方法文章

骨骼肌中脂质液滴含量的纤维类型和亚细胞特异性分析

DOI：

10.3791/63718

⸱

2022年6月8日

 ,  ,  , 
1Endocrinology, Diabetes and Nutrition Unit, Institute of Experimental and Clinical Research, Medical Sector, Université Catholique de Louvain, 2Departamento de Fisiología, Facultad de Biología, Universidad de Sevilla

本文内容

摘要

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越来越多的证据表明，脂质在骨骼肌内的过度浸润会导致脂毒性和糖尿病。在这里，我们提出了一个完整的方案，包括组织处理，使用Bodypy染色，图像采集和分析，以纤维型特定方式量化脂质液滴的大小，密度和亚细胞分布。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

骨骼肌脂质浸润，称为肌质变性，随着肥胖和衰老而增加。肌层沉积症最近也被发现是心血管疾病和癌症等其他几种疾病的阴性预后因素。过量的脂质浸润会降低肌肉质量和力量。它还会导致脂毒性和胰岛素抵抗，这取决于总肌细胞内脂质含量，脂质液滴（LD）形态和亚细胞分布。纤维类型（氧化性与糖酵解）也很重要，因为氧化纤维具有更大的利用脂质的能力。由于它们在病理生理学中的重要意义，有必要以纤维类型特异性方式对LD动力学和功能进行深入研究。

本文提出了一个完整的方案，用于以纤维类型特异性方式定量肌细胞内脂质含量并分析LD形态和亚细胞分布。为此，用荧光染料Bodypy和针对肌球蛋白重链亚型的抗体染色连续肌肉冷冻切片。该协议可以同时处理不同的肌肉，节省时间并避免可能的伪影，并且由于在斐济创建的个性化宏，LD分析的自动化也是可能的。

引言

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骨骼肌脂质浸润，称为肌质变性，随着肥胖和衰老而增加。肌层沉积与肌肉质量和力量以及胰岛素敏感性1呈负相关。此外，最近的研究表明，肌层沉积的程度可用作其他疾病的预后因素，如心血管疾病2，非酒精性脂肪性肝病3或癌症4。脂质可以作为肌细胞外脂质积聚在肌肉纤维之间的骨骼肌中，也可以作为肌细胞内脂质（IMCLs）积聚在纤维内。IMCL主要作为甘油三酯储存在脂质飞沫（LD）中，在体育锻炼期间用作代谢燃料5，6。然而，当脂质供应超过需求时，或当线粒体变得功能失调时，IMCLs将与肌肉胰岛素抵抗有关，如代谢不健康的个体，肥胖的个体和2型糖尿病患者7所示。有趣的是，耐力运动员的IMCL水平与肥胖的2型糖尿病患者相似，如果不是更高，同时保持高胰岛素敏感性。这种现象被描述为"运动员悖论"8，9，并通过对肌肉LD的更细致入微的评估来解释，这些评估与它们的大小，密度，定位，动力学和脂质物种组成有关。

首先，LD大小与胰岛素敏感性和体能<....

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方案

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对小鼠进行的所有程序均由鲁汶天主教大学医学部动物实验伦理委员会批准（2019 / UCL / MD / 013）。

1. 解剖和制备冷冻样品

  1. 为每对肌肉贴上3毫米厚的软木塞标签。
  2. 通过用软木塞中心的刀片制成的小切口，垂直插入一块矩形的硬质塑料（0.5厘米宽，1厘米高），该矩形块将用作支撑（图2B）。
    注意:矩形塑料块的大小取决于肌肉的大小。在这里，所描述的尺寸适用于3个月大的C57BL / 6J雄性小鼠的太阳（约9毫克，1厘米L，2-3毫米宽）和EDL（约5毫克，1厘米长，2-3毫米宽）的大小。
  3. 在解剖时，取出小鼠后肢的比目鱼和EDL。为了防止样品在解剖过程中变干，请将其放在放在冰上的培养皿中用盐水溶液略微润湿的压缩物上。
    注:参见Wang等人28 ，了解如何解剖这两块肢体肌肉。
  4. 在软木/塑料接头处放置一小滴最佳切削温度化合物（OCT），避免气泡。
  5. 用纸巾轻轻擦干样品中多余的水分（图2A），并将两块肌肉分别放在垂直于软木塞的塑料上（图2C）。
  6. 在立体显微镜下检查肌肉肌纤维的方向（

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结果

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本文中描述的方案提供了一种以纤维类型和亚细胞特异性方式容易地量化LD的有效方法。它展示了如何将两块大小相似的肌肉（如EDL和比目鱼）冻结在一起，将以下步骤所花费的时间和资源减少一半。

为免疫染色、图像采集和分析成年小鼠肌肉中表达的不同MyHC亚型提供了完整的方案。该协议基于Schiaffino等人于1989年首次设计的方案3 3，并进行了一些调整，例如使用额外的抗体来标记层粘连蛋白。这种后来的修饰对于IIb型纤维的位置至关重要，IIb型纤维将是黑色的，因为它们没有用任何抗体染色。如图5所示，该免疫组织化学方案不仅允许识别小鼠慢氧化（I型和IIa型）和快速糖酵解（IIx型和IIb型）纤维，而且还允许存在杂化纤维（见图5D中的星号）。此外，在同一张幻灯片上具有两种肌肉的横截面可以比较两种所选肌肉之间每种纤维类型的比例，从而确保两个部分的实验条件相同。

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讨论

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这里详细介绍的方案描述了一种在纤维类型和亚细胞特异性基础上量化用Body标记的LD的有效方法。近年来，经典的脂质染料，如ORO或苏丹黑B，已被一系列新的细胞渗透性亲脂性荧光染料取代，这些染料与中性脂质（例如Bodypy）结合。作为不同的偶联物，Bodipy已被证明在标记LD以研究其形态，动力学和与其他细胞器的相互作用方面非常有效，不仅在不同的固定组织和细胞23，38，39，40中，而且在活细胞41，42中也是如此。

在协议中，研究人员必须考虑几个关键方面才能获得最佳结果。必须将所选的肌肉正确放置在软木塞上，以确保肌肉肌纤维的完美对齐和方向，因为一旦冻结，只能在低温恒温器上对支架进行轻微的重新调整。此外，在切片切割.......

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披露

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作者没有利益冲突需要声明。

致谢

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这项工作得到了 国家科学研究基金会 （FNRS-Crédit de Recherche J.0022.20）和 法语国家糖尿病护理协会 （SFD-Roche糖尿病护理）的资助。M.A.D.-L.D.C.获得了瓦隆-布鲁塞尔国际卓越计划的研究金。

作者感谢爱丽丝·莫尼尔对该协议开发的贡献，并感谢卡罗琳·布津在图像获取过程中的专业知识和技术帮助。我们还感谢2IP-IREC成像平台访问低温恒温器和显微镜（2IP-IREC成像平台，鲁汶天主教大学实验和临床研究所，比利时布鲁塞尔1200）。最后，作者要感谢尼古拉斯·杜比松、罗曼·维塞尔和米歇尔·阿布-萨姆拉对手稿的建设性批评。这些文章的一些数字是用 BioRender.com 创建的。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
设备
AxioCam 506 mono 6 Mpix 相机蔡司
AxioCam MRm 1.4MPix CCD 相机 蔡司
化学罩Potteau LaboEN-14175
共聚焦显微镜蔡司LSM800
软木盘（ø 20 毫米，3 毫米厚） 电子显微镜科学63305
手套Tempshield16072252
低温恒温器 Thermo Scientific Microm Cryo Star HM 560
解剖体视显微镜 SMZ745尼康
干冰
Dumont 镊子FST11295-10
落射荧光显微镜蔡司AxioImage-Apotome Z1
超细波恩剪刀FST14084-08
FisherBrand 一次性基模 （0.7 x 0.7 cm）ThermoFisher22-363-552用于切一块以将肌肉固定在软木塞上以冷冻
玻璃培养皿 （H 25 mm， ø150 mm）BRAND 培养皿，MERKBR455751用于在解剖过程中将肌肉放在冰上
ImmEdge 疏水屏障 PAP 笔Vector LabsH-4000用于在肌肉切片周围创建恐血屏障
培养箱MMM MedcenterIncucell 707 
显微镜盖玻片 （24x50 mm）辅助 
显微镜载玻片盒 Kartell278用作免疫组织化学的潮湿室
颈部支架Linie zwoSB-035X-02用作固定不锈钢不倒翁的带子
No 15 无菌碳钢手术刀刀片Swann-Morton0205
油漆刷Van BleiswijckAmazon B07W7KJQ2X用于处理冷冻切片
永久性记号笔 黑色Klinipath/VWR98307-R用于标记载玻片
穿孔固定钳F.S.T18155-13
聚苯乙烯盒 高 12 厘米 x 长 25 厘米 x 宽 18 厘米，用作液氮容器并将样品运输到低温恒温
手术刀手柄，125 毫米（5 英寸），No. 3AesculapBB073R
不锈钢杯 10 盎司 EboxerB07GFCBPFH填充异戊烯的不倒翁，用于肌肉冷冻
Superfrost Ultra Plus 载玻片 ThermoFisherJ1800AMNZ
手术镊子 1/2 齿Medische Vakhandel1303152也称为"大鼠牙镊子"
Vannas 弹簧剪刀 - 3 毫米尖端FST15000-00
称重船VWR国际611-2249
荧光全玻片扫描仪ZeissAxio Scan.Z1
试剂
Alexa Fluor 405 山羊抗小鼠 IgG2bSigma-AldrichSAB4600477以 1：500 的最终浓度使用
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG1ThermoFisherA-21121用于终浓度为 1：500
Alexa Fluor 568 山羊抗小鼠 IgMAbcamab175702终浓度为 1：1,000
Alexa Fluor 647 山羊抗大鼠 IgG （H+L） 二抗ThermoFisherA-21247终浓度为 1：500
BODIPY-493/503（4,4-二氟-1,3,5,7,8-喷二氮-4-硼-3a，4a-二氮杂-s-吲达热）ThermoFisherD3922在终浓度为 1 µg/mL
BODIPY-558/568 C12（4,4-二氟-5-（2-噻吩基）-4-硼-3a，4a-二氮杂-s-十二烷酸）ThermoFisherD3835以 1 &μ 的最终浓度使用;g/mL
DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）ThermoFisherD1306终浓度为 0.5 µg/mL
二甲基亚砜 （DMSO）Sigma-AldrichD-8418用于解决 1 mg/mL 储备液的 Bodipy。<强>注意：有毒且易燃。蒸气可能会引起刺激。在通风橱中作。避免直接接触皮肤。戴橡胶手套，戴护目镜。
甲醛溶液 4%，缓冲，pH 值 6.9Sigma-Aldrich1004969011注意：可能引起皮肤过敏反应。怀疑导致遗传缺陷。可能导致癌症。在通风橱中作。避免直接接触皮肤。戴橡胶手套，戴护目镜。
异戊烷 GPR RectaPurVWR 国际24872.298注意：极易燃液体和蒸气。吞咽进入气道可能致命。可能导致嗜睡或头晕。反复接触可能会导致皮肤干燥或开裂。戴防护手套/穿防护服/护目镜/面罩。
液氮注意：极度寒冷。戴手套。缓慢处理，以减少沸腾和飞溅，并在通风良好的地方处理。使用专为低温液体设计的容器。
鼠标对鼠标封闭剂 Vector LabsMKB-2213-1以 1：30
肌球蛋白重链 I 型（BA-D5-s 一抗）的浓度使用基因：MYH7，单克隆牛抗小鼠 IgG2bDSHB 爱荷华大学BA-D5-上清液以 1：10
肌球蛋白重链 IIA 型（SC-71-s 一抗）的最终浓度使用基因： MYH2，单克隆牛抗小鼠 IgG1DSHB 爱荷华大学SC-71 上清液，终浓度为 1：10
肌球蛋白重链 IIX 型（6H1-s 一抗），基因： MYH1，单克隆兔抗小鼠 IgM发育研究 杂交瘤库，爱荷华大学6H1 上清液以 1：5 的最终浓度使用
正常山羊血清 （NGS）Vector LabsS-1000
PBS 0.1 M常用于组织学实验室
ProLong Gold 抗淬灭封固剂Invitrogen P36930
大鼠抗层粘连蛋白-2（α-2 链）一抗（单克隆）Sigma-AldrichL0663以 1：1,000 的终浓度使用
-Tek O.C.T 化合物樱花 4583
软件
Adobe Illustrator CCAdobe Inc.用于设计
Adobe PhotoshopAdobe Inc.共聚焦软件
BioRenderhttps://biorender.com/用于设计图形
斐济/ImageJhttps://imagej.net/software/fiji/用于分析Microsoft
后重建整个肌肉的组织学用于在扫描纤维类型后重建整个肌肉的组织学
低温40990151器组织 PowerPoint Microsoft 获取的图像 用于在扫描纤维类型 Zen Blue 2.6 蔡司

参考文献

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  1. Correa-de-Araujo, R., et al. Myosteatosis in the context of skeletal muscle function deficit: an interdisciplinary workshop at the National Institute on Aging. Frontiers in Physiology. 11, 963(2020).
  2. Miljkovic, I., et al.

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