本方案描述了如何利用表达突变型L274G-甲硫氨酰tRNA合成酶（MetRS*）的小鼠品系，通过叠氮诺亮氨酸（ANL）对特定细胞类型的蛋白质进行标记，并详细说明了分离标记蛋白质所需的步骤。我们概述了在活体小鼠中使用ANL的两种给药途径：（1）饮水给药和（2）腹腔注射。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
理解蛋白质稳态 在体 对于了解细胞在生理和疾病状态下的功能至关重要。本方案描述了 体内 利用经基因工程改造的小鼠品系，通过特异性标记特定细胞群体中的新合成蛋白质并进行后续纯化。该小鼠品系可在Cre重组酶诱导下表达L274G-甲硫氨酰tRNA合成酶（MetRS*），从而实现非天然氨基酸叠氮正亮氨酸（ANL）在蛋白质中的特异性掺入，而该过程在正常情况下不会发生。通过本文所述方法，可实现对特定细胞类型中标记的新合成蛋白质组的富集与纯化 体内 并通过降低样本复杂性来检测蛋白质含量的细微变化。
引言
蛋白质稳态失衡由蛋白质合成与降解之间的失衡引起。多种疾病与蛋白质稳态的改变相关，其中一些疾病的特征是在不同的亚细胞区域和脑区出现蛋白聚集体。蛋白质稳态不仅在疾病中具有重要意义，也在正常器官和细胞功能中发挥关键作用1。例如，已有研究表明，蛋白质合成对于多种形式的神经元可塑性至关重要2,3，该结论基于使用化学抑制剂阻断蛋白质合成的实验结果4。然而，目前尚不清楚在学习与记忆过程中，哪些特定细胞类型的蛋白质组发生了改变，也不清楚每种细胞类型中哪些特定蛋白质的合成或降解发生了增加或减少。因此，对蛋白质稳态进行全面研究，需要具备区分来自特定细胞类型蛋白质组的能力。事实上，在多细胞环境中识别特定细胞类型的蛋白质组，一直是蛋白质组学研究中的一个重要难题。为此，我们开发了一种结合MetRS*表达与生物正交方法的技术，已被证明是识别和纯化特定细胞类型蛋白质组的有效手段，填补了这一研究空白5,6,7。
表达突变型MetRS*（MetRS L274G）可实现非天然甲硫氨酸类似物ANL向相应tRNA的加载<....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有涉及动物的实验均获得德国当地政府部门（RP Darmstadt；方案编号：V54-19c20/15-F122/14, V54-19c20/15-F126/1012）或西班牙（马德里康普顿斯大学动物实验委员会及马德里自治区环境咨询部门，方案编号：PROEX 005.0/21）的许可，并符合马克斯·普朗克学会的规定、西班牙法规以及欧盟关于动物福利的指导方针。
1. 在体 使用 ANL 进行代谢标记
- 饮用水：
- 将ANL和麦芽糖溶解于小鼠的常规饮用水中。推荐的麦芽糖浓度为0.7%（wt/vol）。添加到饮用水中的ANL最大量为1%（wt/vol）。混合液配制完成后，通过过滤灭菌，并在4 °C下保存。
- 将步骤1.1中配制的混合液提供给小鼠。频繁更换瓶子（例如每3天一次），以避免污染，并每天检查是否存在可能的污染或堵塞。通过称重每日饮水量，监测小鼠的饮水量，从而了解其ANL摄入量。
注：本研究中评估的最长标记时间为3周，使用1% ANL浓度的饮用水，可在脑组织中实现良好可检测的标记。2周时间也可获得良好的标记效果。我们未使用该给药方法研究更短的标记时间、更长的时间点或其他ANL剂量，但这并不意味着这些条件无效。ANL的掺入率可能因所研究的组织或细胞类型而异。标记时间应根据科学问题而定；例如，若目标是标记蛋白质组，则标记时间应根据所研究组织中蛋白质的....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
按照所述方案（总结于 图1），通过每日腹腔注射给予小鼠ANL（400 mM ANL，10 mL/kg，Nex-Cre::MetRS*），持续7天，或 通过 饮用水（含0.7%麦芽糖、1% ANL、CamkII-Cre::MetRS*）持续21天。标记结束后，分离相应脑区组织，进行裂解、烷基化和点击化学反应。点击化学反应产物通过SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹分析。实验的代表性图像如下所示 图2 用于通过腹腔注射给予 ANL 图3 用于 ANL 给药 通过 饮用水。需要注意的是，图示的目的是展示两种标记方法均有效，而非对二者进行比较。由于所示的两个实验中标记了不同的神经元群体（海马体和皮层的兴奋性神经元，以及小脑的浦肯野神经元），因此无法进行直接比较。
另一项实验提供了确定最佳DST-可裂解炔烃浓度的示.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
该实验方案的关键要点包括：设置阴性对照、具备足够的生物学重复、ANL的给药途径、剂量和持续时间、样品的烷基化处理、炔烃的浓度，以及在使用DST-炔烃时去除β-巯基乙醇。
关键是要包含来自未携带Cre驱动且因此不表达MetRS*的ANL标记动物的阴性对照样本。这些样本必须与来自ANL标记的Cre诱导MetRS*小鼠的样本平行地经历本方案中描述的每一步操作。未进行点击化学反应（non-clicked）的样本不能作为有效对照，因为仅使用此类对照获得的任何结果可能源于非特异性点击反应。我们未观察到ANL在不表达MetRS*基因的细胞中发生掺入，也未观察到在无Cre的细胞中存在MetRS*表达；因此，用ANL标记的野生型动物可作为阴性对照。
鉴于本方案包含多个可能导致样本丢失的步骤，建议在计算生物学重复时考虑技术性失败的因素。对于脑组织样本，大约有30%的重复样本可能丢失。
本文描述了两种 ANL 的给药途径和给药持续时间。这并不排除其他给药方式（例如，将 ANL 添加至食物中）同.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
B.A-C 由西班牙科学与创新部（Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I）、马德里自治区（Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057）以及 MICINN（PID2020-113270RA-I00）资助项目提供经费支持。R. A-P 由马德里自治区（Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057）提供经费支持。E.M.S. 由马克斯·普朗克学会、欧洲研究理事会高级研究者奖（资助号 743216）、德国研究基金会 CRC 1080：神经稳态的分子与细胞机制，以及德国研究基金会 CRC 902：基于 RNA 的调控分子原理项目提供经费支持。我们感谢 D.C Dieterich 和 P. Landgraf 提供的技术建议以及 DST-Alkyne 的合成。我们感谢 E. Northrup、S. Zeissler、S. Gil Mast 以及马克斯·普朗克脑研究所动物设施提供的出色支持。我们感谢 Sandra Goebbels 分享 Nex-Cre 小鼠品系。我们感谢 Antonio G. Carroggio 在英文语言润色方面的帮助。B.A-C 负责实验的设计、实施与数据分析。B.N-A、D.O.C、R.A-P、C. E. 和 S. t. D. 参与了实验的实施与数据分析。B.A-C 和 E.M.S. 负责实验设计并监督项目进展，B.A-C 撰写了论文。所有作者均参与了论文的修改。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 12% 聚丙烯酰胺凝胶 | GenScript | SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12% | |
| β-巯基乙醇 | Sigma | M6250 | 有毒；使用实验服、手套和通风橱。 |
| 碳酸氢铵 | Sigma | 9830 | 有毒；使用实验服、手套和通风橱 |
| ANL | 合成方法如先前对AHA所述（见参考文献5和11） | ||
| ANL-HCl | IrishBotech | HAA1625.0500 | |
| 苯甲酸酶（Benzonase） | Sigma | E1014 | |
| 生物素炔烃 | Thermo, | B10185 | |
| 鸡源抗GFP抗体 | Aves | 1020 | |
| 不含EDTA的完全蛋白酶抑制剂 | Roche | 4693132001 | 有毒；使用实验服和手套。 |
| 溴化亚铜（I） | Sigma | 254185 | 99.999% (wt/wt) |
| 二硫键标签（DST）-炔烃 | 合成方法见参考文献15，其中称为探针20 | ||
| DMSO | Sigma | 276855 | |
| 滤膜 | Merk | SCGP00525 | |
| 碘乙酰胺（IAA） | Sigma | I1149 | |
| IR 抗鸡 800 | LI-COR | IRDye 800CW | 驴抗鸡二抗 |
| IR 抗兔 680 | LI-COR | IRDye 680RD | 山羊抗兔IgG二抗 |
| 麦芽糖 | Sigma | M9171 | |
| 手动混合器 | BioSpec Products | 1083 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| N-乙基马来酰亚胺 | Sigma | 4259 | 有毒；使用实验服、手套和通风橱。 |
| NeutrAvidin 琼脂糖珠 | Pierce | 29200 | |
| 硝酸纤维素膜 | Bio-rad | 1620112 | |
| PBS 1X | Thermo | J62036.K2 | |
| PBS 1X pH 7.8 | 制备方法见参考文献5 | ||
| PD SpinTrap G-25 柱 | GE Healthcare | 用于缓冲液置换 | |
| Pierce BCA 蛋白定量试剂盒 | Thermo, | 23225 | Pierce BCA 蛋白定量试剂盒中的试剂对水生生物有毒。 |
| 兔多克隆抗生物素抗体 | Cell Signaling | 5597 | |
| PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 | |
| SDS 10% | Sigma | 71736 | |
| SDS-PAGE 运行缓冲液 MOPS | GenScript | M00138 | |
| SYPRO Ruby 染色液 | Sigma | S4942 | |
| 台式自动涡旋振荡器 | Eppendorf | Mixmate | |
| 三唑配体 | Sigma | 678937 | |
| 吐温X-100 | Sigma | T9284 | |
| 水 | Sigma | W4502 | 分子生物学级 |
参考文献
- Alvarez-Castelao, B., Schuman, E. M. The regulation of synaptic protein turnover. Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28623-28630 (2015).
- Sutton, M. A., Schuman, E. M. Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory. Cell. 127 (1), 49-58 (2006).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
