利用低氧张力减少小鼠骨髓基质细胞培养中的造血细胞

摘要

常规培养骨髓基质细胞（BMSCs）会导致分离出的细胞群体具有异质性，其中许多细胞来源于造血系统。本文介绍一种利用低氧张力显著减少小鼠BMSC培养物中造血污染细胞的方法。

摘要

目前，仍缺乏普遍接受的标志物来前瞻性地分离出均一的骨骼干细胞（SSCs）群体。因此，支持造血功能并参与骨骼所有功能的骨髓间充质干细胞（BMSCs）仍被广泛用于研究多能间充质前体细胞（MMPs）并推断SSCs的功能。此外，鉴于研究肌肉骨骼疾病时使用了大量转基因小鼠模型，BMSCs的使用也成为研究调控MMPs和SSCs的分子机制的有力工具。然而，常用的小鼠BMSC分离方法所获得的细胞中，超过50%来源于造血细胞，可能影响这些研究中数据的解读。本文介绍一种利用低氧张力或缺氧条件选择性清除BMSC培养物中CD45⁺细胞的方法。重要的是，该方法易于实施，不仅可减少造血污染细胞，还能提高BMSC培养物中MMPs和假定SSCs的比例。

引言

与造血干细胞（HSCs）类似，骨骼干细胞（SSCs）也位于骨微环境中；然而，与HSCs不同的是，目前尚无普遍公认的细胞表面标志物可用于前瞻性鉴定SSCs^1,2,3。然而， 体外 培养系统和 体内 重建实验表明，部分骨髓间充质干细胞（BMSCs）具有支持造血的能力，以及分化为间充质谱系所有细胞类型的潜能^4,5因此，尽管骨髓间充质干细胞（BMSCs）代表了一类高度异质性的细胞群体，但其中一部分细胞具有以下特征 真正有效的 干细胞，根据其自我更新并重建其来源组织所有细胞类型的能力来定义。此外，与使用细胞表面标志物的方法不同，骨髓间充质干细胞（BMSCs）可根据其快速贴附于组织培养塑料表面的特性被迅速分离。^6,7因此，骨髓间充质干细胞常被用作精原干细胞的替代物⁵.

尽管利用对组织培养（TC）塑料的优先黏附特性已成功用于从人体组织中分离骨髓间充质干细胞（BMSCs），但在小鼠模型中，该方法面临额外的挑战。最显著的问题是，小鼠造血细胞能够黏附于TC塑料以及BMSCs，因此在此模型系统中容易产生较高的造血细胞污染，从而影响采用该分离方法所获得数据的解读⁶。

值得注意的是，骨髓间充质干细胞（BMSCs）存在于骨微环境中，该环境的氧张力范围为1%-4%⁸。然而，在标准的组织培养条件下，细胞培养箱通常维持在21%的大气氧浓度，属于超生理水平。这些差异的功能意义十分显著：在21%氧浓度下培养间充质来源的细胞会伴随细胞死亡增加^9,10。此外，我们最近的研究表明，造血细胞和间充质细胞对低氧张力的反应存在差异。具体而言，当BMSCs培养于低氧张力条件下时，CD45⁺造血细胞的数量显著减少。事实上，采用该技术时，我们观察到CD45⁺造血细胞减少了90%¹¹。

本文分享了一种可轻松实施的实验方案，帮助实验室在常规培养骨髓间充质细胞（BMSCs）过程中显著减少造血细胞污染，提高间充质细胞的纯度。

方案

所有采用小鼠模型的方法均按照批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC）方案（A187-19-08）进行。

1. 后肢骨骼的解剖

1. 使用流速为 2–4 L/min 的 CO₂ 窒息法处死 10–12 周龄的雄性或雌性 C57BL/6 小鼠，随后通过断头法确认死亡。本实验可使用雌性或雄性小鼠，预期结果无差异。用 70% 乙醇喷洒毛发。
2. 使用无菌外科镊子和剪刀在胸骨下方的皮肤上做一个小切口。用手将皮肤沿身体周向撕开，然后将皮肤向远端拉至后肢，以暴露下方组织。
3. 使用灭菌的外科镊子和剪刀，通过将股骨头（球部）从骨盆（髋臼）的髋臼窝（窝部）中分离，轻柔地取下后肢。使用无菌镊子和手术刀沿骨骼轻轻刮除，尽可能去除软组织。
4. 使用无菌手术刀切断连接两骨的韧带（外侧和内侧副韧带、前交叉和后交叉韧带以及髌腱[韧带]），以分离股骨和胫骨，操作时应尽量减少阻力。重要的是，分离后应保持远端股骨和近端胫骨的髁部完整。
5. 对于远端股骨，在股骨头与第三转子之间做一切口，并在生长板近端的骨骺处做另一切口，尽量减少对生长板的损伤。
6. 对于近端胫骨，在外踝近端做一切口，并在胫骨平台远端、紧邻生长板近端处做另一切口。
7. 将股骨和胫骨切割面朝下分别放入 1.5 mL 微量离心管中。

2. 从股骨和胫骨中分离骨髓间充质干细胞

1. 将1.5 mL微量离心管放入台式离心机中，在4 °C条件下以10,000 × g 离心1秒。
2. 使用无菌镊子小心地将骨骼从微量离心管中取出，使红色的骨髓团块留在微量离心管底部。若部分骨髓仍残留在骨腔内，可将骨骼转移至新的离心管中，重复快速离心步骤，并在第2.3步重悬时将所有沉淀合并至同一管中。
3. 使用P1000移液器将骨髓沉淀物在500 µL培养基（MEMα，添加20%胎牛血清和1,000 U/ml青霉素-链霉素）中轻轻重悬。将骨髓基质细胞转移至含有4.5 mL培养基的15 mL锥形管中。

3. 红细胞裂解

1. 在 4 °C 条件下以 300 × g 离心 5 分钟，沉淀细胞。吸除培养基，并用 1.5 mL 红细胞裂解缓冲液轻轻重悬沉淀。
2. 室温孵育 75–90 秒。立即加入 10 mL 培养基终止反应。
3. 在 4 °C 条件下以 300 × g 离心 5 分钟，吸除上清，将沉淀用 10 mL 培养基重悬，用于细胞计数（见步骤 4）。
   ​注意：细胞沉淀应不再呈红色而为白色，表明红细胞已成功裂解。若沉淀仍呈红色，可再进行一次红细胞裂解缓冲液处理。

4. 铺板骨髓间充质干细胞

1. 为进行铺板活细胞计数，取10 µL细胞悬液并加入10 µL台盼蓝溶液。
2. 取10 µL细胞与台盼蓝混合液滴加至血细胞计数板，计数有活力的（非蓝色）细胞。大多数活细胞应能排除台盼蓝染色。
3. 进行克隆形成实验时，将细胞以60,000个细胞/cm²的密度接种至T-25 cm²组织培养瓶中。进行高密度骨髓间充质干细胞（BMSC）培养时，将细胞以130,000个细胞/cm²的密度接种至100 mm²组织培养皿中。T-25 cm²培养瓶使用总体积5 mL，100 cm²培养皿使用总体积10 mL。
4. 将细胞在1%-2%（低氧）或21%氧气（常氧）以及5% CO₂条件下培养3小时。常规低氧张力培养BMSC时，可使用低氧细胞培养箱或低氧培养舱。根据仪器制造商的说明进行设置，调节氮气和二氧化碳的气体流速，以达到目标氧气和CO₂浓度范围。
5. 3小时后，用1×PBS小心冲洗培养器皿3次。为避免干扰已开始贴壁的细胞，应缓慢吸液，并将PBS沿组织培养皿侧壁轻柔吹入。
6. 最后一次1×PBS冲洗后，若使用100 cm²培养皿，则加入10 mL生长培养基；若使用T-25 cm²培养瓶，则加入5 mL生长培养基。冲洗后，大多数未贴壁的悬浮细胞应已被去除。

5. 在低氧条件下维持骨髓间充质干细胞（BMSCs）

1. 对于低氧培养，将细胞维持在设置为1%-2% O₂和5% CO₂的低氧培养箱或培养箱中。对于常氧培养，将细胞维持在21% O₂和5% CO₂条件下。若使用低氧培养箱，应尽量减少开启箱门的次数，以防止大气氧（21%）进入。每2-3天更换一次培养基。
2. 进行克隆形成实验时，将细胞培养7-10天，之后可对克隆进行计数，或开始诱导分化或其他所需检测。在低氧条件下，预期可形成50-120个克隆；而在常氧条件下，预期可形成5-30个克隆。
3. 对于高密度骨髓间充质干细胞（BMSC）培养，将细胞培养至完全汇合，低氧条件下约需7-10天，常氧条件下约需14-21天。待细胞完全汇合后，使用0.25%胰蛋白酶消化细胞，用于后续所需实验。
4. 为观察细胞形态，将组织培养皿置于显微镜载物台上，将相差物镜转入光路，并确保选择与所用物镜对应的相差对比滑块。以100倍或200倍放大倍数观察细胞。

结果

细胞分离培养7天后，在21%氧气条件下培养的细胞表现出高度异质性。具体而言，细胞大小差异显著，较大的双极细胞与体积较小且具有多个突起的细胞交错分布（图1A）。相比之下，在低氧条件下培养的细胞则表现出高度均一性。集落内的细胞在大小上相对一致，呈双极形态，类似于在组织培养塑料表面生长的其他间充质来源细胞（图1B）。在正常氧浓度条件下培养14天后，克隆形成密度下每T25cm²培养瓶中约有5–30个集落，其尺寸较在低氧条件下生长的集落更小（图2A）。值得注意的是，在低氧环境中培养的细胞增殖能力显著，表现为明显的集落形成，每T25cm²培养瓶中可形成50–120个集落（图2B）。此外，在21%氧气条件下培养的细胞表现出衰老细胞的典型形态学特征，细胞体积大、扁平且多核（图3）。此外，可通过β-半乳糖苷酶染色实验...

讨论

根据我们的观察，骨髓间充质干细胞（BMSCs）比巨噬细胞及其他造血来源的细胞更早贴附于组织培养塑料表面¹¹。因此，接种后3小时冲洗培养皿是一个关键步骤，可去除仍处于悬浮状态、但可能在后续时间点发生贴附的造血细胞。此外，冲洗操作需格外小心，应将培养基沿培养皿侧壁加入，避免扰动那些尚未分泌基质、仍呈圆形且贴附较松散的BMSCs。经过三次冲洗后，大多数悬浮细胞应已被清除。尽管在此时间点冲洗BMSC培养物可减少CD45⁺细胞的比例，但维持低氧培养环境对于显著降低造血细胞比例并提高基质细胞比例至关重要¹¹。值得注意的是，若接种72小时后仍未见克隆形成，可能是冲洗操作过于剧烈，导致BMSCs和造血细胞均被清除。

低氧培养至第7天时，细胞在形态上应呈现均一性（图1 和 图2），主要为体积较大、呈双极状的成纤维细胞样细胞。需要强调...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 mm2 组织培养皿	康宁	353003
1×磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco	100010-023
亮线血细胞计数板	Sigma-Aldrich	Z359629
C57BL/6J	杰克逊实验室	664
HyClone 胎牛血清（美国），已鉴定	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.03
InvivO2 400	Baker Ruskinn	https://bakerco.com
MEMα，核苷	Gibco	12571-063
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	Gibco	15140-122
红细胞裂解缓冲液 Hybri-Max	Sigma-Aldrich	R7757
T-25cm2  组织培养瓶	康宁	430168
台盼蓝溶液	Sigma-Aldrich	T8154
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），酚红	Gibco	25200-056