用于微小RNA簇网络分析的CRISPR基因编辑工具

摘要

本方案描述了一种高通量的成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）基因编辑工作流程，用于微小RNA（miRNA）簇网络分析，可在单次实验中快速构建一系列基因修饰的细胞系，这些细胞系携带不同miRNA簇成员的特异性缺失组合，缺失片段长度可达35 kb。

摘要

microRNA（miRNA）已成为癌症及转移过程中重要的细胞调控因子（肿瘤抑制因子、促癌因子）。大多数已发表的研究在描述小RNA在癌症中的作用时，通常只关注单个miRNA。然而，约30% 的人类miRNA基因以成簇的形式排列，这些基因通常共同表达，表明存在一个复杂且协调的非编码RNA调控系统。在将非编码小RNA转化为临床应用之前，有必要更清晰地理解成簇miRNA网络如何协同调控肿瘤生长、癌症侵袭性及药物耐药性。

已采用高通量的CRISPR介导的基因编辑方法，研究位于前列腺癌相关基因组区域（长度约35,000 bp）内由七个miRNA基因组成的基因簇在肿瘤发生中的作用。该方法中，将人癌细胞系感染携带多西环素（DOX）诱导型Cas9核酸酶的慢病毒载体，并在含DOX的培养基中培养48小时。随后，细胞共转染合成的反式激活CRISPR RNA（tracrRNA）与针对基因组特定位点的CRISPR RNA（crRNA）寡核苷酸复合物，从而在单次实验中快速生成携带整个miRNA基因簇缺失、或单个及组合性miRNA基因簇缺失的癌细胞系。

该高通量基因编辑系统的优势在于能够避免耗时的DNA载体亚克隆步骤，可在24孔板中灵活地以不同的向导RNA组合转染细胞，以及利用粗制细胞裂解液进行低成本的PCR基因分型。采用这一简化方法的研究有望揭示miRNA簇成员之间的功能冗余性以及协同或拮抗相互作用，从而有助于阐明参与人类疾病的复杂小非编码RNA网络，并为未来的治疗设计提供更充分的依据。

引言

需要更先进的研究工具来探究非编码RNA在人类疾病中的作用。在比较癌症患者与非癌症健康个体的组织和体液（如血液、尿液）中这些小分子非编码RNA的表达谱时，常观察到miRNA的失调现象，这一分析通常采用微阵列、实时定量PCR（qRT-PCR）以及下一代深度测序技术^1,2。近期研究已明确其中大量miRNA为肿瘤抑制因子、致癌因子或转移相关因子，能够调控肿瘤形成、疾病进展及药物耐药性。实验性地上调和/或下调/缺失miRNA会导致细胞产生功能性和多效性后果，反映出这些非编码RNA所协调的多种癌症相关活动——包括细胞增殖、凋亡、分化、染色质重塑、血管生成、上皮-间质转化（EMT）与间质-上皮转化（MET）、代谢以及免疫应答³。

miRNA 可作为单个基因编码，或位于基因组簇中，这些基因簇在细胞核内被转录，并经过广泛加工后生成定位于细胞质中的生物学成熟单链 miRNA，长度约为 22 个核苷酸（nt）⁴。这些小 RNA 在转录后水平发挥作用，作为负性基因调控因子，以序列特异性方式结合信使 RNA（mRNA）靶标，从而将催化性的 RNA 诱导沉默复合体（RISC）引导至 mRNA 位点，导致 mRNA 降解和/或阻断蛋白质翻译。miRNA 是动物系统中极为丰富的一类非编码 RNA，人类基因组中存在 2,654 种成熟 miRNA（miRBase 版本 22.1）⁵。miRNA 通常以其与靶标 mRNA 不完全互补的方式结合⁴。因此，单个 miRNA 可调控数十至数百个不同的 mRNA 靶标，并在功能上影响广泛的生物学通路。此外，由于单个 mRNA 可被多个不同的 miRNA 调控，miRNA 调控机制的复杂性进一步增加。因此，研究 miRNA 表达失调如何破坏机体的稳态平衡并导致人类恶性疾病具有很大挑战性。

大多数已发表的研究在描述miRNA在疾病事件中的作用时，通常只关注单个miRNA。然而，约30% 的人类miRNA基因以成簇形式排列（通常约为10千碱基[kb]），这些基因通常以相同方向转录并共表达，表明存在一种协调且复杂的非编码RNA调控系统⁶。目前已知最大的人类多顺反子miRNA簇是位于14q32的簇，包含54个miRNA前体。其中，与人类癌症关系最为密切且研究最为深入的成簇miRNA之一是miR-17-92多顺反子簇，该簇包含miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1，位于非编码RNA c13orf25 的第3个内含子中。miR-17-92簇在造血系统恶性肿瘤中常发生扩增，在实体瘤中常过表达，并已被证实具有促进细胞周期进程、抑制凋亡以及促进血管生成等致癌功能⁷。此外，位于非编码基因 Leu2 内含子中的肿瘤抑制性miR-15a和miR-16-1簇在白血病中常被缺失，并在多种癌症中表达下调，其通过靶向抗凋亡基因 BCL2 及其他细胞周期调控基因来抑制肿瘤生长⁸。miR-888簇在高级别前列腺癌患者中表达升高，该簇由位于人类X染色体Xq27.3上的七个miRNA基因（miR-892c、-890、-888、-892a、-892b、-891b和-891a）组成^9,10。

miR-888 基因簇位于 HPCX1 位点（X 连锁遗传性前列腺癌 1，Hereditary Prostate Cancer, X-linked 1），该位点跨越 Xq27-2 区域，是通过对遗传性前列腺癌家系谱系进行连锁分析而鉴定出来的^{11,12,13,14,15,29}。利用传统的 miRNA 异位表达工具——miRNA 模拟物（mimics）和反义抑制剂——对 miR-888 基因簇中各个成员进行功能表征，结果表明这些 miRNA 在调控前列腺肿瘤生长和侵袭过程中发挥着部分重叠的作用^9,10。然而，这些实验方法难以有效研究多个 miR-888 基因簇成员如何在一个非编码 RNA 网络中协同或拮抗地发挥作用，以调控组织稳态及癌症进展。本文所述的优化实验流程采用高通量 CRISPR 基因编辑技术，经改造后可用于在分子水平上解析与人类癌症相关的 miRNA 基因簇（例如 miR-888 基因簇），从而填补这一知识空白。

细菌CRISPR及CRISPR相关（Cas基因介导针对噬菌体的适应性免疫¹⁶该古老原核生物监控系统的发现很快被开发为一种高效的科学工具，可轻松靶向任意特定基因组位点，并在多种动物体系和细胞类型中实现广泛范围的DNA序列修饰 体外 和 体内^16,17该技术作为一种在人类疾病背景下研究miRNA网络的有效方法，具有广阔的应用前景。为此，本研究建立了高通量CRISPR基因编辑方案，用于分析跨越人类X染色体约35 kb的miR-888簇，在永生化人前列腺癌细胞系（LNCaP、PC3-ML）中探究该簇内各成员如何协同调控癌症进展通路。该方法可推广应用于任意miRNA簇的功能鉴定，使研究人员能够在单次实验中快速构建携带完整miRNA簇缺失、单个miRNA基因缺失以及多种miRNA基因组合缺失的人源细胞系。

在此实验流程中，建立的稳定细胞系携带一种强力霉素（DOX）诱导型慢病毒表达系统，该系统使研究者能够通过组成型DOX诱导型启动子TRE3G来调控Streptococcus pyogenes CRISPR相关内切酶Cas9 (csn1)基因的表达。Tet-On 3G双组分系统利用人延伸因子1α（hEF1alpha）的组成型启动子驱动Tet-On 3G基因和杀稻瘟菌素抗性基因（Blast^R）的转录，形成一个双顺反子转录本。Tet-On 3G转录激活蛋白仅在DOX存在时结合TRE3G启动子，从而引发强烈的Cas9转录。在无DOX条件下，Cas9的基础表达水平极低或几乎检测不到。因此，研究者可在CRISPR基因编辑步骤中，通过在培养基中添加DOX诱导细胞内高水平Cas9蛋白的表达，并在撤除DOX后实现Cas9蛋白的快速清除，以进行有效对照。

本方案还描述了设计合成的靶向整个miRNA簇、单个miRNA发夹结构（premiRNA）区域和/或簇内miRNA基因子集侧翼区域的CRISPR RNA（crRNA）寡核苷酸。每个设计的crRNA包含一个独特的5'端20 nt向导序列（与目标基因组序列互补），其后是一个不变的22 nt S. pyogenes 重复序列（5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG-3'），该序列可与通用的反式激活CRISPR RNA（tracrRNA）寡核苷酸进行碱基配对¹⁸。退火后的crRNA与tracrRNA（按1:1比例混合）共同构成本方案所用的向导RNA（图1A）。在每次实验中，将两种合成的向导RNA转染至DOX诱导的细胞中，使其结合并引导细菌Cas9蛋白至目标miRNA簇区域两侧的基因组DNA位点（5'和3'端），以实现该区域的切除（图1B）。

原间隔序列邻近基序（PAM）序列（对于野生型S. pyogenes Cas9为5'-NGG-3'）必须存在于细胞基因组中，并紧邻由向导RNA靶向的20 nt DNA序列¹⁷。PAM序列作为结合信号，将内切酶Cas9的催化区域定位到靶向的基因组DNA位点，随后在PAM上游约3 nt处引发定向的双链（ds）DNA切割。细胞的DNA修复机制会修复被切断的DNA末端，可能实现精确连接，但通常发生非同源末端连接（NHEJ），导致修复位点出现小片段的插入或缺失（indels）。由于miRNA是非编码基因，常位于基因间区和内含子区域，因此这些插入或缺失产生非预期的无义突变或错义突变的风险较低。

在这些实验中，通过使用编码向导RNA复合物的合成RNA寡核苷酸（crRNA与tracrRNA以1:1摩尔比退火），该基因敲除策略避免了耗时的DNA载体亚克隆过程，并可在24孔板体系中灵活转染多种独特的向导RNA组合至细胞。通过制备粗制细胞裂解液进行PCR基因型筛选，同样避免了昂贵且耗时的DNA纯化方法，同时实现了高效便捷的单克隆细胞系构建与表型分析。事实上，该高通量CRISPR基因编辑方案已成功应用于单次实验中对培养的前列腺癌细胞系（LNCaP、PC3-ML）转染32种不同的向导RNA组合，获得了敲除株，其缺失区域涵盖整个约35 kb的miR-888簇区段；还包括属于miR-743和miR-891a家族的miR-888簇成员的较小缺失组合；以及miR-888簇内各个miRNA成员的单独缺失。此类研究将有助于更清晰地理解成簇分布的miRNA如何协同调控肿瘤生长、侵袭性及药物耐药性，从而为将来将miRNA转化为临床治疗与诊断工具奠定基础。

方案

1. 准备CRISPR基因编辑并设计向导RNA以生成miRNA簇敲除细胞系

1. 使用DNA序列注释软件程序创建一个包含目标miRNA簇区域（基因间区、内含子区）完整基因组序列以及至少1 kB周围基因组区域的DNA文件¹⁹。
   1. 在所创建的DNA文件中，使用特征编辑工具标记目标miRNA簇位点（基因间区、内含子区）以及属于该miRNA簇的各个单独miRNA发夹结构序列，并标注附近其他编码和非编码基因和/或调控元件^5,20,21,22。
   2. 确保目标miRNA区域的删除不会意外破坏邻近的蛋白编码基因、非编码基因或重要的调控DNA元件。
      注：请考虑本实验方案所用细胞系的基因组复杂性（例如染色体重复/融合）。
2. 使用生物信息学向导RNA设计软件工具（例如²³），设计靶向整个miRNA簇、单个miRNA发夹结构（pre-miRNA）区域和/或簇内miRNA基因子集两侧约20 nt基因组DNA序列的合成crRNA。确保在向导RNA设计工具中注明适用的Cas9酶（即S. pyogenes Cas9）。
   注：合成的crRNA将包含一个独特的5'端20 nt向导序列（与DNA靶标互补），后接一段不变的22 nt S. pyogenes 重复序列，以便与合成的通用tracrRNA寡核苷酸进行碱基配对。两者退火后，在本实验方案中共同发挥向导RNA的功能。
   1. 参考已创建的DNA文件（步骤1.1），将紧邻目标miRNA发夹/簇位点上游（5'）或下游（3'）约150 nt的DNA序列输入至生物信息学向导RNA设计软件工具²³。
      注：该设计工具将识别出紧邻PAM序列（非靶链上）的独特20 nt序列，用于crRNA寡核苷酸设计（例如S. pyogenes Cas9的PAM序列为NGG）。以下为一个crRNA设计示例，靶向mir-891a基因位点正上游（5'）的位点（具体为结果部分和表1中讨论的5A(891a)）。
      1. 打开向导RNA设计软件工具²³。
      2. 在Enter Name窗口中输入名称5A(891a)。
      3. 在Enter a DNA sequence窗口中，输入紧邻mir-891a前体基因上游（5'）的150 nt基因组序列：5'-AAGAAAATATACATGCTGATAGTTACACAGG
         TTGTGAATAGTAAATTAGTATGTCATTTATTT
         TAGGTATTCAATGTTGCATAGTCATATTATA
         ATTACGTAGCTTCTTTGTTTTTTTCTAGGTT
         CCCAAAGAGTCTACAAATGTTGTCT-3'
      4. 勾选Enable Specificity Check选项，以排除程序计算检测到的脱靶位点。选择正确的物种（即Human [Homo sapiens]）。
      5. 指定本研究中使用的正确Cas9酶PAM，此处为Streptococcus pyogenes Cas9-PAM:NGG，以生成以下默认设置：PAM相对于靶标的位置：之后；重复序列：GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG；相对于向导链的位置：3'；靶序列长度：20；切割位点相对于靶标5'起始位置：正义链17，反义链17。
      6. 点击Next按钮，查看用于合成crRNA的结果。
         注：在此示例中，建议合成的crRNA将识别DNA靶标ATACATGCTGATAGTTACAC，并位于PAM:AGG的邻近位置。
   2. 参考DNA文件（步骤1.1中创建）确定最靠近待删除miRNA位点、且对目标基因组位点具有最高特异性的候选crRNA 20 nt靶序列。
      1. 使用计算脱靶分析工具评估候选crRNA的特异性，并预测与目标miRNA簇区域无关的基因组位点中可能的脱靶位点（例如^24,25,26,27）。
      2. 记录潜在的脱靶结果，以便后续通过PCR对单克隆CRISPR克隆细胞系进行基因分型时参考（步骤4.2.6）。
         注：设计的crRNA寡核苷酸与基因组靶序列之间的序列互补程度将决定Cas9酶在该位点切割基因组的选择性。由于向导RNA以3'到5'方向与基因组靶标退火，DNA靶序列5'端（前8–10个碱基）的错配通常会阻断Cas9介导的切割。如果基因组靶序列与另一基因组位点同源，但前八个碱基不同，则预测该向导RNA在此位点脱靶的可能性较低。
      3. 为每个目标miRNA位点设计四个独特的crRNA：两个crRNA靶向miRNA发夹/簇紧邻的5'侧互补DNA序列（5'A, 5'B），另两个crRNA靶向紧邻的3'侧互补DNA序列（3'A, 3'B）。
         注：在进行CRISPR转染（第3节）时，将对每个目标miRNA位点测试四种可能的5'和3'向导RNA配对组合（5'A + 3'A；5'A + 3'B；5'B + 3'A；5'B + 3'B），以提高单次实验中成功生成miRNA位点缺失的概率。
      4. 在已创建的DNA文件（步骤1.1）中使用特征编辑工具，标记每个拟合成crRNA对应的DNA靶序列（含邻近PAM）。
3. 设计并合成位于目标miRNA簇区域两侧的PCR引物（正向、反向），用于CRISPR细胞系的基因分型（并在创建的DNA文件中标注这些引物）。
   1. 对于携带小片段基因组缺失（适用于紧密排列或单个miRNA）的细胞系进行基因分型时，设计位于Cas9切割位点/敲除区域两侧约150 bp处的PCR引物（正向、反向），以便通过凝胶电泳在单次PCR反应中同时检测野生型（约600 bp）和敲除型（约300 bp）DNA片段。
   2. 对于携带大片段基因组缺失（适用于miRNA前体组合或整个miRNA簇）的细胞系进行基因分型时，同样设计位于Cas9切割/敲除位点两侧约150 bp处的PCR引物（正向、反向）。需注意，若目标miRNA簇缺失长度超过>4 kb，则PCR反应很可能仅能检测到较小的敲除DNA片段（约300 bp），而无法检测野生型DNA片段。因此，应额外设计可检测miRNA簇内部基因存在或缺失的PCR引物（正向、反向），以辅助筛选过程 并验证纯合敲除细胞系。

2. 构建携带DOX诱导型Cas9表达盒的稳定慢病毒细胞系

注意：所有细胞培养和病毒操作均须在经认证的生物安全柜中进行，并采用 BSL2 级别操作规程和无菌技术。

1. 确定适用于CRISPR研究的细胞系类型及首选培养基。
   注意：本实验方案适用于人前列腺癌细胞系LNCaP（推荐培养基：RPMI，10%胎牛血清[FBS]）和PC3-ML（推荐培养基：DMEM，10% FBS）。
2. 进行杀稻瘟菌素筛选 "死亡" 曲线以确定用于筛选携带杀稻瘟菌素抗性基因盒的慢病毒转导细胞的最佳药物浓度（步骤 2.3）。
   1. 将细胞接种至24孔板的11个孔中，在37 °C、5% CO₂条件下培养₂ 在优选培养基中培养至约75%汇合度。
   2. 将杀稻瘟菌素（工作液浓度为1 mg/mL）用优选培养基稀释，终浓度范围为0、1至10 µg/mL，以1 µg/mL为增量梯度稀释。
   3. 将已接种的24孔板的孔按1至11编号。吸去各孔中的生长培养基，更换为相应浓度的杀稻瘟菌素溶液。
   4. 每隔一天更换一次含适当浓度杀稻瘟菌素的培养基，持续 7-10 天。
   5. 在实验期间每天观察细胞，确定在5-7天内能够杀死所有细胞的最低杀稻瘟菌素浓度。
      注意：一种杀稻瘟菌素 "杀死" 每项CRISPR基因编辑实验所使用的特定细胞系均需进行标准曲线测定。
3. 用携带DOX诱导型Cas9表达盒的慢病毒感染细胞，并使用步骤2.2中确定的最佳浓度进行blasticidin筛选。
   1. 在6孔板的3个孔中，接种5 × 10⁴ 每孔细胞数及在37 °C、5% CO₂条件下于优选培养基中培养₂ 过夜（ON）。
   2. 第二天，将用于DOX诱导型Cas9表达的慢病毒载体（Lenti-iCas9）置于冰上解冻。轻轻混匀（切勿涡旋病毒颗粒）。
      注意：将慢病毒分装后于 -80 °C 保存，避免反复冻融，以免降低病毒滴度和感染效率。
   3. 计算转导 5 × 10 所需的体积⁴ 根据病毒滴度浓度，以0.3的感染复数（MOI = 0.3）用病毒接种细胞。
   4. 将适量病毒液加入250 µL（每孔）不含血清和抗生素的适宜培养基中，培养基中添加0.8 µg/mL的六亚甲基溴化铵。轻轻混匀。
      注意：六亚甲基溴化铵是一种阳离子聚合物，可提高病毒吸附和感染效率。
   5. 移除培养基。向细胞中加入250 µL含有Lenti-iCas9病毒（MOI = 0.3）的制备好转导培养基，于37 °C、5% CO₂条件下过夜孵育。₂（如果细胞出现病毒相关的毒性效应，可将孵育时间缩短至4-6小时。）
   6. 更换为新鲜的适宜培养基，让细胞恢复1-2天。
   7. 对感染的细胞使用最佳浓度的杀稻瘟菌素进行10-14天的筛选，该浓度源自先前的 "杀死" 步骤2.2中描述的曲线
      1. 同时，将未感染的细胞在含有最佳浓度杀稻瘟菌素的培养基中培养，作为病毒筛选的阳性对照。
   8. 每3天更换一次含有最佳浓度杀稻瘟菌素的培养基，以在筛选期间清除死亡细胞。
      注意：只有在嘌呤霉素筛选中存活的细胞才可能整合了慢病毒载体。
   9. 扩增经杀稻瘟菌素筛选的Lenti-iCas9细胞系。
      注意：每次扩增时记录细胞传代次数。
      1. 将部分Lenti-iCas9细胞在添加了10%二甲基亚砜（DMSO）的适宜培养基中冷冻，用于长期冻存。
      2. 通过蛋白质印迹法分析部分 Lenti-iCas9 细胞⁹ 以确定表现出最强DOX诱导型Cas9蛋白水平的细胞系（参见步骤2.3）。
4. 对新建立的Lenti-iCas9细胞系进行多西环素浓度梯度实验，以确定Cas9蛋白诱导的最佳条件。
   1. 为每种受试细胞系设置四个独立的6孔板，以进行该多西环素（DOX）浓度时间过程实验。每孔接种5 × 10⁵个细胞。⁴ 每孔细胞接种量为6孔板的指定数量，并在37 °C、5% CO₂条件下培养₂ 在优选培养基中孵育 24 小时。
   2. 将DOX（工作液浓度1 mg/mL）用首选培养基稀释，配制终浓度分别为0、50、100、150、250和500 ng/mL的DOX浓度梯度。
   3. 将每个接种好的6孔板的孔标记为1至6。吸去培养基，更换为相应浓度的DOX。继续培养1-4号板，分别在以下时间点终止实验：DOX诱导24 h、48 h和72 h；以及撤除DOX后120 h（初始为72 h DOX诱导）。
   4. 在每个时间点使用适当方法（如胰酶消化法）收集培养板中的细胞，将细胞沉淀于 -80 °C 保存。使用 RIPA 缓冲液处理细胞沉淀，进行裂解液提取及 Cas9 蛋白的 Western blot 分析。
      1. 每个DOX诱导时间点的样品取40 µg细胞裂解液，使用变性的4%-12% Bis-Tris凝胶进行电泳，并将蛋白质转移至免疫印迹膜上。
      2. 将免疫印迹膜与针对Cas9的一抗杂交，以检测160 kDa蛋白。使用GAPDH等看家基因对Cas9表达水平进行归一化处理。 GAPDH （37 kDa）
   5. 根据 Western blot 结果，确定在 Lenti-iCas9 细胞系中诱导 Cas9 表达的最佳 DOX 浓度。
      注意：该时间进程还将揭示在撤除DOX后120小时，Cas9表达受到调控的紧密程度。
   6. 为Lenti-iCas9细胞系建立单细胞克隆，筛选出Cas9蛋白表达稳定的克隆，以优化CRISPR转染实验（见第3节）。

3. 采用高通量形式通过Cas9诱导和合成向导RNA转染细胞进行CRISPR反应

注意：工作流程图见图1。

1. 在纸上规划将转染至24孔板各孔中的crRNA配对组合，以靶向整个miRNA簇、不同的成簇miRNA基因组合以及各个miRNA簇成员。
   1. 在示意图上，为每个靶向的miRNA位点标记四个孔。每个孔代表一次转染反应，其中包含两个独特的crRNA，分别位于目标miRNA敲除基因组位点的5'端和3'端，并与tracrRNA以1:1摩尔比退火。
   2. 确保所标记的四个孔各自代表一组独特的crRNA配对（例如，5'A + 3'A；5'A + 3'B；5'B + 3'A；5'B + 3'B）。
      注：在每个靶向miRNA位点两侧设计两个5' crRNA和两个3' crRNA（第1节），可在转染反应中生成四种可能的5'和3'向导RNA配对。
2. 将Lenti-iCas9细胞系以5 × 10⁴ 个细胞/孔接种于24孔板中，使用含优化浓度DOX（由步骤2.4确定）的适宜培养基。在37 °C、5% CO₂条件下培养24–48小时，以诱导Cas9蛋白表达。
3. 使用已制备的5'和3'向导RNA对Lenti-iCas9细胞进行转染。
   1. 用无核酸酶水将合成的crRNA和tracrRNA寡核苷酸重新溶解，配制成10 µM的储存液。长期保存于-80 °C。
   2. 根据步骤3.1中设计的实验示意图，为每个靶向miRNA位点标记四个1.5 mL微量离心管，分别对应四种可能的5'和3' crRNA配对组合（5'A + 3'A；5'A + 3'B；5'B + 3'A；5'B + 3'B）。
   3. 在每根管中，将tracrRNA与独特的crRNA（5'和3'）按1:1摩尔比混合，形成2 µM的向导RNA复合物，反应体系如下（终体积10 µL）：
      1. 向1.5 mL离心管中加入2.5 µL tracrRNA（10 µM储存液）、1.25 µL 5'端crRNA（10 µM储存液）、1.25 µL 3'端crRNA（10 µM储存液）以及5 µL 10 mM TRIS-HCL（pH 7.5）。以16,000 × g短暂离心30秒以混匀。室温（RT）孵育5分钟。
   4. 向每根管中加入40 µL低血清培养基（如Opti-MEM），与10 µL向导RNA复合物反应液混合（总体积50 µL）。通过上下吹打轻柔混匀。
   5. 在洁净的1.5 mL离心管中，将2 µL转染试剂²⁸ （见注3.3.5.1）与48 µL低血清培养基（如Opti-MEM，终体积50 µL）通过上下吹打轻柔混合。室温孵育5分钟。
      1. 通过将转染试剂（2 µL）和低血清培养基（如Opti-MEM，48 µL）的用量乘以待转染孔数再增加10%额外体积（以补偿移液误差），配制转染试剂主混合液。
         注：应选择适用于小RNA和CRISPR RNA寡核苷酸转染、且适用于该细胞系类型的转染试剂²⁸。
   6. 向每根含有50 µL向导RNA混合液（来自步骤3.3.4）的管中加入50 µL稀释后的转染试剂（来自步骤3.3.5）。缓慢吹打混合一次。室温孵育20分钟。
   7. 向每根含有100 µL向导RNA/转染混合液的管中加入400 µL不含抗生素但补充了DOX（最适浓度）的培养基。轻柔吹打混匀。
4. 移除DOX诱导的Lenti-iCas9细胞（步骤3.2）中的培养基。根据24孔板实验示意图（步骤3.1），每孔加入500 µL培养基/DOX/向导RNA/转染混合液。将转染后的细胞在37 °C、5% CO₂条件下孵育48小时。
5. 更换为不含DOX的新鲜适宜培养基（以清除细胞内的Cas9蛋白）。在37 °C、5% CO₂条件下继续培养24–48小时，使细胞恢复。
6. 收集转染后的细胞（胰酶消化），并准备进行基因分型和单细胞稀释。
   注：此时细胞为混合群体，包含转染后经CRISPR基因编辑的细胞和未转染的野生型细胞。此步骤将在投入时间和资源进行单细胞克隆扩增前，评估CRISPR编辑效率。
   1. 用1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞一次。加入100 µL胰酶，在37 °C、5% CO₂条件下孵育5分钟，随后将细胞转移至含1 mL培养基的洁净1.5 mL离心管中。
   2. 颠倒混匀后，在20 °C、200 × g条件下微量离心5分钟。弃去培养基，将细胞沉淀重悬于1 mL PBS中。
   3. 将洗涤后的细胞在20 °C、200 × g条件下微量离心5分钟。弃去PBS，将细胞沉淀重悬于150 µL适宜培养基中。
7. 使用血细胞计数板或自动细胞计数仪测定150 µL重悬细胞中每微升的细胞数量。
8. 将150 µL重悬细胞均分为三部分。
   1. 取其中1/3转染细胞（50 µL），加入培养基和10% DMSO（终体积150 µL），分装至冻存管中，用于后续扩增或长期保存。
   2. 取其中1/3转染细胞（50 µL）转移至洁净的0.2 mL PCR管中用于基因分型。
      1. 在4 °C、200 × g条件下微量离心5分钟，弃去培养基。
      2. 将细胞沉淀重悬于100 µL PBS中。
      3. 在4 °C、200 × g条件下微量离心5分钟，弃去PBS。将混合群体的细胞沉淀长期保存于-80 °C。
      4. 按照第4节流程对细胞沉淀进行基因分型处理。
   3. 将最后1/3细胞（50 µL）进行稀释并接种至96孔板，用于生成单细胞克隆。
      1. 根据步骤3.7的细胞计数结果，计算所需稀释倍数，使96孔板每孔100 µL培养基中含有10、5、2或1个细胞。
      2. 使用12通道多通道移液器和无菌试剂储液槽，将稀释后的细胞按每孔100 µL加入96孔板的两行（共24孔），每种稀释度（10、5、2或1个细胞/孔）各设两行。培养4–6周，直至细胞长至汇合，完成单细胞克隆扩增。每周在光学显微镜下观察细胞生长情况，记录克隆是否为单细胞来源。
      3. 收集约10–15个单细胞克隆进行基因分型（第4节）。为每个靶向miRNA位点鉴定至少三个独立的敲除型单细胞克隆株。保留野生型单细胞克隆株作为对照。
         注：筛选数量取决于细胞系类型及miRNA敲除表型对细胞生长/存活的影响。

4. 使用粗制细胞裂解液对 CRISPR 细胞系进行 PCR 基因分型

1. 从接近汇合的96孔板中收获单个单细胞克隆。
   注意：这些步骤中所述的培养基/PBS去除操作可在生物安全柜中使用真空抽吸装置手动完成，但需注意避免交叉污染。抽吸时，对96孔板的每个孔均应使用新的无菌"黄色" 200 µL移液器吸头，每次更换的黄色吸头应牢固安装在连接至真空抽吸装置的无菌玻璃巴斯德吸管末端。
   1. 用100 µL PBS洗涤各孔1次，随后吸除PBS。
   2. 加入50 µL胰蛋白酶，在37 °C、5% CO₂条件下孵育2–5分钟。
   3. 轻柔吹打使细胞重悬，然后将细胞转移至含有1 mL培养基的1.5 mL离心管中。
   4. 颠倒混匀，并在20 °C下以200 × g离心5分钟，使细胞形成沉淀。
   5. 去除培养基，加入1 mL PBS。轻弹管壁以打散沉淀，并反复颠倒数次以混匀。
   6. 在20 °C下以200 × g离心5分钟，使细胞沉淀。
   7. 去除PBS，将沉淀重悬于300 µL新鲜PBS中。
   8. 将300 µL样品分为两部分。
      1. 将200 µL细胞（沉淀的2/3）转移至含有1 mL优选培养基的24孔板孔中。待基因型验证后，使用这些细胞扩增CRISPR介导的基因敲除细胞系，用于功能分析。
      2. 将100 µL细胞（沉淀的1/3）转移至0.2 mL PCR管中。在4 °C下以3,000 × g离心5分钟。去除PBS，将沉淀储存在-80 °C。
2. 使用步骤1.3中设计的PCR引物制备粗细胞裂解液，用于基因分型和序列分析。在实验中应包括未转染细胞制备的细胞裂解液，作为野生型阳性对照。
   1. 将细胞沉淀重悬于4 µL 5x DNA聚合酶缓冲液（参见材料表，终浓度为1x）、1 µL蛋白酶K（20 ng/mL储备液）、1 µL RNase A（10 ng/mL储备液）中，并用无核酸酶水补足至总体积20 µL。
   2. 在PCR仪中使用以下程序裂解细胞：56 °C孵育30分钟，96 °C孵育5分钟。将细胞裂解液储存于-20 °C。
   3. 使用设计的PCR引物（正向、反向）进行PCR反应，这些引物应位于引导RNA的5'和3'靶向位点两侧（表1）。
      注意：DNA聚合酶缓冲液和PCR仪反应条件取决于所用Taq DNA聚合酶的类型。本方案已针对Phusion HF DNA聚合酶进行优化。
      1. 在冰上配制PCR反应体系：5 µL 5x DNA聚合酶缓冲液、0.5 µL正向PCR引物（10 µM储备液）、0.5 µL反向PCR引物（10 µM储备液）、0.5 µL 10 mM dNTPs、0.25 µL DNA聚合酶、1–4 µL细胞裂解液，并用无核酸酶水补足至总体积25 µL。
      2. 在PCR仪中运行以下程序：98 °C预变性3分钟；进行35个循环（98 °C变性10秒，62 °C退火15秒，72 °C延伸15秒），最后72 °C延伸10分钟，4 °C保存。参见上述注意4.2.3。
   4. 将PCR产物上样至1%琼脂糖凝胶进行电泳分析。
   5. 从预测分子大小的PCR片段中提取DNA（包括敲除型和野生型基因型）。制备样品用于DNA测序。
   6. 验证CRISPR编辑是否成功，并对分离的PCR片段进行DNA测序，以确定Cas9切割位点并确认miRNA位点的缺失。
      1. 为每个CRISPR靶向的miRNA位点至少分离三个独立的基因敲除细胞系。保留野生型（及杂合型）细胞系，作为后续功能研究中的对照。
      2. 通过qRT-PCR或Northern印迹分析，确认敲除细胞系中不表达来自缺失位点的成熟miRNA。
         注意：全基因组测序（WGS）是验证CRISPR基因编辑及脱靶效应的最确凿方法。
      3. 通过PCR检测在计算上预测的CRISPR脱靶效应（见步骤1.2.3）^24,25,26,27。
      4. 若大量单细胞克隆筛选仅获得杂合基因型，可在单细胞杂合细胞系中重复引导RNA转染。
         注意：无法获得纯合敲除细胞系可能提示miRNA缺失具有致死效应，或亲本细胞系存在固有的基因组复杂性（如染色体重复/融合），需进一步分析。

结果

本研究成功应用了高通量CRISPR缺失技术，通过将靶向miR-888簇的合成寡核苷酸向导RNA转染至Cas9可诱导的LNCaP和PC3-ML人源癌细胞系，用于前列腺癌相关研究。miR-888簇最初在表达谱筛选中被发现，在高级别前列腺癌患者中的表达水平高于低级别及非癌症患者^9,10。该miR-888簇跨越35,124 bp，位于人类X染色体Xq27.3区域，包含7个miRNA（miR-892c、-890、-888、-892a、-892b、-891b和-891a）（图2A）。该基因座位于HPCX1（遗传性前列腺癌，X连锁1，Xq27-28）区域内，与遗传性前列腺癌相关^11,12,13,14,...

讨论

该CRISPR基因编辑流程可使研究人员快速构建一系列携带不同miRNA基因簇缺失组合的细胞系。本方案中，通过转染由5'和3'基因组位点特异性crRNA与合成的tracrRNA以1:1摩尔比退火形成的合成向导RNA，避免了耗时的质粒载体亚克隆步骤，同时可在24孔板体系中实现更灵活、高通量的实验设计。构建携带DOX诱导型Cas9慢病毒表达盒的细胞系，可在向导RNA转染期间实现DOX严格调控下的强效Cas9表达，并在后续步骤中通过从培养基中撤除DOX，迅速清除该细菌蛋白。本方案还依赖粗制细胞裂解液进行PCR基因分型，仅需极少量细胞材料即可完成分析，无需使用昂贵且耗时的硅胶柱DNA纯化方法，也无需使用分光光度计测定核酸浓度，从而进一步简化了实验流程。

事实上，本文展示的代表性结果表明，该方法已成功应用于单次实验中转染32种不同向导RNA组合的人前列腺癌细胞系，并获得了多个单细胞克隆敲除细胞系，这些细胞系携带整个约35 kb的miR-888簇区域的缺失；同时还获得了属于miR-743和miR-891a家族的miR-888簇成员的较小片段缺失组合，以及miR-888簇内各个miRNA成员的单独...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 mL PCR 管，平盖	Fisher	14-230-225	塑料器皿
1.5 mL 微量离心管	Seal-Rite	1615-5500	塑料器皿
24 孔组织培养板	Corning Costar	09761146	塑料器皿
5x Phusion HF 缓冲液	Thermo Scientific	F-518L	PCR 试剂，基因分型
6 孔组织培养板	Fisher	FB012927	塑料器皿
96 孔组织培养板	Falcon	08-772-2C	塑料器
皿抗 CRISPR-Cas9 抗体 [7A9-3A3]，小鼠单克隆	AbCam	ab191468	蛋白质印迹试剂;160 千铌;稀释度 1：200
抗生素-抗真菌剂 （100x）	Gibco	15240062	Tisuue 培养试剂
BLAST 核苷酸搜索引擎	国家生物技术信息中心	NA	免费软件;网站：blast.ncbi.nlm.nih.gov
杀稻瘟菌素 S、盐酸盐、灰链霉	Calbiochem	CAS 589205	CRISPR 试剂;化学品，工作储备液 = 1 mg/mL，水
溶液Countess 3 自动细胞计数仪	Invitrogen	A50298	设备;细胞计数仪
低温管	Thermo Scientific	50001012	塑料器皿
Dharmacon CRISPR 设计工具	Horizon Discovery Ltd.	NA	免费软件;网站：horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer
DharmaFECT siRNA 转染试剂 #2	Dharmacon， Inc.	T-2002-02	转染试剂;LNCaP 和 PC3-ML 细胞系
二甲基亚砜 （DMSO）	Fisher	BP231100	Tisuue 培养试剂
含 L-谷氨酰胺、4.5g/L 葡萄糖和丙酮酸钠的 DMEM 培养基	Corning	MT10013CV	Tisuue 培养试剂;PC3-ML 细胞培养基
盐酸多西环素，即用型溶液	Sigma-Aldrich	D3072-1ML	CRISPR 试剂;化学试剂，工作原液 = 1 mg/mL 水溶液
DPBS，无钙，无镁	Gibco	14190144	Tisuue 培养试剂
Edit-R CRISPR-Cas9 合成 tracrRNA，20 nmol，设计	Dharmacon， Inc.	U-002005-20	CRISPR 试剂;通用 tracrRNA 寡核苷酸
Edit-R 修饰的合成 crRNA， 脱盐/脱保护，2 nmol	Dharmacon， Inc.	crRNA-460XXX	CRISPR 试剂;设计的 crRNA 寡核苷酸
EditR 诱导型慢病毒 hEF1aBlastCas9 核酸酶颗粒，50 &μ;L， 107 TU/mL	Dharmacon， Inc.	VCAS11227	CRISPR 试剂;慢-iCas9;多西环素诱导型慢病毒 化脓性链球菌 Cas9 载体系统
Ensembl 基因组查看器	Ensembl	NA	免费软件;网站：[ensembl.org] 用途：基因组浏览器识别包含 miRNA 簇和周围基因/调节序列的核苷酸序列。
GAPDH 抗体 （FL-335），兔多克隆	Santa Cruz Biotechnology	sc25778	蛋白质印迹试剂;37 kDa;稀释度 1：500
凝胶/PCR DNA 片段提取试剂盒	IBI Scientific		IB47010 核酸凝胶电泳试剂
Gibco 胎牛血清，经认证的	Gibco	16000044	Tisuue 培养试剂
溴己二甲嘰	MilliporeSigma	H9268	CRISPR 试剂;化学试剂，工作原液 = 0.8 mg/mL
Immobilon-FL PVDF 膜	MilliporeSigma	IPFL10100	Western 印迹试剂;硝酸纤维素
拦截 （TBS） 封闭缓冲液	LI-COR	927-60001	Western 印迹试剂
IRDye 680RD 山羊抗小鼠 IgG 二抗	LI-COR	926-68070	Western 印迹试剂
IRDye 800CW 山羊抗兔 IgG 二抗	LI-COR	926-32211	Western 印迹试剂
微量离心机	Eppendorf	5425 R	塑料件
miRBase microRNA 查看器	miRBase	NA	免费软件;网站：[mirbase.org] 用途：Borowser 列出了 10 kb 内所有注释的 miRNA 发夹、成熟 miRNA 序列和相关的成簇 miRNA 映射。
NuPAGE 4 至 12%，Bis-Tris，1.0 mm，小型蛋白凝胶，10 孔	Invitrogen	NP0321BOX	Western 印迹试剂
Odyssey CLx 成像系统	LI-COR	CLx	设备;蛋白质印迹成像
Opti-MEM 减血清培养基	Gibco	31985062	转染试剂
Owl D2 宽凝胶电泳系统	Owl	D2-BP	设备;核酸凝胶电泳系统
PCR 引物，设计（单链 DNA 寡核苷酸）	集成 DNA 技术	NA	PCR 试剂，基因分型
Phusion 高保真 DNA 聚合酶 （2 U/µL）	Thermo Scientific	F530S	PCR 试剂，基因分型
RIPA 裂解缓冲液 10x	MilliporeSigma	20-188	蛋白质印迹试剂
蛋白酶 K 溶液 （20 mg/mL），RNA 级	Invitrogen	25530049	PCR 试剂，无
RNase A、DNase 和蛋白酶基因分型 （10 mg/mL）	Thermo Scientific	EN0531	PCR 试剂，
RPMI 1640 培养基基因分型	Gibco	MT10041CV	Tisuue 培养试剂;LNCaP 细胞培养基
SnapGene Viewer	Snap Gene	NA	免费软件;网站：[snapgene.com] 使用：DNA 序列注释软件程序创建用于 gRNA 设计的 DNA 文件，以及 突出显示 miRNA 簇基因座（基因间、内含子）、属于 miRNA 簇的每个单独的 miRNA 发夹序列，以及附近的其他编码和非编码基因和/或调节特征
TrypLE Select 酶 （1x），无酚红	Gibco	12563029	Tisuue 培养试剂;重组胰蛋白酶
UltraPure 琼脂糖	Invitrogen	16500100	核酸凝胶电泳试剂
Veriti 96 孔快速热循环仪	ThermoFisher Scientific	4375305	设备
XCell SureLock Mini-Cell 电泳系统	Invitrogen	EI0001	设备;蛋白凝胶电泳系统