需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

骨骼肌中脂滴含量的纤维类型与亚细胞特异性分析

7.2K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/63718

⸱

2022年6月8日

 ,  ,  , 
1Endocrinology, Diabetes and Nutrition Unit, Institute of Experimental and Clinical Research, Medical Sector, Université Catholique de Louvain, 2Departamento de Fisiología, Facultad de Biología, Universidad de Sevilla

本文内容

摘要

越来越多的证据表明，过量的脂质在骨骼肌内的积聚会导致脂毒性并引发糖尿病。本文提供了一套完整的实验方案，包括组织处理、Bodipy 染色、图像采集和分析，以按肌纤维类型特异性地定量脂滴的大小、密度及亚细胞分布情况。

摘要

骨骼肌脂肪浸润，即肌内脂肪变性（myosteatosis），随着肥胖和衰老而增加。最近研究发现，肌内脂肪变性也是多种其他疾病（如心血管疾病和癌症）的不良预后因素。过度的脂肪浸润会减少肌肉质量和力量，并可能导致脂毒性及胰岛素抵抗，其程度取决于肌细胞内总脂质含量、脂滴（LD）形态以及亚细胞分布。肌纤维类型（氧化型与糖酵解型）也具有重要作用，因为氧化型纤维具有更强的脂质利用能力。鉴于其在病理生理过程中的关键意义，有必要针对不同肌纤维类型深入开展对脂滴动态变化及其功能的深入研究。

本文提供了一种完整的实验方案，用于定量分析肌细胞内脂质含量，并以肌纤维类型特异性的方式对脂滴（LD）的形态及亚细胞分布进行分析。为此，采用荧光染料Bodipy及针对肌球蛋白重链同工型的抗体对连续肌肉冷冻切片进行染色。该方案可同时处理不同肌肉样本，节省时间并避免潜在的人为假象；同时，借助Fiji软件中自定义宏的创建，还可实现脂滴分析的自动化。

引言

骨骼肌中的脂质浸润被称为肌内脂肪变性（myosteatosis），其程度随肥胖和衰老而增加。肌内脂肪变性与肌肉质量、肌肉力量以及胰岛素敏感性呈负相关1。此外，近期研究表明，肌内脂肪变性的程度可作为心血管疾病2、非酒精性脂肪性肝病3或癌症4等其他疾病的预后因素。脂质可在骨骼肌纤维之间以细胞外肌脂（extramyocellular lipids）的形式积聚，也可在肌纤维内部以细胞内肌脂（intramyocellular lipids, IMCLs）的形式储存。IMCLs主要以甘油三酯的形式储存在脂滴（lipid droplets, LDs）中，在运动过程中作为代谢燃料被利用5,6。然而，当脂质供应超过需求，或线粒体功能受损时，IMCLs会参与导致肌肉胰岛素抵抗，这在代谢不健康的肥胖个体及2型糖尿病患者中可见7。有趣的是，耐力运动员体内的IMCLs水平与2型糖尿病肥胖患者相似甚至更高，却仍保持较高的胰岛素敏感性。这一现象被称为“运动员悖论”（athlete's paradox）8,9，其解释在于对肌肉脂滴更为细致的理解，包括其大小、密度、定位、动态变化以及脂质种类的组成。

首先，脂滴大小与胰岛素敏感性和身体素质呈负相关10,11事实上，较小的脂滴具有相对更大的表面积供脂肪酶作用，因此可能具有更强的脂质动员能力。12其次，脂滴密度（数量/表面积）在胰岛素作用中具有争议性的作用8,10然而，在运动员中似乎有所增加。第三，脂滴的亚细胞定位非常重要，因为位于细胞膜下方（肌膜下或外周）的脂滴对胰岛素敏感性的不利影响大于中心区域的脂滴8,9,13后者为中枢线粒体提供燃料，这些线粒体具有更高的呼吸活性，更专精于满足收缩过程所需的高能量需求14相比之下，外周脂滴为肌膜下线粒体提供能量，这些线粒体参与膜相关过程8最后，除了甘油三酯外，肌肉中某些特定的复杂脂质可能比其他脂质更具危害性。例如，当甘油三酯周转率较低时，二酰基甘油、长链脂酰辅酶A和神经酰胺可能在肌肉中积聚，从而损害胰岛素信号传导。9,15回到“运动员悖论”，耐力运动员的I型（氧化型）肌纤维中含有数量较多但体积较小的中心脂滴，且其周转率较高；而肥胖和糖尿病患者的II型（糖酵解型）肌纤维中则含有体积较大但周转率较低的周边脂滴。8,15,16除了在能量储存和释放中的作用外，脂滴（LDs） 通过 衍生脂肪酸（FA）和一种包被蛋白（perilipin 5）也可作为脂肪酸氧化和线粒体生物发生转录调控中的关键参与者8由于脂滴在生理学和病理生理学中具有至关重要的意义，因此有必要深入研究其动态变化与功能。

尽管存在多种研究IMCL的方法，但并非所有技术都适用于准确量化特定肌纤维中脂滴（LD）的大小、密度和分布。例如，磁共振波谱法虽然具有非侵入性，但其分辨率不足以研究脂滴在肌纤维内的大小和精确定位，且无法区分肌纤维类型17,18。同样，对整块肌肉匀浆进行的生化技术19也无法评估脂质的位置和大小。因此，分析脂滴形态和位置最适宜的方法是定量透射电子显微镜13，但该技术成本高且耗时。因此，使用如油红O（ORO）20,21、单丹磺酰戊烷（MDH）22或Bodipy23,24,25等染料对样本进行共聚焦荧光成像，已成为此类研究的最佳工具。

本文描述了一套完整的实验方案，包括组织取样与处理、Bodipy染色，以及共聚焦图像的采集与分析，用于定量小鼠肌肉冷冻切片中脂滴（LD）的大小、数量和定位。由于肌内脂滴（IMCL）在氧化型和糖酵解型肌纤维间的分布并不均匀，且不同类型的肌纤维对脂滴动态的调控机制各异，因此对IMCL的研究必须基于肌纤维类型进行16,25,26,27。为此，本方案采用连续切片上的免疫荧光染色来鉴定每根肌纤维所表达的肌球蛋白重链（MyHC）同工型。该方案的另一优势在于，可在冷冻前将一块糖酵解型肌肉（趾长伸肌，EDL）与一块氧化型肌肉（比目鱼肌）并排放置，同时进行处理（图1）。这种同步处理方式不仅节省时间，还可避免因样品单独处理而带来的实验变异性。

组织制备、冷冻切片及显微镜分析的实验方案示意图。
图 1：实验流程示意图。 肌肉解剖（1）后，选取大小相近的肌肉进行共同制备和冷冻（2）。使用冷冻切片机获取10 µm的连续横切面，并直接贴附于黏附载玻片上（3）。从两张连续切片中，第一张（4A）用层粘连蛋白进行免疫标记，并用Bodipy染色以识别脂滴（LDs），第二张（4B）则使用抗肌球蛋白重链同工型（MyHCs）抗体进行免疫染色，以识别肌纤维类型。采用共聚焦显微镜采集Bodipy信号图像（5A），采用落射荧光显微镜采集肌纤维类型图像（5B）。在Fiji软件中对图像进行分析，通过设定阈值并量化颗粒（6A），获得脂滴的数量、平均大小、密度以及占总区域的百分比（7）；或通过细胞计数（6B）获得切片中各类肌纤维所占的百分比（7）。缩写：LDs = 脂滴；EDL = 拇长伸肌；MyHCs = 肌球蛋白重链同工型。 请点击此处查看该图的放大版本。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有在小鼠上进行的操作均经比利时天主教鲁汶大学医学部动物实验伦理委员会批准（2019/UCL/MD/013）。

1. 样品的解剖与冷冻前准备

  1. 为每对肌肉标记一块3 mm厚的软木塞。
  2. 用刀片在软木塞中心切出一个小切口，垂直插入一块矩形硬质塑料（宽0.5 cm，高1 cm），作为支撑（图2B）。
    注意：矩形塑料片的尺寸取决于肌肉的大小。此处所述尺寸适用于3月龄C57BL/6J雄性小鼠的比目鱼肌（约9 mg，长1 cm，宽2–3 mm）和趾长伸肌（约5 mg，长1 cm，宽2–3 mm）。
  3. 在解剖时，取出小鼠后肢的比目鱼肌和趾长伸肌。为防止样本在解剖过程中干燥，将其置于冰上培养皿中用生理盐水轻微润湿的纱布上。
    注意：有关如何解剖这两块肢体肌肉的说明，请参见Wang等28。
  4. 在软木塞与塑料片的连接处滴加少量最佳切割温度化合物（OCT），避免产生气泡。
  5. 用纸巾轻轻吸干样本表面多余水分（图2A），然后将两块肌肉垂直于软木塞放置在塑料片上（图2C）。
  6. 在体视显微镜下检查肌纤维的方向（图2D）。
    注意：切勿用OCT覆盖肌肉，因其隔热作用会阻碍快速冷冻，从而产生冷冻伪影。

2. 冷冻骨骼肌样本以进行冰冻切片

注意：肌肉的冷冻必须在化学通风橱中进行，并佩戴适当的个人防护装备（参见材料表）。

  1. 使用不锈钢滚筒（约8 cm 高，6 cm Ø）并带有两条侧带，每条侧带长度至少为25 cm（图2F），并将异戊烷加入烧杯至其容量的2/3处。
  2. 用手握住冻存盒的提带，将其轻轻浸入装有液氮的聚苯乙烯盒中，使容器外的液氮液面高于容器内异戊烷的液面（图2F, G).
    警告：当试管接触氮气时，热冲击可能导致液体旋涡。确保试管充分浸入，但避免氮气进入，否则会引起异戊烷析出。若发生此情况，需让异戊烷冷却后，将试管更换新的异戊烷，并重新开始操作。
  3. 当离心管内壁完全被一层异戊烷白色固体覆盖时，将其从液氮盒中取出（图 2H).
    注意：异戊烷的熔点为 -159 °C，当离心管足够冷时，其边缘会变白。
  4. 用镊子轻轻搅拌固体异戊烷碎片，使其与剩余的液体异戊烷混合，直至整个体积重新变为液体。
  5. 将烧杯重新浸入液氮中，直至异戊烷在烧杯底部和边缘形成遍布的白色小颗粒（图2G，H).
    注意：第二步冷却可确保异戊烷达到适当的冷冻温度。
  6. 将烧杯从液氮中取出，迅速将肌肉浸入烧杯底部，用鼠齿镊夹住软木塞。在异戊烷中旋转软木塞15秒，随后于-80℃保存 °C，直至处理（图2I).
    ​注意：对于短期储存，样品可保存在 -20 °C 冷冻柜。骨骼肌快速冷冻的完整方案此前已在别处发表。有关详细参考文献和故障排除，请参见：Meng et al.29，Kumar 等30，以及 Leiva-Cepas 等人31.

3. 冷冻切片

  1. 将样品放入已预冷至 -20 °C 的冷冻切片机腔室中，并将刀片温度设定为 -25 °C。
    注意：将样品从 -20 °C/-80 °C 冰箱转移至冷冻切片机时，应使用装有干冰的聚苯乙烯盒，并在切片前让样品在腔室内平衡至少 20–30 分钟。
  2. 用精细镊子去除软木塞上的塑料，将冷冻切片机样品盘置于速冻板上冷却。当速冻板温度降至 -50 °C 时，在样品盘上滴加适量 OCT 包埋剂，迅速将软木塞放置于盘上并用力压紧。等待 OCT 完全凝固，确保软木塞牢固固定在样品盘上。
  3. 将样品盘安装至切片头，调整至所需的切片方向（图 2J、K），修块至切除肌肉长度的至少 1/3，直至可见肌肉的两个横截面。
  4. 设定切片厚度为 10 µm，取一片切片置于防脱载玻片上，使用明场显微镜检查肌纤维方向是否正确。
    注意：确认肌纤维的横截面方向至关重要。若纤维方向不理想，应调整切片头角度，重新切片并再次检查。
  5. 将两连续横切面分别贴附于两张预先标记的防脱载玻片上：一张用于肌纤维分型，另一张用于脂质含量定量（图 2L）。
    ​注意：可额外获取并保存更多连续切片于 -80 °C，用于其他组织学研究。但为避免脂质含量及细胞内形态发生改变24，必须在切片后立即处理前两张载玻片，防止空气干燥。对用于脂滴定量的载玻片进行冻融操作会产生相同不良影响，因此极不推荐。

4. 肌纤维分型与Bodipy染色

  1. 肌肉纤维类型的免疫组织化学检测
    注意：以下方案中，总溶液用量为 250 µ足以覆盖由疏水笔绘制的、约一元硬币大小的圆形区域内的整个肌肉切片。
    1. 用疏水性笔在切片周围画出轮廓，然后在室温下用冰冻的0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗1分钟。将载玻片置于湿盒中，在37℃下封闭90分钟。 °在封闭液（PBS 中含 10% 正常山羊血清（NGS）和 1:30 小鼠抗小鼠（MOM）封闭试剂）中孵育。
    2. 除去封闭液，将切片在37℃下孵育90分钟 °C 加入含一抗的溶液（5% NGS、1:30 MOM封闭剂、识别I型（IgG2b，1:10）、IIa型（IgG1，1:10）和IIx型（IgM，1:5）肌纤维的小鼠一抗，以及大鼠抗层粘连蛋白抗体）α2 链，1:1,000）溶于 PBS 中。
    3. 室温下用 PBS 洗涤载玻片，每次 5 分钟，共洗 3 次。
    4. 在室温下避光孵育载玻片1小时，孵育液为含以下二抗的PBS溶液：山羊抗IgG2b AF405（1:500）、山羊抗IgG1 AF488（1:500）、山羊抗IgM AF568（1:1,000）和山羊抗层粘连蛋白AF647（1:500）。
      注意：在后续实验步骤中，务必避免光照，以保护荧光信号。
    5. 再用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟，然后用双蒸水冲洗2O，去除多余水分，用抗荧光淬灭剂封片。
      注意：将载玻片置于 4℃ 保存 °C，避光保存以维持荧光，直至进行图像采集。由于切片未经过固定，建议每次实验均使用新鲜配制的溶液，PBS 需经高压灭菌，并尽快采集图像，以避免切片污染。
  2. 使用Bodipy对脂滴进行染色
    注意：与步骤 4.1 类似，总体积为 250 µ足以覆盖由疏水笔画出的、约一元硬币大小的圆形区域内的整个肌肉切片。
    1. 用疏水性笔在切片周围画出轮廓，并用预冷的0.1 M PBS在室温下冲洗10分钟。所有冲洗和洗涤步骤均应使用预冷的PBS。
    2. 用不含甲醇的冷4%多聚甲醛（PFA）在室温下固定10分钟。第一次快速漂洗后，在室温下用PBS洗涤切片，每次5分钟，共洗3次。
      注意：执行此操作时需谨慎 在通风橱下操作。
    3. 将切片置于湿盒中，用含5% NGS的PBS在室温下封闭1小时。
    4. 在37℃孵育载玻片90分钟 °C 加入一抗溶液（2% NGS 和大鼠抗层粘连蛋白（laminin）α2 链，1:1,000）的 PBS 溶液中。室温下用 PBS 洗涤切片，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。
      注意：在后续实验步骤中，务必避免光照，以保护荧光信号。
    5. 在室温下用含山羊抗大鼠-AF647抗体（1:500）的PBS溶液孵育1小时。在室温下用PBS洗涤切片，每次5分钟，共洗3次。
    6. 在室温下用含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，0.5）的溶液孵育20分钟 µg/mL) 和 BODIPY（1 µg/mL）溶于 PBS。
      注意：配制BODIPY储存液时，将其溶于DMSO中，浓度为1 mg/mL。市面上有多种Bodipy制剂可用于脂滴染色。尽管选择的制剂可能不同，染色方法均相同（步骤、浓度和孵育时间一致）；但图像采集方法将略有差异。
    7. 在初次快速漂洗后，于室温下用 PBS 漂洗切片，每次 5 分钟，共 3 次，随后用双蒸水漂洗2O，去除多余水分，用抗荧光淬灭剂封片。
      注意：将载玻片置于 4℃ 保存 °C，避光保存，以维持荧光直至图像采集。

5. 图像采集

注意：染色步骤完成后，必须立即进行图像采集（24 小时内），不仅是为了避免污染，也是为了保持脂滴（LD）的形态、大小和数量。

  1. 获取图像以评估所采样肌肉的肌纤维类型
    注意：此步骤可使用全片荧光扫描显微镜或传统落射荧光显微镜完成。若使用后者，则必须进行图像的手动或自动拼接，以重建完整切片。
    1. 为识别肌纤维类型，使用配备10倍/0.3数值孔径物镜的落射荧光显微镜。选择DAPI（405 nm）、FITC、TRITC和Cy5的激发滤光片，分别用于检测I型、IIa型、IIx型纤维及基底膜蛋白laminin。
      注意：IIb型纤维不会被免疫标记。它们将表现为仅在肌膜边缘被laminin染色、胞浆呈黑色的纤维。
    2. 为每个通道调整适当的曝光时间。
    3. 使用传统落射荧光显微镜时，始终按照相同顺序采集整个肌肉的图像，以便于肌肉重建。确保一幅图像右侧边缘的纤维也在下一幅图像左侧边缘出现，上下部分同理（图3A）。
      注意：作为参考，从小鼠（3月龄）分离的趾长伸肌（EDL）或比目鱼肌切片，分别平均需要六幅和八幅图像覆盖整个横截面。
    4. 扫描肌肉后，将采集的数字图像导入任意图像处理软件，根据纤维形态（laminin染色）和肌肉切片组织学特征进行重建（拼接），并将所有通道（颜色）合并后保存为TIFF、PNG或JPG格式文件（图3A）。
  2. 进行laminin与Bodipy共染色的图像采集
    注意：为识别肌纤维类型并估算每种类型纤维的数量，在开始采集Bodipy-laminin图像前，必须已完成肌纤维分型切片的扫描和肌肉重建（图3B）。
    1. 观察和采集Bodipy图像时，使用配备数值孔径为1.4的40倍油浸物镜的共聚焦显微镜。
    2. 采用以下设置：针孔大小为1 AU，分辨率为2,048像素 × 2,048像素，像素尺寸为0.08 µm，单向扫描模式，扫描速度为4（约4 µs/像素），线平均设为4倍，数字放大倍数设为1。
    3. 为避免Bodipy-558/568与laminin-AF647之间的串色，应在共聚焦软件中使用顺序扫描模式。
      注意：若选用Bodipy-493/503，则可在无串色的情况下同时进行共聚焦激光扫描，从而加快图像采集速度。
    4. 使用488 nm激光线或氩离子激光线激发Bodipy-493/503，使用561 nm二极管激光线激发Bodipy-555/568；最后使用640 nm二极管激光线检测laminin-AF647。
      警告：请注意Bodipy分子极易发生光漂白，因此应避免不必要的激光扫描。识别纤维时仅使用laminin对应的激光。
    5. 根据所选染料，将Bodipy-493/503的发射波长范围设为570–650 nm24，Bodipy-558/568设为565–620 nm；laminin的发射波长范围设为656–700 nm。
    6. 适当设置增益和数字增益，确保范围指示器中无饱和像素。通过调节偏移量校正背景信号。
      注意：滤光片选择及其他上述扫描参数需针对每台共聚焦显微镜进行优化。重要的是，所有待比较样本的图像必须保持上述各项参数一致。
    7. 为在共聚焦显微镜下识别所观察纤维的类型，可在个人笔记本电脑上查看经肌球蛋白重链（MyHC）免疫检测后重建的切片图像进行比对（图3B）。
    8. 一旦正确识别出一组纤维，即采集该区域的Bodipy与laminin双通道图像。
      ​注意：建议在MyHC识别图像中标注出这些纤维所在肌肉区域，并记录对应的Bodipy-laminin图像名称，以便后续进行肌纤维类型特异性的脂滴（LD）分析。

6. 图像分析

  1. 每块肌肉样本的肌纤维类型分析
    1. 在 Fiji（或 ImageJ）中32打开通过合并所有用于检测肌纤维同工型的通道而获得的重建肌肉的TIFF、PNG或JPG文件。
    2. 开始 细胞计数 工具，单击 插件 | 分析 | 细胞计数器 | 细胞计数器.
    3. 在 细胞计数器 窗口，点击 操作 | 初始化.
    4. 在……之下 计数器 在同一个窗口中，选择 1型.
    5. 在 Fiji 主窗口中，选择 瓦德 工具。
    6. 为量化每种类型的纤维数量，依次点击同类型的每根纤维，使程序记录所点击纤维的数量。
    7. 完成后，选择下一种类型的肌纤维并重复相同的步骤。
    8. 当图像中的所有纤维均已被归入特定纤维类型后，点击 结果 在 细胞计数器 在表格中显示结果的窗口。
    9. 单击以将此表格保存为电子表格 文件 | 另存为 在 结果 窗口。
    10. 随时通过点击保存并在同一图像上重新加载选区 保存标记 或 加载标记，分别位于 细胞计数 窗口
  2. 基于肌纤维类型分析脂滴
    1. 使用共聚焦显微镜获取的Bodipy和层粘连蛋白图像，采用Fiji进行脂滴（LD）定量分析。
      注意：作者设计了一个自定义宏以实现分析的自动化。该宏及其使用方法的逐步说明可获取自 补充文件 1 和 补充文件 2分别。
    2. 使用 Fiji 中的宏辅助打开每张图像 Bio-Formats 导入器 来自 Fiji。在 查看堆栈与 选项，选择 超堆栈 | 颜色模式，默认确保 自动缩放 选择窗口。
      注意：以下步骤将描述图像中单根肌纤维的分析流程，但需根据图像中出现的完整肌纤维数量重复相应次数。
    3. 使用 徒手选择 基于层粘连蛋白通道手动选择肌纤维肌膜的工具（图4A）并在键盘上按 T 键，以记录选定区域或感兴趣区域（ROI） 感兴趣区域 窗口
    4. 前往 Fiji 的 主要 窗口并点击 分析 | 设置测量, 并在弹出窗口中选择 领域 和 Feret 直径保持其余复选框未勾选，其他参数维持默认设置。
    5. 点击 测量 在 感兴趣区域 获取所选肌纤维的面积和最小费雷特直径（MF），并记录以供后续使用。
      注意：在分析脂滴（LD）时，需注意其大小和密度在肌纤维中心区域与周边区域（肌膜下区域-SS）之间存在差异，因此必须分别进行分析。
    6. 计算肌纤维横截面积（MF）的1/6的数值，以界定肌纤维的中央区域。
      注意：宏程序中默认的 MF 值设为 6，这意味着应用的缩减倍数将设定为 MF 的 1/6。该值是基于高脂饮食动物腓肠肌获得的实证数据选定的。然而，每位研究人员必须根据所获得的实证数据、分析的肌肉类型、纤维类型以及动物状态，对该数值进行相应调整。
    7. 在 感兴趣区域 窗口，单击 添加 复制第一个感兴趣区域，并选择窗口中出现的第二个感兴趣区域。
    8. 在 Fiji 的主窗口中，点击 编辑 | 选择 | 放大 并输入先前计算的值（来自步骤 6.2.6），在数值前加上负号，然后点击 好的在 ROI 窗口中，单击 添加 （必须出现第三个 ROI）以及 删除，以删除第二个 ROI。
      注意：研究人员可通过点击 显示全部 框上的 感兴趣区域 窗口。此时应出现两个感兴趣区域（ROI），其中一个围绕纤维的整个周长图4B）以及另一个位于中心的（图4C).
    9. 同时选择两个感兴趣区域 感兴趣区域 窗口并单击 更多 | 异或 | 添加[t]. 等待第三个 ROI 出现，该 ROI 对应肌纤维的周边区域（图 4D).
    10. 单击以保存 ROI 更多 | 保存 以保存感兴趣区域，以便日后需要对相同肌纤维进行重新分析。
    11. 选择 Bodipy 通道 并打开 阈值 点击工具 图像 | 调整 | 阈值 在 Fiji 上的 主要 窗口。
    12. 在 阈值 弹出窗口，将数值设置为 70/255，选择 Yen | B&W 方法，然后点击 深色背景 | 应用.
      注意：应用于 阈值 可能因实验条件而异，必须适当设置阈值以优化分析。A B&W 窗口中，Bodipy 信号高于阈值的部分应显示为白色，背景为黑色（与原始 Bodipy 图像对比） 图4E 与其中的 图4F).
    13. 前往 Fiji 的 骨骼肌脂质浸润，即肌内脂肪变性，随着肥胖和衰老而增加。最近研究发现，肌内脂肪变性也是多种疾病（如心血管疾病和癌症）的不良预后因素。过量的脂质浸润会减少肌肉质量和力量，并可能导致脂毒性及胰岛素抵抗，其程度取决于肌细胞内总脂质含量、脂滴（LD）形态以及亚细胞分布。肌纤维类型（氧化型与糖酵解型）也具有重要作用，因为氧化型纤维具有更强的脂质利用能力。鉴于其在病理生理过程中的关键意义，有必要针对不同肌纤维类型深入研究脂滴的动态变化及其功能。本文提供了一套完整的方法，用于在肌纤维类型特异性的基础上定量分析肌细胞内脂质含量，并评估脂滴的形态和亚细胞分布。为此，采用荧光染料Bodipy及抗肌球蛋白重链同工型抗体对连续肌肉冷冻切片进行染色。该方案可同时处理不同肌肉样本，节省时间并避免潜在的人为假象；此外，借助Fiji软件中自定义编写的宏工具，还可实现脂滴分析的自动化。 窗口并单击 分析 | 设置测量 并在弹出窗口中选择 面积，面积分数 和 限定至阈值保持其余复选框未勾选，其他参数维持默认设置。
      注意：如果研究人员希望分析 "圆形度" 脂滴的球形度指数，该指数范围从1（完美球形）到0（线形），单击 形态学描述符 的框 设置测量参数 弹出窗口
    14. 前往 感兴趣区域 窗口并选择第一个 ROI。在 Fiji 中 主要 窗口，单击 分析 | 分析颗粒工具.
      注意：该工具可量化每个选区内颗粒的数量、大小、覆盖面积及占总面积的百分比，并将结果保存为电子表格文件。
    15. 设置以下数值 2 至 无限 (2-无穷大) 在 分析颗粒 窗口，检查 像素 方框，保持默认的圆度值，选择 总结，然后点击 好的.
      注意：为检查纤维上的结果，可在 展示 选项，选择任意可用选项。若要在表格中显示所选区域内每个脂滴（LD）的识别信息，请勾选 显示结果 选项在 分析颗粒 窗口。纤维总面积的分析结果经平均后汇总于一个包含多列的表格中（计数、总面积、平均大小、面积百分比；这些分别对应颗粒（脂滴）的数量、这些颗粒所占的面积、其平均大小以及颗粒所占选择区域总面积的百分比）。为计算密度，将每个选区中的颗粒数量除以该选区的总面积。
    16. 为获得肌纤维中心和周边的数值，每次分别选择第二个（中心）和第三个感兴趣区域（周边），重复步骤 6.2.14 和 6.2.15。
    17. 单击以保存结果 文件 | 另存为 在 摘要 窗口。
      注意：在结果的命名中需包含纤维类型、处理条件及图像名称，以便后续数据的统一整理和统计分析。如需分析同一图像中的其余纤维，请重复步骤6.2.3至6.2.17。进行统计分析时，每只动物每种类型的纤维至少需分析10–15根。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

本文所述方案提供了一种高效的方法，可轻松地以肌纤维类型和亚细胞特异性的方式定量脂滴（LDs）。该方法表明，通过将两块大小相似的肌肉（如趾长伸肌（EDL）和比目鱼肌）一同冷冻，后续步骤所耗费的时间和资源可减少一半。

本文提供了针对成年小鼠肌肉中表达的不同MyHC同工型进行免疫染色、图像采集和分析的完整实验方案。该方案基于Schiaffino等人于1989年首次设计的方法33，并进行了若干调整，例如增加了一种用于标记层粘连蛋白的抗体。这一后续改进对于识别IIb型肌纤维尤为关键，因为此类纤维未被任何抗体染色，呈现黑色。如图5所示，该免疫组织化学方案不仅能够区分小鼠的慢收缩-氧化型（I型和IIa型）与快收缩-糖酵解型（IIx型和IIb型）肌纤维，还能识别出混合型肌纤维（见图5D中的星号标记）。此外，将两种肌肉的横切面置于同一张载玻片上，可实现对所选两种肌肉中各类肌纤维比例的直接...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本文所述方案介绍了一种在纤维类型和亚细胞特异性基础上定量标记Bodipy的脂滴（LDs）的高效方法。近年来，传统的脂质染料（如油红O或苏丹黑B）已被一系列新型细胞通透性、亲脂性荧光染料所取代，这些染料可结合中性脂质（例如Bodipy）。Bodipy以不同偶联形式提供，已被证实可高效标记脂滴，用于研究其形态、动态变化以及与其他细胞器的相互作用，不仅适用于多种固定组织和细胞23,38,39,40，也适用于活细胞41,42。

在该实验方案中，研究人员必须考虑若干关键因素，以获得最佳结果。必须将选定的肌肉正确放置在软木上，以确保肌纤维的完美对齐和方向，因为一旦冷冻，切片机上的样品托只能进行轻微调整。此外，切片完成后应立即...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由以下基金资助： 比利时科学基金会 （FNRS-研究信贷 J.0022.20）以及 法国糖尿病学会 （SFD-罗氏糖尿病护理）。C.M.S. 获得了比利时法语区基础研究基金会（FRIA，FNRS）的博士奖学金。M.A.D.-L.d.C. 获得了瓦隆-布鲁塞尔国际卓越计划的奖学金。

作者感谢Alice Monnier在本实验方案开发过程中的贡献，以及Caroline Bouzin在图像采集过程中提供的专业知识和技术帮助。我们还感谢2IP-IREC成像平台提供切片机和显微镜的使用权限（2IP-IREC成像平台，实验与临床研究中心，天主教鲁汶大学，比利时布鲁塞尔1200）。最后，作者感谢Nicolas Dubuisson、Romain Versele和Michel Abou-Samra对稿件提出的建设性批评意见。本文部分插图使用BioRender.com制作。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
仪器
AxioCam 506 mono 6 Mpix 相机Zeiss
AxioCam MRm 1.4MPix CCD 相机 Zeiss
化学通风橱Potteau LaboEN-14175
共聚焦显微镜ZeissLSM800
软木圆片（ø 20 mm，厚 3 mm） Electron Microscopy Sciences63305
低温手套Tempshield16072252
冷冻切片机 Thermo Scientific Microm Cryo Star HM 560
解剖体视显微镜 SMZ745Nikon
干冰
Dumont 镊子F.S.T11295-10
落射荧光显微镜ZeissAxioImage-Apotome Z1
超细 Bonn 剪刀F.S.T14084-08
FisherBrand 一次性底座模具（0.7 × 0.7 cm）ThermoFisher22-363-552用于切割一块材料以将肌肉固定在软木上进行冷冻
玻璃培养皿（高 25 mm，ø 150 mm）BRAND 培养皿，MERKBR455751用于在解剖过程中将肌肉置于冰上
ImmEdge 疏水屏障 PAP 笔Vector LabsH-4000用于在肌肉切片周围创建疏水屏障
培养箱MMM MedcenterIncucell 707 
显微镜盖玻片（24×50 mm）Assistent 40990151
显微镜载玻片盒 Kartell278用作免疫组织化学的湿盒
颈部固定器Linie zwoSB-035X-02用作固定不锈钢杯的带子
15 号无菌碳钢手术刀片Swann-Morton0205
画笔Van BleiswijckAmazon B07W7KJQ2X用于处理冷冻切片
永久性黑色记号笔Klinipath/VWR98307-R用于标记载玻片
Pierce 固定镊子F.S.T18155-13
聚苯乙烯箱 高 12 cm × 长 25 cm × 宽 18 cm，用作液氮容器并用于将样品运送至冷冻切片机
手术刀柄，125 mm（5"），3 号AesculapBB073R
不锈钢杯 10oz EboxerB07GFCBPFH用于盛装异戊烷以冷冻肌肉
Superfrost Ultra Plus 载玻片ThermoFisherJ1800AMNZ
外科镊子，1/2 齿Medische Vakhandel1303152也称为 "大鼠齿镊子"
Vannas 弹簧剪刀 - 3 mm 刃口F.S.T15000-00
称量舟VWR international611-2249
荧光全切片扫描仪ZeissAxio Scan.Z1
试剂
Alexa Fluor 405 山羊抗小鼠 IgG2bSigma-AldrichSAB4600477最终使用浓度为 1:500
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG1ThermoFisherA-21121最终使用浓度为 1:500
Alexa Fluor 568 山羊抗小鼠 IgMAbcamab175702最终使用浓度为 1:1,000
Alexa Fluor 647 山羊抗大鼠 IgG（H+L）二抗ThermoFisherA-21247最终使用浓度为 1:500
BODIPY-493/503（4,4-二氟-1,3,5,7,8-五甲基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-茚并）ThermoFisherD3922最终使用浓度为 1 µg/mL
BODIPY-558/568 C12（4,4-二氟-5-(2-噻吩基)-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-茚并-3-十二烷酸）ThermoFisherD3835最终使用浓度为 1 µg/mL
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）ThermoFisherD1306最终使用浓度为 0.5 µg/mL
二甲基亚砜（DMSO）Sigma-AldrichD-8418用于溶解 BODIPY 以配制 1 mg/mL 储存液。注意：有毒且易燃。蒸气可能引起刺激。应在通风橱中操作。避免与皮肤直接接触。佩戴橡胶手套和护目镜。
4% 甲醛溶液，缓冲，pH 6.9Sigma-Aldrich1004969011注意：可能引起过敏性皮肤反应。怀疑可导致遗传缺陷。可能致癌。应在通风橱中操作。避免与皮肤直接接触。佩戴橡胶手套和护目镜。
异戊烷 GPR RectaPurVWR international24872.298注意：极度易燃液体和蒸气。吞咽并进入呼吸道可能致命。可能引起嗜睡或头晕。反复接触可能导致皮肤干燥或开裂。应佩戴防护手套/防护服/护目镜/面部防护。
液氮注意：  极度低温。应佩戴手套。操作时应缓慢，以减少沸腾和飞溅，并在通风良好的区域进行。应使用专为低温液体设计的容器。
小鼠抗小鼠封闭试剂 Vector LabsMKB-2213-1使用浓度为 1:30
肌球蛋白重链 I 型（BA-D5-s 一抗），基因：MYH7，单克隆牛抗小鼠 IgG2bDSHB 爱荷华大学BA-D5-上清液最终使用浓度为 1:10
肌球蛋白重链 IIA 型（SC-71-s 一抗），基因：  MYH2，单克隆牛抗小鼠 IgG1DSHB 爱荷华大学SC-71-上清液最终使用浓度为 1:10
肌球蛋白重链 IIX 型（6H1-s 一抗），基因：  MYH1，单克隆兔抗小鼠 IgM发育研究杂交瘤库，爱荷华大学6H1-上清液最终使用浓度为 1:5
正常山羊血清（NGS）Vector LabsS-1000
PBS 0.1 M组织学实验室常用
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂Invitrogen P36930
大鼠抗层粘连蛋白-2（α-2 链）一抗（单克隆）Sigma-AldrichL0663最终使用浓度为 1:1,000
Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂Sakura 4583
软件
Adobe Illustrator CCAdobe Inc.用于设计图像
Adobe PhotoshopAdobe Inc.共聚焦软件
BioRenderhttps://biorender.com/用于设计图像
Fiji/ImageJhttps://imagej.net/software/fiji/用于分析获取的图像
Microsoft PowerPointMicrosoft用于在扫描纤维类型后重建整个肌肉的组织学图像
Zen Blue 2.6Zeiss用于在扫描纤维类型后重建整个肌肉的组织学图像

参考文献

  1. Correa-de-Araujo, R., et al. Myosteatosis in the context of skeletal muscle function deficit: an interdisciplinary workshop at the National Institute on Aging. Frontiers in Physiology. 11, 963(2020).
  2. Miljkovic, I., et al. Greater skeletal muscle fat infiltration is associated with higher all-cause and cardiovascular mortality in older men. Journals of Gerontology Series A: Biomedical Sciences and Medical Sciences. 70 (9), 1133-1140 (2015).
  3. Nachit, M., et al. Myosteatosis rather than sarcopenia associates with non-alcoholic steatohepatitis in non-alcoholic fatty liver disease preclinical models. Journal of Cachexia, Sarcopenia, and Muscle. 12 (1), 144-158 (2021).
  4. Aleixo, G. F. P., et al. Myosteatosis and prognosis in cancer: Systematic review and meta-analysis. Critical Reviews in Oncology/Hematolgoy. 145, 102839(2020).
  5. Gemmink, A., Schrauwen, P., Hesselink, M. K. C. Exercising your fat (metabolism) into shape: a muscle-centred view. Diabetologia. 63 (8), 1453-1463 (2020).
  6. van Loon, L. J. Use of intramuscular triacylglycerol as a substrate source during exercise in humans. Journal of Applied Physiology. 97 (4), 1170-1187 (2004).
  7. Coen, P. M., Goodpaster, B. H. Role of intramyocelluar lipids in human health. Trends in Endocrinology and Metabolism. 23 (8), 391-398 (2012).
  8. Seibert, J. T., Najt, C. P., Heden, T. D., Mashek, D. G., Chow, L. S. Muscle lipid droplets: cellular signaling to exercise physiology and beyond. Trends in Endocrinology and Metabolism. 31 (12), 928-938 (2020).
  9. Bergman, B. C., Goodpaster, B. H. Exercise and muscle lipid content, composition, and localization: influence on muscle insulin sensitivity. Diabetes. 69 (5), 848-858 (2020).
  10. Nielsen, J., Christensen, A. E., Nellemann, B., Christensen, B. Lipid droplet size and location in human skeletal muscle fibers are associated with insulin sensitivity. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 313 (6), 721-730 (2017).
  11. Covington, J. D., et al. Intramyocellular lipid droplet size rather than total lipid content is related to insulin sensitivity after 8 weeks of overfeeding. Obesity (Silver Spring). 25 (12), 2079-2087 (2017).
  12. Bosma, M. Lipid droplet dynamics in skeletal muscle). Experimental Cell Research. 340 (2), 180-186 (2016).
  13. Nielsen, J., et al. Increased subsarcolemmal lipids in type 2 diabetes: effect of training on localization of lipids, mitochondria, and glycogen in sedentary human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 298 (3), 706-713 (2010).
  14. Ferreira, R., et al. Subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria proteome differences disclose functional specializations in skeletal muscle. Proteomics. 10 (17), 3142-3154 (2010).
  15. Barrett, J. S., Whytock, K. L., Strauss, J. A., Wagenmakers, A. J. M., Shepherd, S. O. High intramuscular triglyceride turnover rates and the link to insulin sensitivity: influence of obesity, type 2 diabetes and physical activity. Applied Physiology, Nutrition and Metabolism. , 1-14 (2022).
  16. Daemen, S., et al. Distinct lipid droplet characteristics and distribution unmask the apparent contradiction of the athlete's paradox. Molecular Metabolism. 17, 71-81 (2018).
  17. Bredella, M. A., Ghomi, R. H., Thomas, B. J., Miller, K. K., Torriani, M. Comparison of 3.0 T proton magnetic resonance spectroscopy short and long echo-time measures of intramyocellular lipids in obese and normal-weight women. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 32 (2), 388-393 (2010).
  18. Schrauwen-Hinderling, V. B., Hesselink, M. K., Schrauwen, P., Kooi, M. E. Intramyocellular lipid content in human skeletal muscle. Obesity (Silver Spring). 14 (3), 357-367 (2006).
  19. De Bock, K., et al. Evaluation of intramyocellular lipid breakdown during exercise by biochemical assay, NMR spectroscopy, and Oil Red O staining. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (1), 428-434 (2007).
  20. Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. K. Optimisation of oil red O staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochemistry and Cell Biology. 116 (1), 63-68 (2001).
  21. Gueugneau, M., et al. Skeletal muscle lipid content and oxidative activity in relation to muscle fiber type in aging and metabolic syndrome. Journal of Gerontology Series A: Biomedical Sciences and Medical Sciences. 70 (5), 566-576 (2015).
  22. Gemmink, A., et al. Super-resolution microscopy localizes perilipin 5 at lipid droplet-mitochondria interaction sites and at lipid droplets juxtaposing to perilipin 2. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular and Cell Biology of Lipids. 1863 (11), 1423-1432 (2018).
  23. Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 598358, (2011).
  24. Prats, C., et al. An optimized histochemical method to assess skeletal muscle glycogen and lipid stores reveals two metabolically distinct populations of type I muscle fibers. PLoS One. 8 (10), 77774(2013).
  25. Strauss, J. A., Shepherd, D. A., Macey, M., Jevons, E. F. P., Shepherd, S. O. Divergence exists in the subcellular distribution of intramuscular triglyceride in human skeletal muscle dependent on the choice of lipid dye. Histochemistry and Cell Biology. 154 (4), 369-382 (2020).
  26. Shepherd, S. O., et al. Sprint interval and traditional endurance training increase net intramuscular triglyceride breakdown and expression of perilipin 2 and 5. Journal of Physiology. 591 (3), 657-675 (2013).
  27. Whytock, K. L., et al. A 7-day high-fat, high-calorie diet induces fibre-specific increases in intramuscular triglyceride and perilipin protein expression in human skeletal muscle. Journal of Physiology. 598 (6), 1151-1167 (2020).
  28. Wang, C., Yue, F., Kuang, S. Muscle histology characterization using h&e staining and muscle fiber type classification using immunofluorescence staining. Bio-Protocol. 7 (10), (2017).
  29. Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51586(2014).
  30. Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52793(2015).
  31. Leiva-Cepas, F., et al. Laboratory methodology for the histological study of skeletal muscle. Archivos de Medicina del Deporte. 35 (186), 254-262 (2018).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. Journal of Muscle Research & Cell Motility. 10 (3), 197-205 (1989).
  34. Komiya, Y., et al. Mouse soleus (slow) muscle shows greater intramyocellular lipid droplet accumulation than EDL (fast) muscle: fiber type-specific analysis. Journal of Muscle Research & Cell Motility. 38 (2), 163-173 (2017).
  35. Andrich, D. E., et al. Altered lipid metabolism impairs skeletal muscle force in young rats submitted to a short-term high-fat diet. Frontiers in Physiology. 9, 1327(2018).
  36. Schiaffino, S. Fibre types in skeletal muscle: a personal account. Acta Physiologica. 199 (4), 451-463 (2010).
  37. Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), 35273(2012).
  38. Gemmink, A., et al. Decoration of intramyocellular lipid droplets with PLIN5 modulates fasting-induced insulin resistance and lipotoxicity in humans. Diabetologia. 59 (5), 1040-1048 (2016).
  39. Askinas, C., et al. Biophotonics Congress: Biomedical Optics Congress 2018 (Microscopy/Translational/Brain/OTS). , JTu3A.4 (Optical Society of America) (2018).
  40. Morén, B., et al. EHD2 regulates adipocyte function and is enriched at cell surface-associated lipid droplets in primary human adipocytes. Molecular Biology of the Cell. 30 (10), 1147-1159 (2019).
  41. Benador, I. Y., et al. Mitochondria bound to lipid droplets have unique bioenergetics, composition, and dynamics that support lipid droplet expansion. Cell Metabolism. 27 (4), 869-885 (2018).
  42. de la Rosa Rodriguez, M. A., et al. Hypoxia-inducible lipid droplet-associated induces DGAT1 and promotes lipid storage in hepatocytes. Molecular Metabolism. 47, 101168(2021).
  43. Jevons, E. F. P., Gejl, K. D., Strauss, J. A., Ørtenblad, N., Shepherd, S. O. Skeletal muscle lipid droplets are resynthesized before being coated with perilipin proteins following prolonged exercise in elite male triathletes. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 318 (3), 357-370 (2020).
  44. Ohsaki, Y., Maeda, T., Fujimoto, T. Fixation and permeabilization protocol is critical for the immunolabeling of lipid droplet proteins. Histochemistry and Cell Biology. 124 (5), 445-452 (2005).
  45. Prats, C., et al. Decrease in intramuscular lipid droplets and translocation of HSL in response to muscle contraction and epinephrine. Journal of Lipid Research. 47 (11), 2392-2399 (2006).
  46. Listenberger, L. L., Brown, D. A. Fluorescent detection of lipid droplets and associated proteins. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 24 (Unit 24.22) (2007).
  47. Xue, Y., Lim, S., Bråkenhielm, E., Cao, Y. Adipose angiogenesis: quantitative methods to study microvessel growth, regression and remodeling in vivo. Nature Protocols. 5 (5), 912-920 (2010).
  48. Muliyil, S., et al. ADAM17-triggered TNF signalling protects the ageing Drosophila retina from lipid droplet-mediated degeneration. The EMBO Journal. 39 (17), 104415(2020).
  49. Yan, Q., et al. Autophagy activation contributes to lipid accumulation in tubular epithelial cells during kidney fibrosis. Cell Death Discovery. 4, 2(2018).
  50. Coassin, S., et al. Investigation and functional characterization of rare genetic variants in the adipose triglyceride lipase in a large healthy working population. PLoS Genetics. 6 (12), 1001239(2010).
  51. Daemen, S., van Zandvoort, M., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2016).
  52. Chen, Q., et al. Rab8a deficiency in skeletal muscle causes hyperlipidemia and hepatosteatosis by impairing muscle lipid uptake and storage. Diabetes. 66 (9), 2387-2399 (2017).
  53. Gemmink, A., et al. Decoration of myocellular lipid droplets with perilipins as a marker for in vivo lipid droplet dynamics: A super-resolution microscopy study in trained athletes and insulin resistant individuals. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (2), 158852(2021).
  54. Bergman, B. C., Hunerdosse, D. M., Kerege, A., Playdon, M. C., Perreault, L. Localisation and composition of skeletal muscle diacylglycerol predicts insulin resistance in humans. Diabetologia. 55 (4), 1140-1150 (2012).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

脂滴肌纤维分型分析肌内脂肪变性肌细胞内脂质共聚焦显微镜Bodipy染色亚细胞分布免疫组织化学肌肉冰冻切片
骨骼肌中脂滴含量的纤维类型与亚细胞特异性分析
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。