本方案描述了一种比较性检测方法，通过检测在有或无 Na+ 存在条件下线粒体复合物 CI+CIII 和 CII+CIII 的活性，以研究部分区隔化的功能性辅酶Q池是否存在。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
线粒体内膜（IMM）中的泛醌（CoQ）库部分地被分隔，分别供给复合物I或FAD依赖性酶。这种区室化可通过使用冻融线粒体中以NADH或琥珀酸作为电子供体的比较性测定法轻松评估，其中检测细胞色素c（cyt c）的还原程度。该测定依赖于Na+对线粒体内膜的作用，即降低其流动性。本文介绍了一种在NaCl或KCl存在下测定NADH-细胞色素c氧化还原酶活性和琥珀酸-细胞色素c氧化还原酶活性的实验方案。反应通过在比色皿中逐步加入试剂混合物进行，并在Na+或K+存在下于4分钟内通过分光光度法测定。同时平行进行另一组实验，在反应体系中加入特异性酶抑制剂，以扣除非特异性吸光度变化。NADH-细胞色素c氧化还原酶活性在这些阳离子存在下不降低，而琥珀酸-细胞色素c氧化还原酶活性在NaCl存在下则显著下降。这一简单实验说明了以下三点：1）Na+可降低线粒体内膜流动性及泛醌（CoQ）的传递；2）超复合物I+III2能够保护泛醌（CoQ）传递不受线粒体内膜流动性降低的影响；3）复合物I与复合物III之间的泛醌传递在功能上不同于复合物II与复合物III之间的泛醌传递。这些结果支持线粒体内膜中存在功能上分离的泛醌库，并表明这些泛醌库可受线粒体所处Na+环境变化的调控。
引言
线粒体氧化磷酸化系统（OXPHOS）是驱动三磷酸腺苷（ATP）合成、活性氧（ROS）生成以及线粒体消耗还原当量（如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）或琥珀酸）的主要通路。OXPHOS系统由五个蛋白质复合物组成：复合物I（CI）氧化NADH，并将辅酶Q（CoQ）还原为泛醇（CoQH2）；复合物II（CII）将琥珀酸氧化为延胡索酸，同时将CoQ还原为CoQH2；复合物III（CIII）将CoQH2重新氧化为CoQ，并还原细胞色素c（cyt c）；最后，复合物IV（CIV）氧化cyt c，并将氧气还原为水。这一氧化还原链，即所谓的线粒体电子传递链（mETC），与质子（H+）跨内膜（IMM）的泵送相偶联，从而形成电化学梯度，复合物V（CV）利用该梯度将二磷酸腺苷（ADP）磷酸化为ATP。
线粒体电子传递链复合物（mETC）可单独存在于内膜（IMM）中，也可组装成称为超复合物的四级结构。复合物IV（CIV）可与复合物III（CIII）组装，形成III2+IV或Q型呼吸体（因其在CoQH2存在下能够进行呼吸作用）1,2,3，或形成同源二聚体或同源寡聚体4。CIII可与复合物I（CI）相互作用，形成超复合物I+III25。最后，CI也能与Q型呼吸体结合，形成I+III2+IV或N型呼吸体（因其可通过消耗NADH进行呼吸作用）1,6,7,8,9,10。
CoQ 和 cyt c 是可移动的电子载体，分别负责将电子从 CI/CII 传递至 CIII，以及从 CIII 传递至 CIV。在过去二十年中，超级复合物是否对这些电子载体施加功能上的局部限制，一直是激烈争论的议题2,7,11,12,13,14,15,16,17。然而，多个独立研究团队已证明，CoQ 和 cyt c 在线粒体内膜（IMM）中可功能上划分为不同的池。就 CoQ 而言，其可被功能划分为专用于 CI 的特定 CoQ 池（CoQNAD）和另一专用于依赖 FAD 的酶的 CoQ 池（CoQFAD）1,7,12,18,19。然而，为了区分部分分隔的功能性 CoQ 池的存在，需要过表达替代性氧化酶（AOX）并构建特定的线粒体 DNA（mtDNA）突变体，后者可在缺乏 CIII 的情况下组装 CI1,19,20。
在缺氧条件下活性氧（ROS）的产生机制直到最近仍不明确。在急性缺氧过程中，复合物I（CI）会发生活性/非活性（A/D）转换，这一过程伴随着其H+泵送型NADH-CoQ氧化还原酶活性的降低。该H+泵送活性的下降导致线粒体基质酸化，并部分溶解线粒体基质中的磷酸钙沉淀，从而释放可溶性Ca2+。可溶性Ca2+浓度的升高激活了Na+/Ca2+交换体（NCLX），促使Ca2+外排并同时摄入Na+。线粒体内Na+浓度的增加会与线粒体内膜（IMM）内侧的磷脂相互作用，降低膜的流动性以及CII与CIII之间的辅酶Q（CoQ）转移效率，最终生成超氧阴离子这一氧化还原信号分子21。有趣的是，CoQ的转移仅在CII与CIII之间受到抑制，而在CI与CIII之间则未受影响，这表明：1）Na+仅能调节线粒体中已存在的某一特定CoQ池；2）线粒体内膜中存在功能上相互区分的CoQ池。因此，一种广泛用于研究线粒体酶活性的实验方案可用于评估上述CoQ池的存在。
本方案基于在琥珀酸（即复合体II底物）或NADH（即复合体I底物）存在条件下，通过吸光度测定氧化型细胞色素c（CIII的底物）的还原程度。将同一样品分为两份，其中一份用KCl处理，另一份用相同浓度的NaCl处理。由于Na+会降低线粒体内膜（IMM）的流动性，如果辅酶Q（CoQ）在线粒体内膜中仅形成一个统一的功能池，则在Na+存在时，复合体I+CIII和复合体II+CIII的活性均会下降。然而，如果CoQ在线粒体内膜中以部分区隔化的功能池形式存在，则Na+的影响主要（或仅）体现在复合体II+CIII的活性上，而不会影响复合体I+CIII的活性。正如近期研究报道21，Na+仅影响复合体II与复合体III之间的CoQ传递（图1C、D），而对复合体I与复合体III之间的CoQ传递无影响（图1A、B）。
该方案结合多种技术，已用于证实线粒体内膜（IMM）中存在部分区隔化的功能型辅酶Q（CoQ）池，其中一个专用于复合物I（即CoQNAD），另一个专用于FAD连接的酶（即CoQFAD）1,3,7；尽管该现象仍存在争议22，但已被多个研究团队独立验证7,19。因此，复合物I组装成超复合物的结构会影响CoQ在局部的流动性，促进其在超复合物内被复合物III（CIII）利用1,7,13,14,23,24,25。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有动物实验均遵循《实验动物护理和使用指南》进行，并根据2010年9月22日欧洲联盟指令（2010/63/UE）以及2013年2月1日西班牙皇家法令（53/2013）的规定，经西班牙卡洛斯三世国家心血管研究中心（Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III, CNIC）机构伦理委员会批准。所有努力均旨在尽量减少使用动物的数量及其所受痛苦。
注意：本比较测定法用于研究线粒体辅酶Q池的区室化，具体描述如下：
1. 蛋白质定量
- 在实验前，将从小鼠肝脏中分离的野生型线粒体反复冻融三次（即线粒体膜），以使细胞器对反应底物具有通透性26。
- 采用Bradford法或二辛可宁酸（BCA）法测定分离线粒体样品的蛋白含量。若使用Bradford法，将2 µL样品加入1 mL 1x Bradford试剂中。
- 将样品均分为四个各含20 µg蛋白的亚样品（分别标记为A、B、C、D；图2A）。
2. 测定复合物I+III（CI+CIII）活性
注意：本实验步骤使用样品 A 和 B 来测定 CI+CIII 活性（图 2B）。
- 将样品 A 和 B 各分为两个 10 µg 的子样品（即 A1、A2、B1 和 B2）。将每个子样品与 30 µL 细胞色素 c（10 mg/mL）、10 µL 100 mM 丙二酸盐在 1 mL 比色皿中混合，并加入预热至 37 °C 的 C1/C2 缓冲液（表 1），定容至 980 µL（A2 和 B2 比色皿定容至 979 µL）。
警告：此步骤涉及使用有毒试剂丙二酸盐和氰化钾。
注意：细胞色素 c（10 mg/mL）需现配，方法为将 10 mg 细胞色素 c 溶于 1 mL 10 mM K2HPO4 溶液中，调节 pH 至 7.2，并在实验全程置于冰上保存。 - 在比色皿 A1 和 A2 中加入 10 µL 1 M KCl，在比色皿 B1 和 B2 中加入 10 µL 1 M NaCl。
- 向含有子样品 A2 和 B2 的比色皿中加入 1 µL 1 mM 鱼藤酮。
警告：此步骤涉及使用有毒试剂鱼藤酮。 - 在测量前立即向所有比色皿中加入 10 µL NADH（10 mM）。
注意：建议将 10 µL 加入比色皿的侧壁，混合后反应随即开始。 - 通过轻轻翻转比色皿三次进行混匀，然后将其放入吸光度比色皿读取仪（UV/VISJASCO 分光光度计）中。
- 点击 测量 > 参数 > 常规 ，设置测量参数：波长 550 nm，读取时间 4 分钟；点击 确定 和 开始 按钮以启动实验。
- 测量结束后，点击 文件 和 另存为 保存吸光度线性上升阶段的斜率。斜率也可手动记录。
3. 测定CII+CIII活性
注意：本实验步骤使用样品 C 和 D 来测定 CII+CIII 活性（图 2C）。
- 将样品 C 和 D 各分为两个 10 µg 的子样品（即 C1、C2、D1 和 D2）。将每个子样品与 30 µL 细胞色素 c（10 mg/mL）、1 µL 的 1 mM 鱼藤酮混合，并加入预热至 37 °C 的 C1/C2 缓冲液至总体积为 980 µL（C2 和 D2 比色皿中为 970 µL）。
警告：此步骤涉及使用有毒试剂氰化钾和鱼藤酮。
注意：细胞色素 c（10 mg/mL）需现配，方法为将 10 mg 细胞色素 c 溶于 1 mL 的 10 mM K2HPO4 溶液中，调节 pH 至 7.2，并在整个实验过程中保持冰浴状态。 - 在比色皿 C1 和 C2 中加入 10 µL 的 1 M KCl，在比色皿 D1 和 D2 中加入 10 µL 的 1 M NaCl。
- 向含有子样品 C2 和 D2 的比色皿中加入 1 µL 的 1 mM 抗霉素 A。
警告：此步骤涉及使用有毒试剂抗霉素 A。 - 在测量前立即向所有比色皿中加入 10 µL 的琥珀酸（1 M）。
注意：建议将 10 µL 试剂加至比色皿的台阶处，以便混合时反应立即开始。 - 轻轻混合比色皿，翻转三次。将其放入吸光度比色皿读数仪（紫外/可见光分光光度计）中。
- 点击 测量 > 参数 > 常规，设置测量参数：波长 550 nm，读取时间 4 分钟；按下 确定 和 开始 按钮以启动实验。
- 测量结束后，通过点击 文件 和 另存为 保存吸光度线性上升阶段的斜率。斜率也可手动记录。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
本方案的典型结果如下所示（图3）。由于还原型细胞色素c在550 nm处有吸收峰，所有未抑制的样品均应显示550 nm处吸光度的增加。理想情况下，抑制样品的吸光度变化应呈平直线或略微上升的斜率（图3）。应从未抑制样品的斜率中减去抑制样品的斜率。
样品A和B均经过相应的抑制校正，代表NADH:细胞色素c氧化还原酶活性，二者斜率相似（图3A）。然而，经过相应抑制校正的亚样品C和D代表琥珀酸:细胞色素c氧化还原酶活性，二者存在差异，其中亚样品C的活性高于亚样品D（图3B）。请注意，不同样品之间的基础吸光度可能略有差异（图3A）。
这些结果（即已通过抑制剂校正的斜率；表2）可通过将所用蛋白质的量（0.01 m...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
尽管该方案是一种识别部分区室化的辅酶Q池是否存在的非常直接的方法，但仍有一些关键步骤需要注意。底物（如NADH或琥珀酸）最好最后加入，因为这些化合物可能发生自氧化。翻转比色皿时必须小心，以避免产生气泡，以免干扰读数。
此外，本技术存在一些局限性，值得指出。测量并非在完整的线粒体中进行，因此缓冲液的人工成分和比例可能与线粒体的天然环境存在差异。
试剂以过量方式添加，可能无法真实反映完整组织中底物的实际可利用性。
目前的方法需要构建和使用非常特定的遗传模型及设备，而这些在许多实验室中并不容易获得1。本实验方案提供了一种可靠且易于操作的方法，利用广泛可得的试剂和工具来检测部分分化辅酶Q（CoQ）池的存在。因此，该方法有望在今后用于比较线粒体疾病遗传模型的研究中。
流动电子载体在mETC中的移动性仍是一个备受争议的话题25,
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢 R. Martínez-de-Mena 博士、M. M. Muñoz-Hernandez、A.、C. Jimenez 博士和 E. R. Martínez-Jimenez 提供的技术支持。本研究由 MICIN：RTI2018-099357-B-I00 和 HFSP（RGP0016/2018）资助。西班牙国家心血管研究中心（CNIC）由卡洛斯三世健康研究所（ISCIII）、科学、创新与大学部（MCNU）以及 Pro CNIC 基金会资助，并被授予塞韦罗·奥乔亚卓越中心（SEV-2015-0505）。图2使用 BioRender.com 制作。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗霉素 A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| 牛血清白蛋白 (BSA) | Sigma-Aldrich | 10775835001 | |
| Bradford 蛋白测定试剂盒 | Bio-Rad | 5000001 | |
| 马心细胞色素 c | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| 丙二酸 | Sigma-Aldrich | M1296 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NADH | Roche | 10107735001 | |
| 氰化钾 | Sigma-Aldrich | 207810 | |
| 鱼藤酮 | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Spectra Manager 软件 | JASCO | version 2 | |
| 紫外-可见分光光度计 | UV/VISJASCO | ||
| 琥珀酸 | Sigma-Aldrich | 398055 |
参考文献
- Calvo, E., et al. Functional role of respiratory supercomplexes in mice: SCAF1 relevance and segmentation of the Qpool. Science Advances. 6 (26), (2020).
- Garcia-Poyatos, C., et al. Scaf1 promotes respiratory supercomplexes and metabolic efficiency in zebrafish. EMBO Reports. 21 (7), 50287(2020).
- Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
- Cogliati, S., et al. Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV. Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).
- Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Degliesposti, G., Skehel, M., Sazanov, L. A. Structures of respiratory Supercomplex I+III2 reveal functional and conformational crosstalk. Molecular Cell. 75 (6), 1131-1146 (2019).
- Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular Cell. 32 (4), 529-539 (2008).
- Jeon, T. J., et al. A dynamic substrate pool revealed by cryo-EM of a lipid-preserved respiratory supercomplex. Antioxidants and Redox Signaling. , (2021).
- Gu, J., et al. The architecture of the mammalian respirasome. Nature. 537 (7622), 639-643 (2016).
- Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Sazanov, L. A. The architecture of respiratory supercomplexes. Nature. 537 (7622), 644-648 (2016).
- Sousa, J. S., Mills, D. J., Vonck, J., Kuhlbrandt, W. Functional asymmetry and electron flow in the bovine respirasome. Elife. 5, 21290(2016).
- Andreasson, C., Ott, M., Buttner, S. Mitochondria orchestrate proteostatic and metabolic stress responses. EMBO Reports. 20 (10), 47865(2019).
- Berndtsson, J., et al. Respiratory supercomplexes enhance electron transport by decreasing cytochrome c diffusion distance. EMBO Reports. 21 (12), 51015(2020).
- Bianchi, C., Genova, M. L., Parenti Castelli, G., Lenaz, G. The mitochondrial respiratory chain is partially organized in a supercomplex assembly: kinetic evidence using flux control analysis. Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36562-36569 (2004).
- Enriquez, J. A. Supramolecular organization of respiratory complexes. Annual Review of Physiology. 78, 533-561 (2016).
- Genova, M. L., Lenaz, G. A critical appraisal of the role of respiratory supercomplexes in mitochondria. Biological Chemistry. 394 (5), 631-639 (2013).
- Letts, J. A., Sazanov, L. A. Clarifying the supercomplex: the higher-order organization of the mitochondrial electron transport chain. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (10), 800-808 (2017).
- Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J. The enigma of the respiratory chain supercomplex. Cell Metabolism. 25 (4), 765-776 (2017).
- Moe, A., Di Trani, J., Rubinstein, J. L., Brzezinski, P. Cryo-EM structure and kinetics reveal electron transfer by 2D diffusion of cytochrome c in the yeast III-IV respiratory supercomplex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 2021157118(2021).
- Szibor, M., et al. Bioenergetic consequences from xenotopic expression of a tunicate AOX in mouse mitochondria: Switch from RET and ROS to FET. Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1861 (2), 148137(2020).
- Guaras, A., et al. The CoQH2/CoQ ratio serves as a sensor of respiratory chain efficiency. Cell Reports. 15 (1), 197-209 (2016).
- Hernansanz-Agustin, P., et al. Na(+) controls hypoxic signalling by the mitochondrial respiratory chain. Nature. 586 (7828), 287-291 (2020).
- Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (2), 141-161 (2022).
- Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).
- Enriquez, J. A., Lenaz, G. Coenzyme q and the respiratory chain: coenzyme q pool and mitochondrial supercomplexes. Molecular Syndromology. 5 (3-4), 119-140 (2014).
- Hernansanz-Agustin, P., Enriquez, J. A. Functional segmentation of CoQ and cyt c pools by respiratory complex superassembly. Free Radical Biology and Medicine. 167, 232-242 (2021).
- Fernandez-Vizarra, E., et al. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).
- Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes. Biochemical Society Transactions. 49 (6), 2655-2668 (2021).
- den Brave, F., Becker, T. Supercomplex formation boosts respiration. EMBO Reports. 21 (12), 51830(2020).
- Perez-Mejias, G., Guerra-Castellano, A., Diaz-Quintana, A., Dela Rosa, M. A., Diaz-Moreno, I. Cytochrome c: Surfing off of the mitochondrial membrane on the tops of Complexes III and IV. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 654-660 (2019).
- Stepanova, A., Valls, A., Galkin, A. Effect of monovalent cations on the kinetics of hypoxic conformational change of mitochondrial complex I. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (10), 1085-1092 (2015).
- Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. The EMBO Journal. 39 (13), 104073(2020).
- Böckmann, R. A., Hac, A., Heimburg, T., Grubmüller, H. Effect of sodium chloride on a lipid bilayer. Biophysical Journal. 85 (3), 1647-1655 (2003).
- Cordomí, A., Edholm, O., Perez, J. J. Effect of ions on a dipalmitoyl phosphatidylcholine bilayer. a molecular dynamics simulation study. The Journal of Physical Chemistry B. 112 (5), 1397-1408 (2008).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
