本方案描述了一种高通量的成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）基因编辑工作流程，用于微小RNA（miRNA）簇网络分析，可在单次实验中快速构建一系列基因修饰的细胞系，这些细胞系携带不同miRNA簇成员的特异性缺失组合，缺失片段长度可达35 kb。
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摘要
摘要
microRNA（miRNA）已成为癌症及转移过程中重要的细胞调控因子（肿瘤抑制因子、促癌因子）。大多数已发表的研究在描述小RNA在癌症中的作用时，通常只关注单个miRNA。然而，约30% 的人类miRNA基因以成簇的形式排列，这些基因通常共同表达，表明存在一个复杂且协调的非编码RNA调控系统。在将非编码小RNA转化为临床应用之前，有必要更清晰地理解成簇miRNA网络如何协同调控肿瘤生长、癌症侵袭性及药物耐药性。
已采用高通量的CRISPR介导的基因编辑方法，研究位于前列腺癌相关基因组区域（长度约35,000 bp）内由七个miRNA基因组成的基因簇在肿瘤发生中的作用。该方法中，将人癌细胞系感染携带多西环素（DOX）诱导型Cas9核酸酶的慢病毒载体，并在含DOX的培养基中培养48小时。随后，细胞共转染合成的反式激活CRISPR RNA（tracrRNA）与针对基因组特定位点的CRISPR RNA（crRNA）寡核苷酸复合物，从而在单次实验中快速生成携带整个miRNA基因簇缺失、或单个及组合性miRNA基因簇缺失的癌细胞系。
该高通量基因编辑系统的优势在于能够避免耗时的DNA载体亚克隆步骤，可在24孔板中灵活地以不同的向导RNA组合转染细胞，以及利用粗制细胞裂解液进行低成本的PCR基因分型。采用这一简化方法的研究有望揭示miRNA簇成员之间的功能冗余性以及协同或拮抗相互作用，从而有助于阐明参与人类疾病的复杂小非编码RNA网络，并为未来的治疗设计提供更充分的依据。
引言
需要更先进的研究工具来探究非编码RNA在人类疾病中的作用。在比较癌症患者与非癌症健康个体的组织和体液（如血液、尿液）中这些小分子非编码RNA的表达谱时，常观察到miRNA的失调现象，这一分析通常采用微阵列、实时定量PCR（qRT-PCR）以及下一代深度测序技术1,2。近期研究已明确其中大量miRNA为肿瘤抑制因子、致癌因子或转移相关因子，能够调控肿瘤形成、疾病进展及药物耐药性。实验性地上调和/或下调/缺失miRNA会导致细胞产生功能性和多效性后果，反映出这些非编码RNA所协调的多种癌症相关活动——包括细胞增殖、凋亡、分化、染色质重塑、血管生成、上皮-间质转化（EMT）与间质-上皮转化（MET）、代谢以及免疫应答3。
miRNA 可作为单个基因编码，或位于基因组簇中，这些基因簇在细胞核内被转录，并经过广泛加工后生成定位于细胞质中的生物学成熟单链 miRNA，长度约为 22 个核苷酸（nt）4。这些小 RNA 在转录后水平发挥作用，作为负性基因调控因子，以序列特异性方式结合信使 RNA（mRNA）靶标，从而将催化性的 RNA 诱导沉默复合体（RISC）引导至 mRNA 位点，导致 mRNA 降解和/或阻断蛋白质翻译。miRNA 是动物系统中极为丰富的一类非编码 RNA，....
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方案
1. 准备CRISPR基因编辑并设计向导RNA以生成miRNA簇敲除细胞系
- 使用DNA序列注释软件程序创建一个包含目标miRNA簇区域（基因间区、内含子区）完整基因组序列以及至少1 kB周围基因组区域的DNA文件19。
- 在所创建的DNA文件中，使用特征编辑工具标记目标miRNA簇位点（基因间区、内含子区）以及属于该miRNA簇的各个单独miRNA发夹结构序列，并标注附近其他编码和非编码基因和/或调控元件5,20,21,22。
- 确保目标miRNA区域的删除不会意外破坏邻近的蛋白编码基因、非编码基因或重要的调控DNA元件。
注：请考虑本实验方案所用细胞系的基因组复杂性（例如染色体重复/融合）。
- 使用生物信息学向导RNA设计软件工具（例如23），设计靶向整个miRNA簇、单个miRNA发夹结构（pre-miRNA）区域和/或簇内miRNA基因子集两侧约20 nt基因组DNA序列的合成crRN....
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结果
本研究成功应用了高通量CRISPR缺失技术，通过将靶向miR-888簇的合成寡核苷酸向导RNA转染至可诱导表达Cas9的LNCaP和PC3-ML人源癌细胞系，用于前列腺癌相关研究。miR-888簇最初在表达谱筛选中被发现，在高级别前列腺癌患者中的表达水平显著高于低级别及非癌症患者9,10。该miR-888簇跨越35,124 bp，位于人类X染色体Xq27.3区域，包含7个miRNA（miR-892c、-890、-888、-892a、-892b、-891b和-891a）（图2A）。该基因座位于HPCX1（遗传性前列腺癌X连锁位点1，Xq27-28），与遗传性前列腺癌相关11,12,13,14,
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讨论
该CRISPR基因编辑流程可使研究人员快速构建一系列携带不同miRNA基因簇缺失组合的细胞系。本方案中，通过转染由5'和3'基因组位点特异性crRNA与合成的tracrRNA以1:1摩尔比退火形成的合成向导RNA，避免了耗时的质粒载体亚克隆步骤，同时可在24孔板体系中实现更灵活、高通量的实验设计。构建携带DOX诱导型Cas9慢病毒表达盒的细胞系，可在向导RNA转染期间实现DOX严格调控下的强效Cas9表达，并在后续步骤中通过从培养基中撤除DOX，迅速清除该细菌蛋白。本方案还依赖粗制细胞裂解液进行PCR基因分型，仅需极少量细胞材料即可完成分析，无需使用昂贵且耗时的硅胶柱DNA纯化方法，也无需使用分光光度计测定核酸浓度，从而进一步简化了实验流程。
事实上，本文展示的代表性结果表明，该方法已成功应用于单次实验中转染32种不同向导RNA组合的人前列腺癌细胞系，并获得了多个单细胞克隆敲除细胞系，这些细胞系携带整个约35 kb的miR-888簇区域的缺失；同时还获得了属于miR-743和miR-891a家族的miR-888簇成员的较小片段缺失组合，以及miR-888簇内各个miRNA成员的单独.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
PC3-ML 细胞系由马克·斯特恩（Mark Stearn，费城德雷塞尔大学医学院）惠赠。贾斯汀·托克西（Justin Toxey）协助完成了PCR基因分型。本研究得到了布里丹·亚当斯基金会资助项目、瑞安转化研究基金以及弗吉尼亚州卫生研究委员会资助项目（CHRB-274-11-20）对AE-K的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.2 mL PCR管，平头盖 | Fisher | 14-230-225 | 塑料耗材 |
| 1.5 mL 微量离心管 | Seal-Rite | 1615-5500 | 塑料耗材 |
| 24孔组织培养板 | Corning Costar | 09761146 | 塑料耗材 |
| 5x Phusion HF Buffer | Thermo Scientific | F-518L | PCR试剂，基因分型 |
| 6孔组织培养板 | Fisher | FB012927 | 塑料耗材 |
| 96孔组织培养板 | Falcon | 08-772-2C | 塑料耗材 |
| 抗CRISPR-Cas9抗体 [7A9-3A3]，小鼠单克隆 | AbCam | ab191468 | Western blot试剂；160 kDa；稀释比例1:200 |
| 抗生素-抗真菌剂（100倍浓缩液） | Gibco | 15240062 | 组织培养试剂 |
| BLAST 核苷酸搜索工具 | 美国国家生物技术信息中心 | NA | 免费软件；网站：blast.ncbi.nlm.nih.gov |
| Blasticidin S盐酸盐，来自Streptomyces griseochromogenes | Calbiochem | CAS 589205 | CRISPR试剂；化学物质，工作液浓度=1 mg/mL水溶液 |
| Countess 3 自动细胞计数仪 | Invitrogen | A50298 | 设备；细胞计数仪 |
| 冻存管 | Thermo Scientific | 50001012 | 塑料耗材 |
| Dharmacon CRISPR 设计工具 | Horizon Discovery Ltd. | NA | 免费软件；网站：horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer |
| DharmaFECT siRNA 转染试剂 #2 | Dharmacon, Inc. | T-2002-02 | 转染试剂；适用于LNCaP和PC3-ML细胞系 |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Fisher | BP231100 | 组织培养试剂 |
| 含L-谷氨酰胺、4.5 g/L葡萄糖和丙酮酸钠的DMEM培养基 | Corning | MT10013CV | 组织培养试剂；PC3-ML细胞培养用培养基 |
| 盐酸多西环素，即用型溶液 | Sigma-Aldrich | D3072-1ML | CRISPR试剂；化学物质，工作液浓度=1 mg/mL水溶液 |
| 不含钙、镁的DPBS | Gibco | 14190144 | 组织培养试剂 |
| Edit-R CRISPR-Cas9 合成tracrRNA，20 nmol，已设计 | Dharmacon, Inc. | U-002005-20 | CRISPR试剂；通用tracrRNA寡核苷酸 |
| Edit-R 修饰合成crRNA， 脱盐/去保护，2 nmol | Dharmacon, Inc. | crRNA-460XXX | CRISPR试剂；已设计crRNA寡核苷酸 |
| EditR 可诱导慢病毒hEF1aBlastCas9核酸酶颗粒，50 μL，107 TU/mL | Dharmacon, Inc. | VCAS11227 | CRISPR试剂；Lenti-iCas9；多西环素可诱导的慢病毒化脓性链球菌Cas9载体系统 |
| Ensembl 基因组浏览器 | Ensembl | NA | 免费软件；网站：[ensembl.org] 用途：基因组浏览器，用于识别包含miRNA簇及其周围基因/调控序列的核苷酸序列 |
| GAPDH抗体（FL-335），兔多克隆 | Santa Cruz Biotechnology | sc25778 | Western blot试剂；37 kDa；稀释比例1:500 |
| 凝胶/PCR DNA片段提取试剂盒 | IBI Scientific | IB47010 | 核酸凝胶电泳试剂 |
| 经认证的Gibco胎牛血清 | Gibco | 16000044 | 组织培养试剂 |
| 六亚甲基溴化铵 | MilliporeSigma | H9268 | CRISPR试剂；化学物质，工作液浓度=0.8 mg/mL |
| Immobilon-FL PVDF膜 | MilliporeSigma | IPFL10100 | Western blot试剂；硝酸纤维素膜 |
| Intercept（TBS）封闭缓冲液 | LI-COR | 927-60001 | Western blot试剂 |
| IRDye 680RD 山羊抗小鼠IgG二抗 | LI-COR | 926-68070 | Western blot试剂 |
| IRDye 800CW 山羊抗兔IgG二抗 | LI-COR | 926-32211 | Western blot试剂 |
| 微量离心机 | Eppendorf | 5425 R | 塑料耗材 |
| miRBase microRNA浏览器 | miRBase | NA | 免费软件；网站：[mirbase.org] 用途：浏览器列出所有已注释的miRNA发夹结构、成熟miRNA序列以及位于10 kb范围内的成簇miRNA |
| NuPAGE 4至12%，Bis-Tris，1.0 mm，迷你蛋白凝胶，10孔 | Invitrogen | NP0321BOX | Western blot试剂 |
| Odyssey CLx 成像系统 | LI-COR | CLx | 设备；Western blot成像 |
| Opti-MEM 减血清培养基 | Gibco | 31985062 | 转染试剂 |
| Owl D2 宽胶电泳系统 | Owl | D2-BP | 设备；核酸凝胶电泳系统 |
| PCR引物，已设计（单链DNA寡核苷酸） | Integrated DNA Technology | NA | PCR试剂，基因分型 |
| Phusion高保真DNA聚合酶（2 U/µL） | Thermo Scientific | F530S | PCR试剂，基因分型 |
| RIPA裂解缓冲液（10倍浓缩液） | MilliporeSigma | 20-188 | Western blot试剂 |
| 蛋白酶K溶液（20 mg/mL），RNA级 | Invitrogen | 25530049 | PCR试剂，基因分型 |
| 无DNA酶、蛋白酶和RNase A（10 mg/mL） | Thermo Scientific | EN0531 | PCR试剂，基因分型 |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | MT10041CV | 组织培养试剂；LNCaP细胞培养用培养基 |
| SnapGene Viewer | Snap Gene | NA | 免费软件；网站：[snapgene.com] 用途：DNA序列注释软件，用于创建gRNA设计用的DNA文件， 并高亮显示miRNA簇位点（基因间区、内含子区）、属于该miRNA簇的各个miRNA发夹序列，以及其他邻近的编码和非编码基因和/或调控元件 |
| TrypLE Select酶（1倍），无酚红 | Gibco | 12563029 | 组织培养试剂；重组胰蛋白酶 |
| UltraPure琼脂糖 | Invitrogen | 16500100 | 核酸凝胶电泳试剂 |
| Veriti 96孔快速热循环仪 | ThermoFisher Scientific | 4375305 | 设备 |
| XCell SureLock 迷你电泳系统 | Invitrogen | EI0001 | 设备；蛋白凝胶电泳系统 |
参考文献
- Hasegawa, T., Lewis, H., Esquela-Kerscher, A. Translating MicroRNAs to the Clinic. Laurence, J. , Academic Press. 329-369 (2017).
- Lewis, H., Esquela-Kerscher, A. Systems Biology of Cancer. Thiagalingam, S. , Cambridge University Press. Ch. 9 134-153 (2015).
- Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J.
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重印与许可
