越来越多的证据表明，过量的脂质在骨骼肌内的积聚会导致脂毒性并引发糖尿病。本文提供了一套完整的实验方案，包括组织处理、Bodipy 染色、图像采集和分析，以按肌纤维类型特异性地定量脂滴的大小、密度及亚细胞分布情况。
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本文内容
摘要
摘要
骨骼肌脂肪浸润，即肌内脂肪变性（myosteatosis），随着肥胖和衰老而增加。最近研究发现，肌内脂肪变性也是多种其他疾病（如心血管疾病和癌症）的不良预后因素。过度的脂肪浸润会减少肌肉质量和力量，并可能导致脂毒性及胰岛素抵抗，其程度取决于肌细胞内总脂质含量、脂滴（LD）形态以及亚细胞分布。肌纤维类型（氧化型与糖酵解型）也具有重要作用，因为氧化型纤维具有更强的脂质利用能力。鉴于其在病理生理过程中的关键意义，有必要针对不同肌纤维类型深入开展对脂滴动态变化及其功能的深入研究。
本文提供了一种完整的实验方案，用于定量分析肌细胞内脂质含量，并以肌纤维类型特异性的方式对脂滴（LD）的形态及亚细胞分布进行分析。为此，采用荧光染料Bodipy及针对肌球蛋白重链同工型的抗体对连续肌肉冷冻切片进行染色。该方案可同时处理不同肌肉样本，节省时间并避免潜在的人为假象；同时，借助Fiji软件中自定义宏的创建，还可实现脂滴分析的自动化。
引言
骨骼肌中的脂质浸润被称为肌内脂肪变性（myosteatosis），其程度随肥胖和衰老而增加。肌内脂肪变性与肌肉质量、肌肉力量以及胰岛素敏感性呈负相关1。此外，近期研究表明，肌内脂肪变性的程度可作为心血管疾病2、非酒精性脂肪性肝病3或癌症4等其他疾病的预后因素。脂质可在骨骼肌纤维之间以细胞外肌脂（extramyocellular lipids）的形式积聚，也可在肌纤维内部以细胞内肌脂（intramyocellular lipids, IMCLs）的形式储存。IMCLs主要以甘油三酯的形式储存在脂滴（lipid droplets, LDs）中，在运动过程中作为代谢燃料被利用5,6。然而，当脂质供应超过需求，或线粒体功能受损时，IMCLs会参与导致肌肉胰岛素抵抗，这在代谢不健康的肥胖个体及2型糖尿病患者中可见7。有趣的是，耐力运动员体内的IMCLs水平与2型糖尿病肥胖患者相似甚至更高，却仍保持较高的胰岛素敏感性。这一现象被称为“运动员悖论”（athlete's paradox）8,....
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方案
所有在小鼠上进行的操作均经比利时天主教鲁汶大学医学部动物实验伦理委员会批准（2019/UCL/MD/013）。
1. 样品的解剖与冷冻前准备
- 为每对肌肉标记一块3 mm厚的软木塞。
- 用刀片在软木塞中心切出一个小切口，垂直插入一块矩形硬质塑料（宽0.5 cm，高1 cm），作为支撑（图2B）。
注意：矩形塑料片的尺寸取决于肌肉的大小。此处所述尺寸适用于3月龄C57BL/6J雄性小鼠的比目鱼肌（约9 mg，长1 cm，宽2–3 mm）和趾长伸肌（约5 mg，长1 cm，宽2–3 mm）。 - 在解剖时，取出小鼠后肢的比目鱼肌和趾长伸肌。为防止样本在解剖过程中干燥，将其置于冰上培养皿中用生理盐水轻微润湿的纱布上。
注意：有关如何解剖这两块肢体肌肉的说明，请参见Wang等28。 - 在软木塞与塑料片的连接处滴加少量最佳切割温度化合物（OCT），避免产生气泡。
- 用纸巾轻轻吸干样本表面多余水分（图2A），然后将两块肌肉垂直于软木塞放置在塑料片上（图2C）。
- 在体视显微镜下检查肌纤维的方向（....
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结果
本文所述方案提供了一种高效的方法，可轻松地以肌纤维类型和亚细胞特异性的方式定量脂滴（LDs）。该方法表明，通过将两块大小相似的肌肉（如趾长伸肌（EDL）和比目鱼肌）一同冷冻，后续步骤所耗费的时间和资源可减少一半。
本文提供了针对成年小鼠肌肉中表达的不同MyHC同工型进行免疫染色、图像采集和分析的完整实验方案。该方案基于Schiaffino等人于1989年首次设计的方法33，并进行了若干调整，例如增加了一种用于标记层粘连蛋白的抗体。这一后续改进对于识别IIb型肌纤维尤为关键，因为此类纤维未被任何抗体染色，呈现黑色。如图5所示，该免疫组织化学方案不仅能够区分小鼠的慢收缩-氧化型（I型和IIa型）与快收缩-糖酵解型（IIx型和IIb型）肌纤维，还能识别出混合型肌纤维（见图5D中的星号标记）。此外，将两种肌肉的横切面置于同一张载玻片上，可实现对所选两种肌肉中各类肌纤维比例的直接.......
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讨论
本文所述方案介绍了一种在纤维类型和亚细胞特异性基础上定量标记Bodipy的脂滴（LDs）的高效方法。近年来，传统的脂质染料（如油红O或苏丹黑B）已被一系列新型细胞通透性、亲脂性荧光染料所取代，这些染料可结合中性脂质（例如Bodipy）。Bodipy以不同偶联形式提供，已被证实可高效标记脂滴，用于研究其形态、动态变化以及与其他细胞器的相互作用，不仅适用于多种固定组织和细胞23,38,39,40，也适用于活细胞41,42。
在该实验方案中，研究人员必须考虑若干关键因素，以获得最佳结果。必须将选定的肌肉正确放置在软木上，以确保肌纤维的完美对齐和方向，因为一旦冷冻，切片机上的样品托只能进行轻微调整。此外，切片完成后应立即.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由以下基金资助： 比利时科学基金会 （FNRS-研究信贷 J.0022.20）以及 法国糖尿病学会 （SFD-罗氏糖尿病护理）。C.M.S. 获得了比利时法语区基础研究基金会（FRIA，FNRS）的博士奖学金。M.A.D.-L.d.C. 获得了瓦隆-布鲁塞尔国际卓越计划的奖学金。
作者感谢Alice Monnier在本实验方案开发过程中的贡献，以及Caroline Bouzin在图像采集过程中提供的专业知识和技术帮助。我们还感谢2IP-IREC成像平台提供切片机和显微镜的使用权限（2IP-IREC成像平台，实验与临床研究中心，天主教鲁汶大学，比利时布鲁塞尔1200）。最后，作者感谢Nicolas Dubuisson、Romain Versele和Michel Abou-Samra对稿件提出的建设性批评意见。本文部分插图使用BioRender.com制作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 仪器 | |||
| AxioCam 506 mono 6 Mpix 相机 | Zeiss | ||
| AxioCam MRm 1.4MPix CCD 相机 | Zeiss | ||
| 化学通风橱 | Potteau Labo | EN-14175 | |
| 共聚焦显微镜 | Zeiss | LSM800 | |
| 软木圆片（ø 20 mm，厚 3 mm） | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
| 低温手套 | Tempshield | 16072252 | |
| 冷冻切片机 | Thermo Scientific | Microm Cryo Star HM 560 | |
| 解剖体视显微镜 SMZ745 | Nikon | ||
| 干冰 | |||
| Dumont 镊子 | F.S.T | 11295-10 | |
| 落射荧光显微镜 | Zeiss | AxioImage-Apotome Z1 | |
| 超细 Bonn 剪刀 | F.S.T | 14084-08 | |
| FisherBrand 一次性底座模具（0.7 × 0.7 cm） | ThermoFisher | 22-363-552 | 用于切割一块材料以将肌肉固定在软木上进行冷冻 |
| 玻璃培养皿（高 25 mm，ø 150 mm） | BRAND 培养皿，MERK | BR455751 | 用于在解剖过程中将肌肉置于冰上 |
| ImmEdge 疏水屏障 PAP 笔 | Vector Labs | H-4000 | 用于在肌肉切片周围创建疏水屏障 |
| 培养箱 | MMM Medcenter | Incucell 707 | |
| 显微镜盖玻片（24×50 mm） | Assistent | 40990151 | |
| 显微镜载玻片盒 | Kartell | 278 | 用作免疫组织化学的湿盒 |
| 颈部固定器 | Linie zwo | SB-035X-02 | 用作固定不锈钢杯的带子 |
| 15 号无菌碳钢手术刀片 | Swann-Morton | 0205 | |
| 画笔 | Van Bleiswijck | Amazon B07W7KJQ2X | 用于处理冷冻切片 |
| 永久性黑色记号笔 | Klinipath/VWR | 98307-R | 用于标记载玻片 |
| Pierce 固定镊子 | F.S.T | 18155-13 | |
| 聚苯乙烯箱 | 高 12 cm × 长 25 cm × 宽 18 cm，用作液氮容器并用于将样品运送至冷冻切片机 | ||
| 手术刀柄，125 mm（5"），3 号 | Aesculap | BB073R | |
| 不锈钢杯 10oz | Eboxer | B07GFCBPFH | 用于盛装异戊烷以冷冻肌肉 |
| Superfrost Ultra Plus 载玻片 | ThermoFisher | J1800AMNZ | |
| 外科镊子，1/2 齿 | Medische Vakhandel | 1303152 | 也称为 "大鼠齿镊子" |
| Vannas 弹簧剪刀 - 3 mm 刃口 | F.S.T | 15000-00 | |
| 称量舟 | VWR international | 611-2249 | |
| 荧光全切片扫描仪 | Zeiss | Axio Scan.Z1 | |
| 试剂 | |||
| Alexa Fluor 405 山羊抗小鼠 IgG2b | Sigma-Aldrich | SAB4600477 | 最终使用浓度为 1:500 |
| Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG1 | ThermoFisher | A-21121 | 最终使用浓度为 1:500 |
| Alexa Fluor 568 山羊抗小鼠 IgM | Abcam | ab175702 | 最终使用浓度为 1:1,000 |
| Alexa Fluor 647 山羊抗大鼠 IgG（H+L）二抗 | ThermoFisher | A-21247 | 最终使用浓度为 1:500 |
| BODIPY-493/503（4,4-二氟-1,3,5,7,8-五甲基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-茚并） | ThermoFisher | D3922 | 最终使用浓度为 1 µg/mL |
| BODIPY-558/568 C12（4,4-二氟-5-(2-噻吩基)-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-茚并-3-十二烷酸） | ThermoFisher | D3835 | 最终使用浓度为 1 µg/mL |
| DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚） | ThermoFisher | D1306 | 最终使用浓度为 0.5 µg/mL |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | D-8418 | 用于溶解 BODIPY 以配制 1 mg/mL 储存液。注意：有毒且易燃。蒸气可能引起刺激。应在通风橱中操作。避免与皮肤直接接触。佩戴橡胶手套和护目镜。 |
| 4% 甲醛溶液，缓冲，pH 6.9 | Sigma-Aldrich | 1004969011 | 注意：可能引起过敏性皮肤反应。怀疑可导致遗传缺陷。可能致癌。应在通风橱中操作。避免与皮肤直接接触。佩戴橡胶手套和护目镜。 |
| 异戊烷 GPR RectaPur | VWR international | 24872.298 | 注意：极度易燃液体和蒸气。吞咽并进入呼吸道可能致命。可能引起嗜睡或头晕。反复接触可能导致皮肤干燥或开裂。应佩戴防护手套/防护服/护目镜/面部防护。 |
| 液氮 | 注意： 极度低温。应佩戴手套。操作时应缓慢，以减少沸腾和飞溅，并在通风良好的区域进行。应使用专为低温液体设计的容器。 | ||
| 小鼠抗小鼠封闭试剂 | Vector Labs | MKB-2213-1 | 使用浓度为 1:30 |
| 肌球蛋白重链 I 型（BA-D5-s 一抗），基因：MYH7，单克隆牛抗小鼠 IgG2b | DSHB 爱荷华大学 | BA-D5-上清液 | 最终使用浓度为 1:10 |
| 肌球蛋白重链 IIA 型（SC-71-s 一抗），基因： MYH2，单克隆牛抗小鼠 IgG1 | DSHB 爱荷华大学 | SC-71-上清液 | 最终使用浓度为 1:10 |
| 肌球蛋白重链 IIX 型（6H1-s 一抗），基因： MYH1，单克隆兔抗小鼠 IgM | 发育研究杂交瘤库，爱荷华大学 | 6H1-上清液 | 最终使用浓度为 1:5 |
| 正常山羊血清（NGS） | Vector Labs | S-1000 | |
| PBS 0.1 M | 组织学实验室常用 | ||
| ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂 | Invitrogen | P36930 | |
| 大鼠抗层粘连蛋白-2（α-2 链）一抗（单克隆） | Sigma-Aldrich | L0663 | 最终使用浓度为 1:1,000 |
| Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂 | Sakura | 4583 | |
| 软件 | |||
| Adobe Illustrator CC | Adobe Inc. | 用于设计图像 | |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | 共聚焦软件 | |
| BioRender | https://biorender.com/ | 用于设计图像 | |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/ | 用于分析获取的图像 | |
| Microsoft PowerPoint | Microsoft | 用于在扫描纤维类型后重建整个肌肉的组织学图像 | |
| Zen Blue 2.6 | Zeiss | 用于在扫描纤维类型后重建整个肌肉的组织学图像 |
参考文献
- Correa-de-Araujo, R., et al. Myosteatosis in the context of skeletal muscle function deficit: an interdisciplinary workshop at the National Institute on Aging. Frontiers in Physiology. 11, 963(2020).
- Miljkovic, I., et al.
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