °C 过夜。
- 将0.1 mL细菌培养物加入50 mL LB肉汤中，于 37 °C 在摇床培养箱中以160 rpm振荡培养3-4小时，使其达到对数生长期。用LB肉汤将培养物稀释至原浓度的二分之一。
注意：在对数生长期，细菌细胞处于最佳健康状态，并进行活跃分裂。 - 在分光光度计或微孔板读板仪中，于600 nm波长下测定培养物的光密度（OD）。当OD达到1.0时，取1 mL培养物分装至两个1.5 mL微量离心管中，每管1 mL。
- 将试管在 7,750 × g 15分钟。弃去上清液，用1 mL 1× PBS洗涤沉淀物2次。将离心管在7,750 × g 15分钟。
- 将沉淀物分别用 0.5 mL 1× PBS 重悬于两个不同的 1.5 mL 微离心管中。将两管中的悬液合并至一个 1.5 mL 离心管中，此时总体积约为 2 × 108 菌落形成单位（CFU）/mL
- 制备浓度为 1 × 10 的细菌细胞悬液6 通过稀释该储备液获得CFU/mL。
注意：在开始实验前，需根据特定实验室条件优化光密度（OD）对应的菌落形成单位（CFU），以确定 OD 1.0 时的 CFU 数值。
2. 小鼠与感染
- 将8至10周龄、体重约20 g的雄性C57BL/6小鼠在动物实验设施的洁净空气房间内饲养数天以适应环境。
- 感染当天，用一只手固定小鼠，用70%乙醇擦拭腹部皮肤，并展开后肢以更好地暴露腹壁。
- 注射 0.5 mL 的 1 × 106 CFU/mL 细菌悬液，借助1 mL注射器进行腹腔注射。因此，每只小鼠接受5 × 105 菌落形成单位（CFU）。对照组，未感染小鼠仅给予0.5 mL PBS。感染后，对培养物进行平板培养以检测实际注射的CFU，其数值可能在0.2–0.8 × 10⁶ CFU/0.5 mL之间波动。
- 将小鼠按指定放回笼中。
- 使用 CO₂ 处死小鼠2 感染后约 12–18 小时出现窒息症状，此时反应最佳。通常所有感染小鼠在 96 小时内死亡。在某些实验干预条件下，部分小鼠可能存活，应在 96 小时后处死这些小鼠。同时，对体温低于指定值的小鼠也应实施安乐死 33.2 °C 并在96小时出现急性痛苦时作为人道终点。
注意：在此模型中，部分小鼠可能在12 h后开始死亡 沙门氏菌 注射。因此，应合理规划涉及多个时间点的实验。
3. 器官的菌落形成单位（CFU）评估
- 通过 CO2 窒息法处死感染小鼠，用浸有 70% 乙醇的棉球擦拭腹部，切开腹部皮肤。参见 Ray 和 Dittel 的文章，了解如何收集腹腔灌洗液的视频方案6。切开腹腔，将目标器官收集至微量离心管中。此外，由于脓毒症小鼠的血液凝固迅速且血量较少，因此在处死后应尽快采集血液。
注意：本视频演示了从肝脏中计数器官菌落形成单位（CFU），因为在该脓毒症模型中，肝脏会发生广泛的组织病理学损伤。 - 切取一小块肝脏组织，放入微量离心管中。
注意：此样本可在冰上保存最多 2–3 小时，之后应尽快进行下一步操作。 - 称重后将组织块转移至微量离心管中。为确保充分匀浆，建议切割成约 10–15 mg 的组织块。对于较小的器官（如肠系膜淋巴结（MLNs）或胸腺），可直接使用整个器官。
- 向离心管中加入 0.5 mL 的 1× PBS，使用手动匀浆器匀浆组织。确保组织完全匀浆后，再加入 0.5 mL 的 1× PBS，使总体积达到 1 mL。
- 在 4 °C 条件下，以 200 × g 离心 5 分钟。
- 将上清液转移至新的微量离心管中，并在 96 孔板中制备 1 × 10−1 和 10−2 的稀释液。
- 取 50 µL 稀释液涂布于新的 SS 琼脂平板上，于 37 °C 培养 12 小时。
- 计数各条件下出现的菌落数量，并使用公式（1）根据器官重量对数据进行标准化：
CFU/mg =
（1）
注意：公式中的数值 20 用于将每平板菌落数转换为 CFU/mL。该数值由 1 mL 除以涂布的培养物体积（本例中为 50 µL）得出。
例如，若在 SS 琼脂平板上观察到 100 个菌落，该平板涂布的是 10 mg 匀浆器官组织的 1 × 10-1 稀释液 50 µL，则
CFU/mg =
4. 腹腔渗出液中多种免疫细胞群体的流式细胞术分析
- 按照 Ray 和 Dittel 之前描述的方法收集腹膜细胞6。
- 将腹腔灌洗液中的细胞沉淀重悬于 1 mL 添加了 10% 胎牛血清（FBS）的 RPMI 培养基中。使用血细胞计数板对腹腔灌洗液中的总细胞数进行计数。调整细胞数量，使每管加入 0.2–0.5 × 10⁶ 个细胞。
注意：脓毒症小鼠的腹腔灌洗液中可能含有红细胞（RBCs），这可能是由于出血所致。计数腹膜细胞时需注意排除红细胞。在明场显微镜下，红细胞比免疫细胞小得多，呈扁平圆盘状或环状（类似“甜甜圈”），中央有凹陷但并非中空。可根据需要增加一步红细胞裂解操作7。 - 在 4 °C 条件下以 200 × g 离心 10 分钟，弃上清，用 1× 冷 PBS 洗涤细胞一次。再次在 4 °C 条件下以 200 × g 离心 10 分钟。
- 使用阻断缓冲液（含 5% FBS 和 0.02% 叠氮化钠的 PBS 溶液）按 1:400 稀释 FcR 阻断剂，用于阻断腹膜细胞（PECs）上的 Fc 受体。冰上孵育 15 分钟。
- 在 4 °C 条件下以 200 × g 离心 10 分钟，弃上清。将所需荧光染料标记的抗体用阻断缓冲液稀释，抗小鼠 LY6G 抗体按 1:500 稀释以标记中性粒细胞。
注意：也可使用其他抗体检测其他免疫细胞亚群，例如抗小鼠 B220 抗体标记 B 细胞，抗小鼠 CD3 抗体标记 T 细胞，抗小鼠 F4/80 抗体标记巨噬细胞。 - 将约 0.2 × 10⁶ 个细胞分别加入含有 200 µL 抗体稀释液的各离心管中。作为阴性对照，每种荧光染料类型应单独留出一管，仅加入 200 µL 阻断缓冲液而不加抗体，用于未染色对照组的孵育。
- 将样本置于冰上孵育 45 分钟，期间每隔 15 分钟轻轻轻弹管壁混匀。
- 在 4 °C 条件下以 200 × g 离心 10 分钟，弃上清。若需将细胞保存数天，可用 4% 多聚甲醛在室温固定约 15 分钟。但最好尽快使用流式细胞仪检测新鲜染色的样本。
- 将细胞重悬于 200 µL FACS 染色缓冲液（含 2% FBS 的 PBS）中，通过流式细胞仪获取数据。
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结果
使用该特定模型对宿主免疫反应进行的详细表征已在先前发表的研究中展示8,9。本节展示了所述实验方案的一些代表性结果。该模型旨在通过腹腔注射细菌培养物诱导鼠伤寒沙门氏菌（S. Typhimurium）的全身性感染，从而建立脓毒症模型。为确认感染状态，将脓毒症小鼠肝脏和脾脏的裂解液接种于SS琼脂平板上，并计数菌落形成单位。在图1中，SS琼脂平板的图像显示了脓毒症小鼠肝脏和脾脏中的器官菌落形成单位（CFU）负荷。匀浆后的器官裂解液以1 × 10−1的稀释度涂布，并在37 °C下培养。黑色素化的鼠伤寒沙门氏菌（S. Typhimurium）菌落在37 °C培养约12小时后出现。此外，已有报道指出，小鼠感染后，其血液和腹腔灌洗液培养物中可检测到细菌细胞8。这些结果表明，腹腔注射的细菌细胞已发生全身播散并定植于内脏器官。图中部分区域以放大插图形式展示，以更清晰地呈现菌落形...
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讨论
本文介绍了一种通过腹腔注射诱导重度细菌性脓毒症的方法 沙门氏菌 伤寒沙门氏菌。该模型相较于其他模型具有优势，因为 沙门氏菌 鼠伤寒沙门氏菌是一种胞内病原体，因此具有高度致病性，可模拟临床上相关的革兰氏阴性菌败血症状况。在此模型中，腹膜炎败血症的结局呈全身性，感染后96小时内死亡率达100%。因此，该模型对于研究宿主的炎症反应及致死性免疫应答具有重要意义。8 以及治疗干预在减轻脓毒症方面的作用。
在此模型系统中，腹腔的细胞组成发生显著变化，以应对接种的病原体。大量LY6G+中性粒细胞浸润腹腔，同时F4/80+巨噬细胞减少，从而导致巨噬细胞消失反应（MDR）8,10。因此，该模型可用于研究脓毒症期间免疫细胞组成和功能的动力学变化，这一领域目前仍远未被充分探索。Salmonella Typhimurium可在小鼠体内系统性感染，...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢印度科学理工学院（IISc）中央动物实验中心为我们提供用于研究的小鼠。本研究由印度政府生物技术部和科学与工程研究委员会向 DpN 提供的资助项目资助。对 DBT-IISc 项目以及 DST-FIST 资助项目提供的基础设施支持深表感谢。我们感谢 DpN 实验室所有以往和现任成员给予的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 耗材 | |||
| 1 mL 无菌注射器（带 26 G 针头） | Beckton Dickinson, Singapore | 303060 | |
| 1.5 mL 微量离心管 | Tarsons, USA | 500010 | |
| 10 mL 无菌注射器（带 21 G 针头） | Beckton Dickinson, Spain | 307758 | |
| 50 mL 锥形瓶 | Tarsons, USA | 441150 | |
| 50 mL 刻度离心管 | Tarsons, USA | 546041 | |
| 50 mL 刻度离心管 | Tarsons, USA | 546021 | |
| 细胞涂布棒 | VWR, USA | VWRU60828-680 | |
| Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液 | HiMedia, Mumbai, India | TS1006 | |
| 乙醇 | Merck | 100983 | |
| FcR 阻断剂 | BD Biosciences | 553142 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10270-106 | |
| FITC 标记大鼠抗小鼠 Ly6G 抗体（克隆 1A8） | BD Pharmingen | 551460 | |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| 手动匀浆器 | - | - | |
| 血细胞计数板（Neubauer 计数室） | Rohem, India | I.S. 10269 | |
| LB 培养基（Luria Bertani 肉汤） | HiMedia, Mumbai, India | M1245 | |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| 培养皿 | Tarsons, USA | 460091 | |
| RPMI 培养基 | Himedia, Mumbai, India | AT060-10X1L | |
| 沙门氏菌-志贺氏菌琼脂 | HiMedia, Mumbai, India | M108 | |
| 叠氮化钠 | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| 仪器设备 | |||
| 离心机 | Kubota | ||
| 流式细胞仪 | BD FACSverse | ||
| 培养箱 | N-biotek | ||
| 分光光度计 | Shimadzu | ||
| 电子天平 | Sartorius |
参考文献
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