本文介绍一种基于显色反应检测细菌运动能力的实验方案。该方法的主要优势在于操作简便、结果更准确，且无需使用专业设备。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
细菌运动性对细菌的致病性、生物膜形成以及耐药性至关重要。细菌运动性在许多病原菌的侵袭和/或播散过程中发挥关键作用，因此，检测细菌运动性具有重要意义。细菌的生长条件，如氧气、pH 和温度，会影响细菌的生长及其鞭毛的表达，可能导致运动性降低甚至完全丧失，从而造成对细菌运动性的评估不准确。基于活菌细胞内脱氢酶对2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）的显色反应，本研究在传统半固体琼脂中添加TTC用于检测细菌运动性。结果表明，该TTC半固体琼脂法检测细菌运动性操作简便、无需大型昂贵仪器，且结果更易于判读和评估。同时发现，使用0.3%琼脂制备的半固体培养基中细菌运动性最强。与传统半固体培养基相比，该方法的检测结果更为准确和可靠。
引言
细菌的运动性在细菌致病性、生物膜形成以及耐药性中起着关键作用1。细菌运动性与致病性密切相关，并且在感染初期细菌对宿主细胞的定植过程中是必需的2。生物膜的形成与细菌运动性密切相关，细菌通过运动性附着于固体培养基表面。长期以来，细菌运动性被认为与生物膜形成呈正相关。由于生物膜导致的高水平细菌耐药性可引发持续性感染，对人类健康构成威胁3,4,5。因此，检测细菌运动性具有重要意义。细菌运动性试验主要用于检测不同形态细菌在活体状态下的运动能力，可间接判断鞭毛的存在与否，因此在细菌鉴定中具有重要作用。
检测细菌运动性有直接和间接方法6。由于具有鞭毛的细菌表现出运动性，因此可通过检测鞭毛的存在与否来间接判断细菌是否具有运动性。例如，可通过电子显微镜观察和鞭毛染色来间接检测细菌的运动性。此外，也可采用直接方法进行检测，如悬滴法和半固体穿刺法。
半固体穿刺法是本科微生物学实验室中常用于检测细菌运动性的方法，该方法将细菌接种到含有0.4-0.8%琼脂的半固体琼脂培养基的穿刺线上，根据细菌的生长方向进行观察。若细菌沿穿刺线向周围扩散生长，出现云雾状（刷状）的生长痕迹，则表明细菌具有鞭毛，因而具有运动性。若未出现沿穿刺线的生长痕迹，则表明该细菌无鞭毛，也不具备运动性。
然而，该方法存在一些缺点：细菌无色且透明，其鞭毛活动受活菌的生理特性及其他因素的影响，同时受琼脂浓度和试管直径较小的限制。此外，好氧细菌仅适合在琼脂表面生长，这影响了对细菌运动性的观察。因此，为了改进该实验，向培养基中添加了2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）（无色），利用细胞内脱氢酶催化TTC生成红色产物，从而建立了一种比现有的直接穿刺法更可靠、更直观的细菌运动性检测方法7,8,9,10。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 半固体培养基的制备
- 传统半固体琼脂
- 根据细菌运动性试验培养基配方，使用基础成分制备传统半固体琼脂11。将10 g胰蛋白胨、15 g NaCl和4 g琼脂溶于适量蒸馏水中，调节pH至7.2 ± 0.2，并定容至1,000 mL。
- 在121 °C下高压灭菌20分钟，然后分装至10 mL试管中，制成高度为3 cm的半固体培养基。
- 含TTC的传统半固体琼脂
- 将常规半固体培养基高压灭菌后冷却至50 °C，向100 mL培养基中加入5 mL无菌的1% TTC溶液，混匀后分装至10 mL试管中，制成高度为3 cm的半固体培养基。
2. 细菌菌株
注意：从水生环境中分离出80株菌株，并使用自动化细菌鉴定仪器（见材料表）进行鉴定，包括大肠杆菌（Escherichia coli）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、沙门氏菌（Salmonella spp.）、弧菌（Vibrio spp.）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）和嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）（表1）。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（见材料表）用作非运动性阴性对照；大肠杆菌（Escherichia coli）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）（见材料表）用作阳性对照菌株。
- 确定用于运动性分析的测试菌株。
- 包括非运动性阴性对照菌株和运动性阳性对照菌株。
3. 增强型TTC细菌运动性观察
- 用接种针从琼脂平板上挑取测试细菌的单个菌落，并通过穿刺法将其接种到上述两种半固体培养基中（步骤1.1.2和1.2.1）。
- 将试管置于37 °C培养箱中培养24–48小时，观察结果。
- 观察生长状态：若仅穿刺线呈红色，则判定该细菌为非运动性（-）；若红色轻微沿穿刺线向外扩散，则判定该细菌为运动性（+）12。
4. 不同琼脂浓度对细菌运动性的影响
- 制备含0.3%、0.5%和0.8%琼脂的半固体培养基，并按上述方法进行穿刺接种。培养24–48小时后观察结果。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
对标准菌株和分离菌株进行运动性检测的比较，结果如表1所示。由于缺乏鞭毛，Staphylococcus aureus 和 Klebsiella pneumoniae 在传统半固体培养基和含TTC的半固体培养基上均仅沿接种线生长。相反，Pseudomonas aeruginosa、Escherichia coli 和 Salmonella typhimurium 在含TTC的半固体培养基中培养24小时后，可在接种线周围向各个方向扩散生长。培养48小时后，这一现象更为明显（图1）。尽管在传统半固体培养基中细菌也能向各个方向生长，但由于接种线外侧的细菌数量较少，其生长扩散情况较难观察，远不如在TTC培养基中清晰可见。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
采用半固体培养基法检测细菌运动性时，结果受多种因素影响13,14。细菌的生长条件，如氧气（在琼脂表面为需氧环境，而在半固体培养基试管底部为非需氧环境）、pH值和温度，均可能影响细菌鞭毛的活性，从而导致运动性降低甚至完全丧失15。此外，某些黏液型细菌的运动性可能因其产生足丝连体物而受到影响。
在半固体培养基中加入TTC有助于观察细菌的运动性。具有运动能力的发酵性细菌在培养后可沿穿刺线向各个方向生长，因此穿刺线周围的培养基变为红色。具有运动能力的非发酵性细菌在培养基下部氧气含量较低，因此生长不良，仅培养基上层呈现红色。无运动能力的细菌只能在接种线上生长，因此仅穿刺线处呈现红色。
使用TTC半固体培养基检测细菌运动性时，培养时间越长，结果越明显，尤其是在琼脂浓度较低的情况下。如果结果难以判断，应适当延长培养时间。这可能与半固体培养基的琼脂浓度、细菌数量及其运动能力有关<...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究得到江苏省高校优势学科建设工程（PAPD）和中国药科大学教学改革研究项目（2019XJYB18）的资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细菌琼脂 | Difco | ||
| Escherichia coli | ATCC | ATCC25922 | 阳性对照 |
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC27853 | 阳性对照 |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | 阳性对照 |
| Staphylococcus aureus | ATCC | ATCC25923 | 阴性非运动性对照 |
| 胰蛋白胨 | OXOID | ||
| TTC | Sigma | 298-96-4 | |
| VITEK 2 自动微生物鉴定系统 | Bio Mérieux |
参考文献
- Jordan, E. O., Caldwell, M. E., Reiter, D. Bacterial motility. Journal of Bacteriology. 27 (2), 165(1934).
- Lai, S. L., Hou, H., Jiang, W. Bacterial motility and its role during initial stage of pathogenesis. Journal of Microbiology. 26 (5), in Chinese 68-70 (2006).
- Ding, S. S., Wang, Y. Relationship between flagella-dependent motility and biofilm in bacteria - A review. Acta Microbiologica Sinica. 49 (4), in Chinese 417-422 (2009).
- Zeng, J., Wang, D. Recent advances in the mechanism of bacterial resistance and tolerance. Chinese Journal of Antibiotics. 45 (2), 113-121 (2020).
- Xu, M., Zhou, M. X., Zhu, G. Q. Progress in the mechanism of bacterial flagellum motility, adhesion and immune escape. Chinese Journal of Veterinary Science. 37 (2), 369-375 (2017).
- Leboffe, M. J., Pierce, B. E. Microbiology: laboratory theory and application. Third edition. , Morton Publishing Company. Colorado. (2015).
- Ball, R. J., Sellers, W. Improved motility medium. Applied Microbiology. 14, 670-673 (1966).
- An, S., Wu, J., Zhang, L. H. Modulation of Pseudomonas aeruginosa biofilm dispersal by a cyclic-di-GMP phosphodiesterase with a putative hypoxia-sensing domain. Applied and Environmental Microbiology. 76 (24), 8160-8173 (2010).
- Chouhan, O. P., et al. Effect of site-directed mutagenesis at the GGEEF domain of the biofilm forming GGEEF protein from Vibrio cholerae. AMB Express. 6 (1), 2(2016).
- McLaughlin, M. R. Simple colorimetric microplate test of phage lysis in Salmonella enterica. Journal of Microbiological Methods. 69 (2), 394-398 (2007).
- Difco Laboratories. Difco manual: Dehydrated culture media and reagents for microbiology. Difco Laboratories. , Detroit. (1984).
- Tittsler, R. P., Sandholzer, L. A. The use of semi-solid agar for the detection of bacterial motility. Journal of Bacteriology. 31 (6), 575(1936).
- Qian, Y., Tian, X. Y., Zhang, S. Y., Wang, J. Explore the influencing factors of bacterial motility. Health Care Today. 6, 50-51 (2018).
- Wang, J., et al. Filamentous Phytophthora pathogens deploy effectors to interfere with bacterial growth and motility. Frontiers in Microbiology. 11, 581511(2020).
- Kühn, M. J., et al. Spatial arrangement of several flagellins within bacterial flagella improves motility in different environments. Nature Communication. 9 (1), 5369(2018).
- Mitchell, A. J., Wimpenny, J. W. T. The effects of agar concentration on the growth and morphology of submerged colonies of motile and non-motile bacteria. Journal of Applied Microbiology. 83 (1), 76-84 (2010).
- Xu, A., Zhang, M., Du, W., Wang, D., Ma, L. Z. A molecular mechanism for how sigma factor AlgT and transcriptional regulator AmrZ inhibit twitching motility in Pseudomonas aeruginosa. Environmental Microbiology. 23 (2), 572-587 (2021).
- Bartley, S. N., et al. Attachment and invasion of Neisseria meningitidis to host cells is related to surface hydrophobicity, bacterial cell size and capsule. PLoS One. 8, 55798(2013).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
