线粒体内膜对 Na+ 的敏感性揭示了功能型辅酶Q池的部分区室化

摘要

本方案描述了一种比较性检测方法，通过检测在有或无 Na⁺ 存在条件下线粒体复合物 CI+CIII 和 CII+CIII 的活性，以研究部分区隔化的功能性辅酶Q池是否存在。

摘要

线粒体内膜（IMM）中的泛醌（CoQ）库部分地被分隔，分别供给复合物I或FAD依赖性酶。这种区室化可通过使用冻融线粒体中以NADH或琥珀酸作为电子供体的比较性测定法轻松评估，其中检测细胞色素c（cyt c）的还原程度。该测定依赖于Na⁺对线粒体内膜的作用，即降低其流动性。本文介绍了一种在NaCl或KCl存在下测定NADH-细胞色素c氧化还原酶活性和琥珀酸-细胞色素c氧化还原酶活性的实验方案。反应通过在比色皿中逐步加入试剂混合物进行，并在Na⁺或K⁺存在下于4分钟内通过分光光度法测定。同时平行进行另一组实验，在反应体系中加入特异性酶抑制剂，以扣除非特异性吸光度变化。NADH-细胞色素c氧化还原酶活性在这些阳离子存在下不降低，而琥珀酸-细胞色素c氧化还原酶活性在NaCl存在下则显著下降。这一简单实验说明了以下三点：1）Na⁺可降低线粒体内膜流动性及泛醌（CoQ）的传递；2）超复合物I+III₂能够保护泛醌（CoQ）传递不受线粒体内膜流动性降低的影响；3）复合物I与复合物III之间的泛醌传递在功能上不同于复合物II与复合物III之间的泛醌传递。这些结果支持线粒体内膜中存在功能上分离的泛醌库，并表明这些泛醌库可受线粒体所处Na⁺环境变化的调控。

引言

线粒体氧化磷酸化系统（OXPHOS）是驱动三磷酸腺苷（ATP）合成、活性氧（ROS）生成以及线粒体消耗还原当量（如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）或琥珀酸）的主要通路。OXPHOS系统由五个蛋白质复合物组成：复合物I（CI）氧化NADH，并将辅酶Q（CoQ）还原为泛醇（CoQH₂）；复合物II（CII）将琥珀酸氧化为延胡索酸，同时将CoQ还原为CoQH₂；复合物III（CIII）将CoQH₂重新氧化为CoQ，并还原细胞色素c（cyt c）；最后，复合物IV（CIV）氧化cyt c，并将氧气还原为水。这一氧化还原链，即所谓的线粒体电子传递链（mETC），与质子（H⁺）跨内膜（IMM）的泵送相偶联，从而形成电化学梯度，复合物V（CV）利用该梯度将二磷酸腺苷（ADP）磷酸化为ATP。

线粒体电子传递链复合物（mETC）可单独存在于内膜（IMM）中，也可组装成称为超复合物的四级结构。复合物IV（CIV）可与复合物III（CIII）组装，形成III₂+IV或Q型呼吸体（因其在CoQH₂存在下能够进行呼吸作用）^1,2,3，或形成同源二聚体或同源寡聚体

方案

所有动物实验均遵循《实验动物护理和使用指南》进行，并根据2010年9月22日欧洲联盟指令（2010/63/UE）以及2013年2月1日西班牙皇家法令（53/2013）的规定，经西班牙卡洛斯三世国家心血管研究中心（Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III, CNIC）机构伦理委员会批准。所有努力均旨在尽量减少使用动物的数量及其所受痛苦。

注意：本比较测定法用于研究线粒体辅酶Q池的区室化，具体描述如下：

1. 蛋白质定量

1. 在实验前，将从小鼠肝脏中分离的野生型线粒体反复冻融三次（即线粒体膜），以使细胞器对反应底物具有通透性²⁶。
2. 采用Bradford法或二辛可宁酸（BCA）法测定分离线粒体样品的蛋白含量。若使用Bradford法，将2 µL样品加入1 mL 1x Bradford试剂中。
3. 将样品均分为四个各含20 µg蛋白的亚样品（分别标记为A、B、C、D；图2A）。

2. 测定复合物I+III（CI+CIII）活性

结果

本方案的典型结果如下所示（图3）。由于还原型细胞色素c在550 nm处有吸收峰，所有未抑制的样品均应显示550 nm处吸光度的增加。理想情况下，抑制样品的吸光度变化应呈平直线或略微上升的斜率（图3）。应从未抑制样品的斜率中减去抑制样品的斜率。

样品A和B均经过相应的抑制校正，代表NADH:细胞色素c氧化还原酶活性，二者斜率相似（图3A）。然而，经过相应抑制校正的亚样品C和D代表琥珀酸:细胞色素c氧化还原酶活性，二者存在差异，其中亚样品C的活性高于亚样品D（图3B）。请注意，不同样品之间的基础吸光度可能略有差异（图3A）。

这些结果（即已通过抑制剂校正的斜率；表2）可通过将所用蛋白质的量（0.01 m.......

讨论

尽管该方案是一种识别部分区室化的辅酶Q池是否存在的非常直接的方法，但仍有一些关键步骤需要注意。底物（如NADH或琥珀酸）最好最后加入，因为这些化合物可能发生自氧化。翻转比色皿时必须小心，以避免产生气泡，以免干扰读数。

此外，本技术存在一些局限性，值得指出。测量并非在完整的线粒体中进行，因此缓冲液的人工成分和比例可能与线粒体的天然环境存在差异。
试剂以过量方式添加，可能无法真实反映完整组织中底物的实际可利用性。

目前的方法需要构建和使用非常特定的遗传模型及设备，而这些在许多实验室中并不容易获得¹。本实验方案提供了一种可靠且易于操作的方法，利用广泛可得的试剂和工具来检测部分分化辅酶Q（CoQ）池的存在。因此，该方法有望在今后用于比较线粒体疾病遗传模型的研究中。

流动电子载体在mETC中的移动性仍是一个备受争议的话题^25,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗霉素 A	Sigma-Aldrich	A8674
牛血清白蛋白 (BSA)	Sigma-Aldrich	10775835001
Bradford 蛋白测定试剂盒	Bio-Rad	5000001
马心细胞色素 c	Sigma-Aldrich	C7752
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P3786
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
丙二酸	Sigma-Aldrich	M1296
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NADH	Roche	10107735001
氰化钾	Sigma-Aldrich	207810
鱼藤酮	Sigma-Aldrich	R8875
Spectra Manager 软件	JASCO	version 2
紫外-可见分光光度计	UV/VISJASCO
琥珀酸	Sigma-Aldrich	398055