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方法文章

利用离子淌度-质谱法研究镍(II)和锌(II)三元配合物的热化学性质

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DOI：

10.3791/63722

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2022年6月8日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Texas A&M University-Commerce, 2Laboratoire de Chimie Théorique, Sorbonne Université

本文内容

摘要

本文介绍了一种实验方案，该方案结合电喷雾-离子淌度-质谱法、半经验量子计算以及能量分辨阈值碰撞诱导解离技术，用于测量相关三元金属配合物解离反应的相对热化学性质。

摘要

本文介绍了一种实验方案，利用电喷雾-离子淌度-质谱法（ES-IM-MS）和能量分辨的阈值碰撞诱导解离（TCID）技术，测定带负电荷的[amb+M(II)+NTA]-三元配合物解离为两个产物通道的热化学性质：[amb+M(II)] + NTA 或 [NTA+M(II)]- + amb，其中 M = Zn 或 Ni，NTA 为氮川三乙酸。这些配合物包含一种替代性金属结合（amb）七肽，其一级结构为乙酰基-His1-Cys2-Gly3-Pro4-Tyr5-His6-Cys7 或乙酰基-Asp1-Cys2-Gly3-Pro4-Tyr5-His6-Cys7，其中氨基酸的 Aa1,2,6,7 位点为潜在的金属结合位点。通过将量子化学计算（目前采用 PM6 半经验哈密顿量）所得的三元配合物及其产物的电子能量和碰撞截面（CCS）与 ES-IM-MS 实测值进行比较，筛选出几何优化的稳定态结构。基于 PM6 频率计算获得的分子参数，采用竞争性 TCID 方法模拟两个产物通道的能量依赖性强度，从而确定与 0 K 解离焓（ΔH0）相关的反应阈值能量。利用 PM6 计算得到的转动和振动频率，通过统计力学方法进行热效应和熵校正，进一步获得 298 K 下的解离焓（ΔH298）。这些方法描述了一套 EI-IM-MS 操作流程，可用于测定多种三元金属离子配合物的热化学参数及平衡常数。

引言

本研究描述了一种利用市售离子淌度-质谱仪的新技术，可用于测定替代金属结合（amb）三元金属配合物[amb+M(II)+NTA]解离的相对热化学参数，其中M为Zn或Ni，NTA为氮川三乙酸图1）。这些反应模拟了在固定化金属亲和层析（IMAC）过程中，与NTA固定化金属结合的amb标签重组蛋白的解离。1,2以amb七肽标签为例，本方法使用了amb的标签 A 和 H (图2）（选自先前的研究3,4,5,6,7,8,9,10,11,12) 具有 Zn(II) 和 Ni(II) 结合特性，因此可作为纯化标签具有潜在应用价值。然而，所描述的方法可用于评估任何有机金属体系中的热化学能。这些 amb 肽在氨基酸序列中具有金属结合位点1- Aa2 和 Aa6- Aa7 位置 与NTA的羧酸盐和胺基位点竞争的氨基酸。三个中心的amb氨基酸提供了间隔（Gly3），两个臂的铰链（Pro4）以及长距离的π-金属阳离子相互作用（Tyr5).

[amb+M(II)+NTA]- 配合物的整体 1− 电荷态由其潜在结合位点的质子化状态决定。由于存在具有 2+ 氧化态的 Ni(II) 或 Zn(II)，必须共有三个去质子化的负电荷位点。对 [amb+M(II)+NTA]- 配合物的分子模拟预测，这些位点包括来自 NTA 的两个质子和来自 amb 的一个质子（即 [amb-H+M(II)+NTA-2H]-）。产物通道包含一种离子物种和一种中性物种（即 [NTA-3H+M(II)]- + amb 或 [amb-3H+M(II)]- + NTA）。在文稿中，"-3H" 未包含在配合物的名称中，但读者应知晓 -3H 是隐含存在的。仪器测量两种离子质荷比（m/z）物种的相对强度。ES-IM-MS 分析的一个重要特征是，它允许研究特定 m/z 物种的反应性，本文及此前关于 amb 的研究均利用了这一特性3,4,5,6,7,8,9,10,11,12。

利用碰撞诱导解离法获取大分子复合物的热化学数据 是一个备受关注的重要课题13,14. 动力学方法等技术不适用于在能量范围内对数据进行拟合，也无法考虑多碰撞环境15,16,17,18在此，采用由 Armentrout、Ervin 和 Rodgers 利用导向离子束串联质谱法开发的阈值碰撞诱导解离（TCID）方法19 到一种利用行波离子导向技术的新型ES-IM-MS仪器平台。TCID方法可用于分析三元复合物解离为两个产物通道的相对热化学性质，并包含一个阈值定律，用于描述反应物（本研究中的三元复合物）的平动能与惰性靶气（本实验中为氩气）之间碰撞能量的传递。该方法包含对反应物内能分布的积分20反应物与靶气体之间的平动能分布21，以及总角动量分布22,23包含了解离概率以及针对因产物观测时间窗口有限而导致的动力学偏移所进行的统计学 Rice-Ramsperger-Kassel-Marcus (RRKM) 修正24对于两个独立的产物通道，竞争性TCID方法能够同时拟合两个相互竞争的产物通道。该复合物通过一个轨道过渡态解离，该过渡态具有产物的性质，但由锁定的偶极子维系在一起。25TCID 方法已整合至 CRUNCH 程序中26，此处描述了用户界面的操作，用于评估三元配合物[amb+M(II)+NTA]两个解离通道的热化学性质- 复合物。CRUNCH 程序可向开发者申请获取26.

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方案

注意：图1 展示了本实验方案的总体流程。

1. 试剂的制备

  1. 购买冻干的 amb 肽（>98% 纯度），并将其保存在 −80 °C 冰箱中。
  2. 购买纯度大于>99% 的六水合硝酸锌和六水合硝酸镍。
    警告：六水合硝酸镍对环境和健康具有危害性。
  3. 购买次氮基三乙酸、聚-DL-丙氨酸聚合物、超纯/痕量金属级乙酸铵、氢氧化铵、冰醋酸以及 HPLC 级乙腈。

2. 储备液的配制

  1. 肽 amb 储备液
    1. 称取 10–20 mg 冻干肽（有效数字不少于三位），置于 1.7 mL 聚丙烯微量离心管中，配制成浓度为 12.5 mM 的水溶液。
    2. 向微量离心管中加入适量去离子水（>17.8 MΩ cm），盖紧管盖，充分混匀（至少颠倒混合 20 次）。
    3. 将 12.5 mM amb 溶液分装为每份 50 µL 的等分试样，转移至标记好的 1.7 mL 微量离心管中。将分装后的储备液于 −80 °C 保存。
  2. 金属离子储备液
    1. 称取 10–30 mg 金属硝酸盐六水合物（有效数字不少于三位），置于 1.7 mL 聚丙烯微量离心管中，配制成浓度为 12.5 mM 的水溶液（Zn(II) 和 Ni(II)）。
    2. 向微量离心管中加入适量去离子水，盖紧管盖，充分混匀（至少颠倒混合 20 次）。将 50 µL 等分试样的储备液于 −80 °C 保存。
  3. NTA 离子储备液
    1. 称取 10–30 mg NTA（有效数字不少于三位），置于 1.7 mL 聚丙烯微量离心管中，配制成水溶液。
    2. 向微量离心管中的 NTA 加入适量去离子水，使终浓度为 12.5 mM。盖紧管盖，充分混匀（至少颠倒混合 20 次）。将 50 µL 等分试样的储备液于 −80 °C 保存。
  4. 乙酸铵储备液：称取 30.8 mg 乙酸铵，溶于 40 mL 去离子水中，配制成 10 mM 溶液。用 1 mM 氢氧化铵将乙酸铵溶液的 pH 调至 7.7。
  5. 聚-DL-丙氨酸储备液：将 1.0 mg 聚-DL-丙氨酸（PA）溶于去离子水中，定容至 1 mL，配制成 1,000 ppm 的 PA 储备液。充分混匀。分装为每份 50 µL 的等分试样，分别装入标记好的微量离心管中。将 1,000 ppm 储备液于 −80 °C 保存。

3. 电喷雾-离子迁移率-质谱法（ES-IM-MS）碰撞诱导解离（CID）分析

  1. 通过注入 500 µL 的 0.1 M 冰醋酸，随后注入 500 µL 的 0.1 M 氨水，最后注入 500 µL pH 7.7 的乙酸铵溶液，清洗电喷雾（ES）进样管路和金属毛细管，以准备仪器。
  2. 将 12.5 mM 的 amb 储备液恢复至室温以使其液化。使用去离子水连续稀释两次，配制成终浓度为 0.125 mM 的 amb 溶液。每次稀释后均需充分混匀。
  3. 将 12.5 mM 的金属离子储备液恢复至室温以使其液化。使用去离子水连续稀释两次，配制成终浓度为 0.125 mM 的金属离子溶液。每次稀释后均需充分混匀。
  4. 将 12.5 mM 的 NTA 储备液液化。使用去离子水连续稀释两次，配制成终浓度为 0.125 mM 的 NTA 溶液。每次稀释后均需充分混匀。
  5. 配制 2 mL 的三元复合物样品：将 800 μL 的 0.125 mM NTA 溶液和 400 μL 的 0.125 mM 金属离子溶液加入一个 2 mL 微量离心管中，充分混匀（至少倒置混合 20 次）。然后加入 400 μL 乙酸铵溶液（pH 7.7）和 400 μL 的 0.125 mM amb 溶液，再次充分混匀（至少倒置混合 20 次），并在室温下静置平衡 10 分钟。
  6. 将 2 mL 样品装入 2.5 mL 平头注射器中，使用仪器的注射泵以 10 μL/min 的流速将样品注入仪器的电喷雾（ES）源中。
  7. 将仪器设置为负离子模式下的离子淌度-质谱（IM-MS）模式。实验采用仪器的典型操作条件27，具体如下：
    1. 以 10 µL/min 的流速将样品注入电势为 −2 kV 的电喷雾毛细管中，氮气去溶剂化气流速为 500 L/h。将电喷雾源温度和去溶剂化温度分别设置为 130 °C 和 263 °C。采样锥和提取锥电压分别设为 25 V 和 3 V。
    2. 在碰撞诱导解离（CID）实验中，使用四极杆质谱分析器选择 [amb+M(II)+NTA]- 三元复合物的同位素分布，依据单一同位素峰的 m/z 值进行选择，分辨率设置为低质量端 4.5，高质量端 16.5。
      注：[amb+M(II)+NTA]- 离子将进入后续的三个行波（T-wave）离子导向器。
    3. 确保捕获段 T-wave 的氩气流速为 3 mL/min，压力为 2.83 × 10-2 mbar。将捕获区的碰撞能量（CE）设为 5 V，以避免三元复合物发生解离。让捕获区富集三元复合物离子后，通过 14 V 的捕获直流偏压将其释放（释放时间为 200 μs）至离子淌度（IM）T-wave 离子导向器，以最小化复合物在 IM 入口处的解离。
    4. 使用 20 mL/min 的超纯 N2 缓冲气体，确保 IM 离子导向器的压力为 0.507 mbar。在 IM 离子导向器的每次扫描起始和结束时，将 T-wave 的波高从 7 V 线性增加至 30 V，波速从 290 m/s 增加至 801 m/s。
    5. 转移段 T-wave 的氩气流速和压力设置与捕获段 T-wave 相同。转移段 T-wave 用于通过调节转移碰撞能量（transfer CE）实现三元 [amb+M(II)+NTA]- 复合物的碰撞诱导解离。
  8. 使用传输四极杆在分辨模式下选择带负电荷的 [amb+M(II)+NTA]- 复合物的 m/z 同位素分布。
    1. 打开质谱程序并选择 谱图（Spectrum），以识别 m/z 同位素分布。选择 工具（Tools）> 同位素模型（Isotope model）。在弹出窗口中输入该复合物的分子式，勾选 显示带电离子（Show Charged Ion） 选项，输入电荷数 -1，然后点击 确定（OK）。
    2. 在显示的复合物同位素分布中，记录最低质量的峰。在仪器软件中选择 设置（Setup）> 四极杆轮廓（Quad Profile）。在打开的窗口中选择 手动固定（Manual Fixed），输入最低同位素峰的质量值，点击 更新（Update），然后点击 关闭（Close）。
    3. 再次选择 设置（Setup），然后点击 分辨四极杆（Resolving Quad）。使用 5 分钟运行时间和 2 秒扫描时间，逐步采集在不同转移碰撞能量范围下的负离子电喷雾-离子淌度-质谱（ES-IM-MS）谱图。
      注：可初步在 26–60 V 范围内以 2 V 为间隔测试转移能量。最终选定的转移碰撞能量范围应确保在最低能量下三元复合物无解离，而在最高能量下完全解离为产物。为获得高质量的统计分析结果，每种 amb 三元复合物的 ES-IM-MS 分析应由不同人员在不同日期至少重复 3 次，以计算均值和标准差。

4. 电喷雾离子迁移谱-质谱（ES-IM-MS）碰撞截面（CCS）分析

  1. 用 500 µL 的 0.1 M 冰醋酸清洗电喷雾（ES）进样管路和金属毛细管，随后用 500 µL 的 0.1 M 氢氧化铵清洗，最后用 500 µL pH 7.7 的醋酸铵溶液清洗。
  2. 将 1,000 ppm 的 PA 储备溶液恢复至室温，并进行两步连续稀释：先用去离子水稀释至 100 ppm PA，再用去离子水与 HPLC 级乙腈按 1:1 比例混合稀释，得到 10 ppm 的 PA 溶液。
  3. 在仪器操作条件下，采集 10 ppm PA 样品的负离子离子淌度-质谱（IM-MS）谱图，持续 10 分钟。
    注意：进样流速和电喷雾（ES）离子源条件与 CID 实验（步骤 3）相同。在测量碰撞截面（CCS）时，四极杆质量分析器设置为非分辨模式，使所有离子通过后续的三个 T-波离子导管。捕获（trap）T-波和离子淌度（IM）T-波离子导管的操作条件与 CID 实验相同。传输 T-波池的碰撞能量设为 4 V，以确保离子无解离地通过。
  4. 按照步骤 3.2–3.6 所述方法制备每种三元复合物。
  5. 采集每种三元复合物的 IM-MS 谱图，持续 5 分钟。
    注意：使用与步骤 4.3 相同的仪器条件。
  6. 采集 10 ppm PA 样品的负离子 IM-MS 谱图，持续 10 分钟。
    注意：PA 校准物在分析 amb 三元复合物之前和之后采集的到达时间均值将用于 CCS 的测定。

5. 电喷雾离子迁移质谱 CID 数据分析

  1. 通过将三元复合物及其产物的理论 m/z 同位素分布模式与实验测得的离子淌度-质谱（IM-MS）谱图进行比对，确定各物种的身份。
    1. 打开质谱分析软件，选择 色谱图（Chromatogram） 以打开新窗口。
    2. 在 色谱图（Chromatogram） 窗口中，点击 文件（File）> 打开（Open），查找并打开所需的 IM-MS 数据文件。
    3. 按住鼠标右键，在色谱图上拖动并释放，质谱图将在单独的 谱图（Spectrum） 窗口中显示。
    4. 在显示谱图的新窗口中，选择 工具（Tools）> 同位素模型（Isotope Model），将弹出一个小窗口。输入 amb 物种的分子式，勾选 显示带电离子（Show Charged Ion） 选项，并输入所需的电荷态，然后点击 确定（OK）。
    5. 为区分 IM-MS 谱图中的所有物种，重复此过程并在 谱图（Spectrum） 窗口中记录各物种的 m/z 同位素分布范围。
  2. 针对三元 amb 复合物及其产物，利用其 m/z 同位素分布范围识别各物种，并提取其到达时间分布（ATD）。
    1. 打开离子淌度分离软件，选择 文件（File）> 打开（Open），查找并打开数据文件。
    2. 用鼠标左键点击并拖动，放大三元复合物 [amb+M(II)+NTA]- 的 m/z 同位素分布范围。
    3. 使用 选择（Selection） 工具，左键点击并拖动，选择在步骤 5.1 中确定的 [amb+M(II)+NTA]- 的特定同位素范围，然后点击 接受当前选择（Accept Current Selection） 按钮。
    4. 为消除偶然的 m/z 物种或背景信号，使用 选择（Selection） 工具选择与三元复合物相关的到达时间分布（ATD），然后点击 接受当前选择（Accept Current Selection） 按钮。
    5. 为将 ATD 文件导出至质谱分析软件，进入 文件（File）> 导出（Export），然后点击 保留漂移时间（Retain Drift Time）。可根据需要重命名文件，并将其保存至适当文件夹中。
  3. 通过对提取的 ATD 曲线下面积进行积分，确定各物种的相对强度。
    1. 在 色谱图（Chromatogram） 窗口中，打开从离子淌度分离软件导出并保存的文件。选择 处理（Process），然后选择 积分（Integrate）。设置峰间振幅为 20，点击 确定（OK）。
    2. 记录 色谱图（Chromatogram） 窗口中显示的积分面积。对两个产物 [NTA+M(II)]- 和 [amb+M(II)]- 重复执行步骤 5.2.2–5.2.5。
    3. 对每个记录的传输碰撞能量重复执行步骤 5.2.1–5.3.2。
  4. 利用在每个传输碰撞能量点处获得的三元复合物 [amb+M(II)+NTA]- 及其两个产物 [NTA+M(II)]- 和 [amb+M(II)]- 的积分 ATD 面积，将其归一化至相对百分比尺度。
    1. 创建一个电子表格，输入三元复合物及其产物的身份信息，以及在每个碰撞能量下的积分 ATD 值。
    2. 对每个碰撞能量，使用 [amb+M(II)+NTA]-、[NTA+M(II)]- 和 [amb+M(II)]- 的积分 ATD 总和，将各自的 ATD 值归一化为相对百分比尺度。
    3. 根据重复的 TCID 测量结果，计算每个数据点的平均值和标准偏差。将实验室坐标系下的传输碰撞能量（Elab）转换为中心质心碰撞能量（Ecm），公式如下：使用氩气（mAr）碰撞气体和三元复合物（mcomplex）的平均质量，Ecm = Elab (mAr)/(mAr + mcomplex)。
      注：Ecm 表示与氩气碰撞时可用于三元复合物解离的最大能量。
    4. 绘制 [amb+M(II)+NTA]-、[NTA+M(II)]- 和 [amb+M(II)]- 各自百分比强度的均值与标准偏差，以相对强度（%）对中心质心碰撞能量（eV）作图，展示各物种相对强度随碰撞能量变化的趋势。

6. 分析平均到达时间以确定碰撞截面（CCS）

  1. 打开离子淌度分离软件，并载入在传输碰撞能量设定为 4 V 时采集的 10 ppm PA 样品的 IM-MS 谱图文件。提取每种单电荷负离子 PA 物种的到达时间分布（ATD），并使用选项将其文件导出至质谱软件 保留漂移时间 （参见步骤 5.2.5）。对第二个 PA 校准文件重复上述操作。
  2. 打开离子淌度分离软件。使用 文件 > 开放 打开一个包含在PA校准物之间记录的amb三级复合物的IM-MS谱图的文件。提取每个三级复合物的ATD，并将其文件导出至质谱软件中，使用 保留漂移时间 选项（参见步骤 5.2.5）。
  3. 采用横截面校准方法28 用于计算三元复合物及其产物的碰撞截面（CCS）。
    1. 在电子表格中，计算校正后的 CCS（Ω）c针对每种单个带负电荷的PA物种，根据其碰撞截面（CCS，Ω）29,30 在氦气缓冲气体中测量31 使用 公式 1，其中 z 三元复合物的电荷 ec = 1.602 × 10−19 C mN2 = 氮的质量（u），以及 m离子 = 三元复合物的质量28.
       Cyclotron frequency equation; formula for ion trajectory analysis; physics study diagram.   (1)
    2. 找到漂移时间（tDPA 标准品及三元复合物的平均到达时间（tA）从相应ATD曲线的峰值中确定，然后应用 公式 2，其中 c = 检测器延迟系数（1.41 ms；请检查仪器，此值可能因仪器不同而有所差异）以及 m/z = PA 标准品或 amb 三元复合物的质荷比
      tD =tA Equation for ion mobility; mass-to-charge ratio (m/z) formula fragement; scientific calculation.   (2)
    3. 通过绘制PA校准品的图来创建图表 tD 与 Ωc。然后，使用 公式 3，使用最小二乘法回归拟合数据以确定常数 A' 和 B，其中 A' 校正仪器中的电场、温度和压力 B 校正T波IM设备的非线性行为。
      Ωc = A' tDB   (3)
    4. 利用 A' 和 B 常数和 tD 三元配合物的amb值，计算其Ωc 使用 公式 3 及其Ω使用 公式 1该方法估算的CCS值绝对误差约为2%29.

7. 计算方法

  1. 使用结构建模与计算软件中实现的半经验 PM632 方法33，定位在 CID 实验中观察到的 [amb+M(II)+NTA]- 三元配合物以及离子与中性产物对 [amb+M(II)]- + NTA 和 [NTA+M(II)]- + amb 的几何构型优化构象体。有关如何建立和提交计算的具体操作，请参见 补充文件 中的计算可视化工具使用说明。
    注意：对于当前体系，PM6 方法能够正确再现实验数据，但总体而言，任何可靠且计算上可行的量子化学方法均可使用。
  2. 对多个不同的起始结构进行几何构型优化和频率计算，以探索不同的构象、质子化状态及潜在结合位点。记录所找到的每个三元配合物及其产物的各驻点的电子能加零点能。
    注意：几何优化的起始结构应考察不同可能的结合位点组合和构象排列。起始结构基于先前确定的 B3LYP34 [amb+M(II)]- 构象体3,4,6。对于 [amb+M(II)+NTA]-，将 NTA 置于与 amb 在 Aa1-Aa2-Aa6-Aa7 位点及羧基末端的取代位点相竞争的位置，针对 Zn(II) 的单重态或 Ni(II) 的三重态自旋状态进行计算。
  3. 使用能够基于这些量子化学计算所得原子坐标，在氦缓冲气体中精确计算碰撞截面（CCSHe）的程序35。
    注意：已有用于从量子化学计算确定的肽结构精确计算 CCSHe 的程序，包括 MobCal36 和 HPCCS37,38。
  4. 选择具有最低能量且其 Lennard-Jones 模型计算的 CCSHe 与离子淌度质谱（IM-MS）实测 CCSHe 相符的构象体，用于确定三元配合物及解离产物的结构，以纳入下文的 CRUNCH 建模分析中。

8. CRUNCH 建模

  1. 在讨论部分所述的格式（“CRUNCH 输入文本文件格式”）下创建一个文本文件。
    注意：该文件包含以下列：（−1）质心碰撞能量Ecm)，(1) [amb+M(II)] 相对强度的平均值- 产物，(2) [amb+M(II)] 的标准偏差- 强度，(3) [NTA+M(II)] 的相对强度均值- 产物，以及 (4) [NTA+M(II)] 的标准偏差- 强度
  2. 建模 E厘米依赖于两个反应通道的强度 [amb+M(II)+NTA]- 至 [amb+M(II)]- NTA 及 [amb+M(II)+NTA]- 至 [NTA+M(II)]- + 使用 CRUNCH 程序中的 TCID 技术进行 amb 检测。
    注意：对三元复合物以及两个离子和中性产物通道，使用 PM6 计算得到的振动和转动频率。使用三元复合物、氩气碰撞气以及离子和中性产物的平均质量。极化率（Å）的取值采用 PM6 计算结果或 NIST 数据库中的数值3）和中性产物的偶极矩（德拜）。
    1. 从 CRUNCH 主菜单中，打开包含的文本文件（.GB5） E厘米-依赖性产物相对强度。回复 无 到 读取参数.
    2. 从 CRUNCH 主菜单中选择 建模 > 设置所有参数从反应模型选项中，选择默认项 阈值碰撞诱导解离 选项后跟 RRKM结合能量转移分布的积分 三元复合物20，输入 2 用于 独立产品通道建模，并选择 计算横截面。进入 无 到 是否有任意两个产物通道具有相同的离子质量？
    3. 对于 产品频道 #1，进入层析柱 [1] 对于 实验数据 [amb+M(II)]的- 产物，柱层析2] 用于 标准差 [amb+M(II)]的- 产品，柱层析5] 对于 未卷曲模型的横截面，以及柱 [6] 用于 复杂模型横截面。进入 0 拟合残差。
      注意：这些列编号对应于第8.1步中输入文件的列，具体格式参见讨论部分（“CRUNCH输入文本文件格式”）。
    4. 对于 产品频道 # 2，上样至层析柱[3] 用于 实验数据 [NTA+M(II)]的- 产品，柱层析4] 用于 标准差 [NTA+M(II)]的- 产品，柱层析7]用于 未卷曲模型的横截面，以及柱 [8] 用于 复杂模型横截面. 输入 0 拟合残差。
    5. 对于 一种简化的模型类型，选择 0 K 交叉截面（包含动力学位移），其中包括由于从碰撞池到飞行时间检测器存在50微秒时间窗口而对动力学偏移进行的统计RRKM校正18.
    6. 对于 卷积选项，选择 蒂尔南双重积分，其中包括三元复合离子与氩气碰撞气体之间平动能量分布的卷积21.
    7. 对于 数值积分方法，选择 采用预存截面的高斯求积，后跟积分点数量 = 32，标准差的个数 = 3.0，第二个积分的标准差数量 = 3.0.
    8. 三元复合离子的质量（u）从.GB5文本文件中自动读取，随后读取碰撞气体的质量（39.948 （用于氩气）；使用默认设置 0.20 eV 离子束的半高宽（FWHM） 298.15 K 用于气体温度。该程序会自动读取 最低值 和 最大值 来自.GB5文本文件的质心碰撞能量；使用默认值 最小能量增量.
    9. 使用默认值 缩放因子 Sig0, 无 用于 允许对各个产品通道进行缩放，默认值为 N 和 M. 对于 g(i) 计算方法，选择 对转振态密度进行积分，其中包括内能分布20 三元配合物 [amb+M(II)+NTA]-.
    10. 在输入分子参数的选项中，输入 G 读取结构建模文件33 与三元复合物的PM6振动和转动频率一致。 是 对问题 其中一种反应物是原子吗？ 写出建模文件的位置和名称。
      注意：输入振动和转动频率的其他选项包括 读取参数文件，该程序将从文本文件中读取参数，或 编辑/输入常数，可手动输入每个参数。
    11. 使用 NIST 推荐的 PM6 缩放因子（1.062）对频率进行缩放。有关缩放的更多细节，请参见讨论部分（“振动频率的缩放因子”）。三元复合物中的原子数目从文件中读取。回复 无 到 该分子是线性的吗？ 输入 反应物的描述 （例如，H+Zn+NTA- + Ar）。
    12. 输入 1 对于 离子电荷 和 1.664 对于 氩气的极化率39。该 离子质量 和 目标物质量 分别为三元复合物和氩气的参数，将自动从.GB5文本文件中读取。输入 0 用于 谐波振动.
      注意：以下选项用于为高或低振动频率选择不同的缩放因子。输入 1.062 用于 高频 和 0.0 用于 低频 （参见讨论：振动频率的缩放因子）。显示的是经过缩放的频率。选择 0 选择 无变化.
    13. 按 Enter 键以阅读 1-D 和 二维转动常数 来自结构建模文件33 在步骤 8.2.10 中输入。选择默认值 0 对于 受阻转子处理 和 1 用于 分子对称性.
      注意：程序将显示输入的数据；按 Enter 键继续 无变化.
    14. 选择默认设置 300 K 用于 反应物温度选择 整合 方法步骤 态密度阵列的降低选择 是 至 截断能量分布. 进入 40000 cm−1 用于 最大分布能量, 2.0 cm−1 用于 bin 大小，以及 32 用于 能量分布中的点数.
      注意：按两次回车键并检查 截短的32点阵列 人口数量 >0.9. 如果 >0.9，输入 无 到 改变分组区间或凝聚因子。如果 <0.9，输入 是 并改变 最大分配能量 和/或 bin 大小.
    15. 对于 TCID/RRKM 模型的参数，选择 是 用于 改变，输入 0 用于 固定时间，以及 0.000050 s 对于 检测窗口的上限对于所使用的仪器，这是指离子从传输碰撞池到达飞行时间检测器所需的时间，该时间通过以下方式计算得出 公式 2.
    16. 对于 活化分子，输入 C 到 复制数值 从已输入的反应物中。输入 −1 用于源过渡态（TS）， 0 用于目标TS，以及 P 继续进行。
    17. 对于 产物通道 1，选择 1 用于 单个过渡态 来自 解离通道选项 和 0 用于 无 对于 连续解离. 对于 过渡态类型，选择 1 用于 轨道运动.
    18. 选择 G 读取包含 [amb+M(II)] 的 PM6 转动和振动参数的建模程序文件- + NTA 产品。输入 无 用于 PSL TS 物种之一是原子吗？ 输入 [amb+M(II)] 的位置和名称- 文件。使用 1.062 用于 比例频率，输入原子数量后按 Enter 键 无 用于 分子是线性的吗？
    19. 输入包含NTA产物振动和转动频率的建模文件的位置和名称。使用 1.062 用于 比例频率，按 Enter 键以继续 原子数目，然后输入 无 因为是 分子是线性的吗？ 输入该描述 轨道TS，例如 H+Zn-...NTA。
    20. 进入 1 用于 电荷 [amb+M(II)]- 离子，然后输入 极化率 (16.12 Å3）以及 偶极矩 (4.6183 DebyeNTA 的 )。选择 0 K 用于 转动温度 和 锁定偶极 用于处理轨道过渡态。输入平均值 肿块 (u) [amb+M(II)]的- 离子和NTA
    21. 输入 0 用于 谐波振动. 进入 1.062 用于 高频 和 0.0 用于 低频。有关频率缩放的更多细节，请参见讨论部分；已显示缩放后的频率。选择 0 选择 无变化. 按 Enter 键以阅读 1-D 和 二维转动常数 从建模文件中选择 0 用于 受阻转子, 1 用于 分子对称性，以及 1 用于 反应简并度. 输入 无变化 选项
    22. 对于 产品通道 2，选择 1 用于 单过渡态, 0 用于 无 对于 连续解离，以及 1 用于 轨道运动 对于 过渡态类型.
    23. 选择 G 用于读取包含[NTA+M(II)]的PM6转动和振动参数的建模文件- 以及amb产品。进入 无 用于 PSL TS 物种之一是原子吗？ 写出 [NTA+M(II)] 的位置和名称- 建模文件
    24. 使用 1.062 用于 比例频率，按 Enter 键读取原子数量，然后输入 N 用于 该分子是线性的吗？ 编写 amb 建模文件的位置和名称。使用 1.062 用于 比例频率，输入原子数量后按 Enter 键 N 是用于 分子是线性的吗？
    25. 输入描述内容 轨道TS （例如，NTA+Zn-…H）。输入 1.0 用于 电荷 [NTA+M(II)]的- 离子，进入 极化率 (Å3）以及 偶极矩 （德拜）环境的 0.0 K 对于 转动温度 和 锁定偶极 用于处理轨道过渡态。输入平均值 肿块 (u) [NTA+M(II)]的- 以及amb产品。
      注意：输出文件包含 amb 的极化率和偶极矩。极化率的单位为 Bohr3 并需要转换为 Å 单位3.
    26. 进入 0 用于 谐波振动. 进入 1.062 用于 高频 和 0 用于 低频。有关频率缩放的更多细节，请参见讨论部分。此处显示的是已缩放的频率。选择 0 表示不更改。按 Enter 键以读取 1-D 和 二维转动常数 从建模文件中选择 0 用于 受阻转子, 1 用于 分子对称性，以及 1 用于 反应简并度. 进入 无变化.
    27. 至 处理非活动的二维旋转，选择默认选项 统计角动量分布 和 对 J 分布积分 P(E,J). 使用默认值 32 积分点数量。
      注意：这些选项用于选择对总角动量 J 能级进行积分的方法16, 17输出结果可使研究人员核对所有输入是否正确。
    28. 选择 相对于的活化能 的 活化分子 选项并输入 相对能量 （电子伏特，eV）用于 产品通道 1 接近于[amb+M(II)]的相对强度随质心碰撞能量变化曲线中观察到的阈值能量- 产物（图4).
    29. 对于 产品通道 2，输入 相对能量 （eV），该值接近[NTA+M(II)]的强度随质心碰撞能量变化曲线中观察到的阈值能量- 产物。要计算 状态数量 对于每个产品通道，使用一个指定大小的区间 2.0。按 Enter 键，然后 无 继续。
    30. 来自 模型 菜单，选择 优化参数以拟合数据，然后输入 最低能量 和 最大能量 分别用于开始和结束数据拟合。
      注意：使用包含两个通道阈值的小能量范围。有关更多细节，请参见讨论部分：将选定的TCID模型拟合到实验数据时的能量范围。
    31. 选择 -1 用于称重模式 实验标准偏差根据数据，选择一个 最小可接受标准差 通常为 0.01 至 0.001。选择 无 用于 优化单个通道的缩放比例 和 0 对于 迭代次数.
      注意：使用标准差的一种替代方法是 统计学的 选项
    32. 使用默认值 E0 收敛极限 并选择 无 到 保持任何参数为当前值. 进入 0.5 和 2.0 eV 对于 避免优化失败的下限和上限 和 选择中心有限差分 对于 导数评估方法. 使用默认值 数值精度 并选择 无 用于 改变导数步长.
      注意：另一种方法是选择 是 到 保持当前参数值不变该方法在讨论部分“参数优化”中有进一步描述。
    33. 从 优化 菜单，选择 开始优化CRUNCH 程序将根据实验数据对选定的 TCID 模型进行优化。
      注意：如果优化未能找到满意的拟合结果，从 变化 菜单，尝试更改 能量范围 仅覆盖从阈值开始上升的最初几个强度峰。当找到合理的拟合结果后，扩大能量范围并重新进行拟合。其他有助于对数据进行拟合的选项包括选择 保持当前参数值不变 在 参数优化 并更改加权选项 重量参见本讨论部分中关于这些选项的说明。
    34. 当模型拟合到数据后，连续按 Enter 键直至 模型 菜单出现。如果仅使用 TCID 模型拟合实验数据的部分能量范围，请选择 计算并卷积模型 以将模型拟合扩展至所有实验碰撞能量。
    35. 在 模型 菜单，选择 T 时的 ΔH 与 S.
      注意：未简化的CRUNCH模型将0 K阈值能量与0 K焓变（ΔH0三元复合物解离为两个独立产物通道的解离常数（表 2). 298 K 时的焓变（ΔH298）和吉布斯自由能（ΔG298解离的热力学和熵校正参数也通过反应物和产物的PM6旋转和振动频率，结合统计力学方法推导得出。

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结果

[amb+M(II)+NTA]- 三元复合物 A 和 H 在竞争性碰撞诱导解离中生成 [amb+M(II)]- + NTA 或 [NTA+M(II)]- + amb 的过程如图3所示。其中 amb 表示 A 或 H，M 为 Zn 或 Ni。[A+Zn(II)+NTA]- 三元复合物（图3A）产生 [A+Zn(II)]- 的明显阈值约为 0.7 eV 碰撞能量（CE），产生 [NTA+Zn(II)]- 的阈值约为 0.9 eV。[A+Ni(II)+NTA]- 复合物（图3B）解离生成 [NTA+Ni(II)]- 和 [A+Ni(II)]-

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讨论

关键步骤
电喷雾-离子淌度-质谱阈值碰撞诱导解离（TCID）分析。 TCID 使用传输T波离子淌度池，在氩气存在下作为碰撞池。在解离之前，前体离子在通过离子淌度（IM）池时，通过与氮气的低能碰撞实现热化。这使得获得的能量分辨TCID结果比使用捕集池作为碰撞池时更具可重复性6,40。在解离前对[amb+M(II)+NTA]-进行热化，还使得可以利用298 K的温度来表征该三元复合物的可用内能。在传输池中发生解离，意味着三元复合物及其产物离子以相同的平均到达时间抵达检测器，这有助于识别仅在传输池中发生的三元复合物解离事件。其他可能发生解离的区域包括电喷雾源（采样锥电压保持在25 V以避免此情况）或IM池入口处。在这些区域中，三元复合物解离产生的产物离子由于在IM池中与三元复合物分离，其漂移时间与在传输池中产生的产物离子不同，因此这些产物离子被排除在分析之外。在本方案中，仅使用前体离子和产物离子的积分到达时间分布曲线完全对齐的...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本材料基于美国国家科学基金会（项目编号1764436）、NSF REU项目（CHE-1659852）、NSF仪器支持（MRI-0821247）、物理与天文学成功奖学金（PASS）NSF项目（1643567）、Welch基金会（T-0014）以及美国能源部（TX-W-20090427-0004-50）和L3通信公司提供的计算资源所支持的工作。作者感谢内华达大学里诺分校的Kent M. Ervin和犹他大学的Peter B. Armentrout分享CRUNCH程序，并在PBA拟合方面提供了建议。作者感谢加利福尼亚大学圣塔芭芭拉分校Michael T. Bower课题组分享Sigma程序。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙腈 HPLC 级Fisher Scientific (www.Fishersci.com)A998SK-4
替代性金属结合 (amb) 肽PepmicCo (www.pepmic.com)设计的肽通过定制合成
乙酸铵（超纯级）VWR97061-014
氢氧化铵（痕量金属级）Fisher Scientific (www.Fishersci.com)A512-P500
Driftscope 2.1 软件程序Waters (www.waters.com)软件分析程序
Gaussian 09Gaussian电子结构模拟软件
GaussViewGaussian用于可视化计算的图形界面
冰乙酸（Optima 级）Fisher Scientific (www.Fishersci.com)A465-250
离子标度伦纳德-琼斯 (LJ) 方法Sigma加州大学圣塔芭芭拉分校 Michael T. Bowers’ 课题组
MassLynx 4.1Waters (www.waters.com)软件分析程序
微量离心管VWR87003-2941.7 mL，聚丙烯材质
微量离心管VWR87003-2982.0 mL，聚丙烯材质
六水合硝酸镍(II)（99%纯度）Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)A15540
聚-DL-丙氨酸Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)P9003-25MG
Waters Synapt G1 HDMSWaters (www.waters.com) 四极杆-离子迁移-飞行时间质谱仪
六水合硝酸锌(II)（99%+纯度）Alfa Aesar (www.alfa.com)12313

参考文献

  1. Kim, Y. -M., Chen, P. Ligand binding energy in [(bipy)Rh(PCH)]+ by collision-induced dissociation threshold measurements. International Journal of Mass Spectrometry. 202 (1-3), 1-3 (2000).
  2. Plattner, D. Electrospray mass spectrometry beyond analytical chemistry: Studies of organometallic catalysis in the gas phase. International Journal of Mass Spectrometry. 207 (3), 125-144 (2001).
  3. Narancic, S., Bach, A., Chen, P. Simple fitting of energy-resolved reactive cross sections in threshold collision-induced dissociation (T-CID) experiments. Journal of Physical Chemistry A. 111 (30), 7006-7013 (2007).
  4. Ervin, K., Armentrout, P. B. Systematic and random errors in ion affinities and activation entropies from the extended kinetic method. Journal of Mass Spectrometry. 39 (9), 1004-1015 (2004).
  5. Cooks, R. G., Wong, P. S. H. Kinetic method of making thermochemical determinations: Advances and applications. Accounts of Chemical Research. 31 (7), 379-386 (1998).
  6. Ervin, K. Microcanonical analysis of the kinetic method. The meaning of the "apparent entropy". Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 13 (5), 435-452 (2002).
  7. Amarasinghe, C., Jin, J. -P. The use of affinity tags to overcome obstacles in recombinant protein expression and purification. Protein & Peptide Letters. 22 (10), 885-892 (2015).
  8. Bornhorst, J. A., Falke, J. J. Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods in Enzymology. 326, 245-254 (2000).
  9. Yousef, E. N., Angel, L. A. Comparison of the pH-dependent formation of His and Cys heptapeptide complexes of nickel(II), copper(II), and zinc(II) as determined by ion mobility-mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 55 (3), 4489(2020).
  10. Lin, Y. -F., et al. Weak acid-base interactions of histidine and cysteine affect the charge states, tertiary structure, and Zn(II)-binding of heptapeptides. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 30, 2068-2081 (2019).
  11. Wagoner, S. M., et al. The multiple conformational charge states of zinc(II) coordination by 2His-2Cys oligopeptide investigated by ion mobility - mass spectrometry, density functional theory and theoretical collision cross sections. Journal of Mass Spectrometry. 51 (12), 1120-1129 (2016).
  12. Flores, A. A., et al. Formation of Co(II), Ni(II), Zn(II) complexes of alternative metal binding heptapeptides and nitrilotriacetic acid: Discovering new potential affinity tags. International Journal of Mass Spectrometry. 463, 116554(2021).
  13. Flores, A. A., et al. Thermochemical and conformational studies of Ni(II) and Zn(II) ternary complexes of alternative metal binding peptides with nitrilotriacetic acid. International Journal of Mass Spectrometry. 473, 116792(2022).
  14. Sesham, R., et al. The pH dependent Cu(II) and Zn(II) binding behavior of an analog methanobactin peptide. European Journal of Mass Spectrometry. 19 (6), 463-473 (2013).
  15. Choi, D., et al. Redox activity and multiple copper(I) coordination of 2His-2Cys oligopeptide. Journal of Mass Spectrometry. 50 (2), 316-325 (2015).
  16. Vytla, Y., Angel, L. A. Applying ion mobility-mass spectrometry techniques for explicitly identifying the products of Cu(II) reactions of 2His-2Cys motif peptides. Analytical Chemistry. 88 (22), 10925-10932 (2016).
  17. Yousef, E. N., et al. Ion mobility-mass spectrometry techniques for determining the structure and mechanisms of metal ion recognition and redox activity of metal binding oligopeptides. Journal of Visualized Experiments. (151), e60102(2019).
  18. Ilesanmi, A. B., Moore, T. C., Angel, L. A. pH dependent chelation study of Zn(II) and Ni(II) by a series of hexapeptides using electrospray ionization - Ion mobility - Mass spectrometry. International Journal of Mass Spectrometry. 455, 116369(2020).
  19. Armentrout, P. B., Ervin, K. M., Rodgers, M. T. Statistical rate theory and kinetic energy-resolved ion chemistry: Theory and applications. Journal of Physical Chemistry A. 112 (41), 10071-10085 (2008).
  20. Dalleska, N. F., Honma, K., Sunderlin, L. S., Armentrout, P. B. Solvation of transition metal ions by water. Sequential binding energies of M+(H2O)x (x = 1-4) for M = Ti to Cu determined by collision-induced dissociation. Journal of the American Chemical Society. 116 (8), 3519-3528 (1994).
  21. Ervin, K. M., Armentrout, P. B. Translational energy dependence of Ar + XY → ArX+ + Y (XY = H2,D2,HD) from thermal to 30 eV c.m. Journal of Chemical Physics. 83, 166-189 (1985).
  22. DeTuri, V. F., Ervin, K. M. Competitive threshold collision-induced dissociation: Gas-phase acidities and bond dissociation energies for a series of alcohols. Journal of Physical Chemistry A. 103 (35), 6911-6920 (1999).
  23. Iceman, C., Armentrout, P. B. Collision-induced dissociation and theoretical studies of K+ complexes with ammonia: a test of theory for potassium ions. International Journal of Mass Spectrometry. 222 (1-3), 329-349 (2003).
  24. Rodgers, M. T., Ervin, K. M., Armentrout, P. B. Statistical modeling of collision-induced dissociation thresholds. Journal of Chemical Physics. 106, 4499-4508 (1997).
  25. Rodgers, M. T., Armentrout, P. B. Statistical modeling of competitive threshold collision-induced dissociation. Journal of Chemical Physics. 109, 1787-1800 (1998).
  26. Armentrout, P. B., Ervin, K. M. CRUNCH, Fortran program, version 5.2002. , (2016).
  27. Pringle, S. D., et al. An investigation of the mobility separation of some peptide and protein ions using a new hybrid quadrupole/travelling wave IMS/oa-ToF instrument. International Journal of Mass Spectrometry. 261 (1), 1-12 (2007).
  28. Smith, D. P., et al. Deciphering drift time measurements from travelling wave ion mobility spectrometry-mass spectrometry studies. European Journal of Mass Spectrometry. 15 (2), 113-130 (2009).
  29. Forsythe, J. G., et al. Collision cross section calibrants for negative ion mode traveling wave ion mobility-mass spectrometry. Analyst. 140 (20), 6853-6861 (2015).
  30. Allen, S. J., Giles, K., Gilbert, T., Bush, M. F. Ion mobility mass spectrometry of peptide, protein, and protein complex ions using a radio-frequency confining drift cell. Analyst. 141 (3), 884-891 (2016).
  31. Salbo, R., et al. Traveling-wave ion mobility mass spectrometry of protein complexes: accurate calibrated collision cross-sections of human insulin oligomers. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 26 (10), 1181-1193 (2012).
  32. Stewart, J. J. P. Optimization of parameters for semiempirical methods V: Modification of NDDO approximations and application to 70 elements. Journal of Molecular Modeling. 13, 1173(2007).
  33. Frisch, M. J., et al. Gaussian 09, Revision C.01. Wallingford CT: Gaussian, Inc. , (2012).
  34. Becke, A. D. Density-functional thermochemistry. III. The role of exact exchange. Journal of Chemical Physics. 98, 5648-5652 (1993).
  35. Wyttenbach, T., von Helden, G., Batka, J. J., Carlat, D., Bowers, M. T. Effect of the long-range potential on ion mobility measurements. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 8, 275-282 (1997).
  36. Shvartsburg, A. A., Jarrold, M. F. An exact hard-spheres scattering model for the mobilities of polyatomic ions. Chemical Physics Letters. 261 (1-2), 86-91 (1996).
  37. Heerdt, G., Zanotto, L., Souza, P. C. T., Araujo, G., Skaf, M. S. Collision cross section calculations using HPCCS. Methods in Molecular Biology. 2084, 297-310 (2020).
  38. Zanotto, L., Heerdt, G., Souza, P. C. T., Araujo, G., Skaf, M. S. High performance collision cross section calculation-HPCCS. Journal of Computational Chemistry. 39 (21), 1675-1681 (2018).
  39. https://cccbdb.nist.gov/pollistx.asp. , Available from: https://cccbdb.nist.gov/pollistx.asp (2022).
  40. Raja, U. K. B., Injeti, S., Culver, T., McCabe, J. W., Angel, L. A. Probing the stability of insulin oligomers using electrospray ionization ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 21 (6), 759-774 (2015).
  41. Merenbloom, S. I., Flick, T. G., Williams, E. R. How hot are your ions in TWAVE ion mobility spectrometry. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 23 (3), 553-562 (2012).

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利用离子淌度-质谱法研究镍(II)和锌(II)三元配合物的热化学性质
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