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采用真空稳定成像系统对实验性急性肺损伤中肺微循环进行活体宽场荧光显微观察

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DOI：

10.3791/63733

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2022年4月6日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, Dalhousie University, 2Department of Microbiology and Immunology, Dalhousie University, 3Department of Neuroscience, Dalhousie University, 4Department of Anesthesia, Pain Management, and Perioperative Medicine, Dalhousie University, 5Live Cell Imaging Center, University of Calgary, 6Department of Physiology and Pharmacology, University of Calgary, 7Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Calgary, 8Department of Pharmacology, Dalhousie University

本文内容

摘要

活体荧光显微镜可用于实时研究白细胞与内皮细胞的相互作用以及毛细血管灌注。本方案描述了利用真空稳定肺成像系统对肺微循环中的这些参数进行成像和定量的方法。

摘要

活体成像技术对白细胞-内皮细胞相互作用的研究为在活体动物中理解免疫介导性疾病提供了重要见解。由于肺部可及性有限且存在固有的运动伪影，对急性肺损伤（ALI）/急性呼吸窘迫综合征（ARDS）及其他呼吸系统疾病进行体内研究较为困难。尽管如此，已有多种方法被开发出来以克服这些挑战。本实验方案描述了一种用于在ALI实验模型中实时研究肺微循环内白细胞-内皮细胞相互作用的活体荧光显微镜技术。通过使用一种体内肺成像系统及3D打印的活体显微镜平台，可固定麻醉后的小鼠并稳定肺组织，同时最大程度减少继发性肺损伤。完成准备后，采用宽场荧光显微镜观察白细胞黏附、白细胞滚动以及毛细血管功能。尽管本方案主要聚焦于炎症性肺病急性模型中的成像，但也可经调整后用于研究肺部其他病理及生理过程。

引言

活体显微成像（Intravital microscopy, IVM）是一种用于可视化和研究多种生物物理过程的有用成像工具 体内肺部成像具有很高的挑战性 体内 由于其位置封闭、组织脆弱，以及呼吸和心跳引起的运动伪影1,2已开发出多种活体显微镜（IVM）装置，用于实时成像肺微循环中白细胞与内皮细胞的相互作用，以应对上述挑战。这些方法基于通过外科手术暴露并稳定肺组织以进行成像。

通常通过手术操作准备用于肺部活体显微成像（IVM）的动物。首先对动物进行气管插管并实施机械通气，以便手术切除胸壁窗口，并进行后续操作以固定肺组织，便于成像。一种传统技术是将肺实质直接黏附到玻璃盖玻片上3，但该方法可能对成像组织造成明显的物理损伤。更为先进的方法是采用真空系统，在玻璃窗口下固定肺组织4。该装置通过在较大局部区域施加可逆的均匀真空，使肺表面轻柔地贴附于盖玻片，同时在限制肺组织在x、y和z方向移动的同时保持其适度扩张4。真空通过成像区域周围的一个通道均匀施加，将组织牵引至一个朝向成像级盖玻片的浅锥形区域4。通过此观察窗口，可利用多种光学成像技术对肺微循环进行研究。

肺部活体显微成像（IVM）可实现对多种微循环参数的定量成像。这些参数包括白细胞轨迹速度和长度5、红细胞流速6和氧合状态7、肿瘤转移8、免疫细胞亚群的区分9,10,11、微颗粒的可视化12、肺泡动态变化13,14、血管通透性15以及毛细血管功能16。本文重点介绍白细胞募集和毛细血管功能。肺微循环中白细胞募集的启动涉及白细胞与内皮细胞之间的短暂滚动相互作用和牢固黏附相互作用，这两种作用在炎症状态下均会增强16,17。通常，滚动通过经过操作者定义参考线的白细胞数量来量化，而黏附则通过在内皮上静止不动的白细胞数量来量化16。炎症状态也可能影响毛细血管功能，常导致灌注减少。这可归因于多种因素，包括红细胞变形能力下降18以及内皮细胞中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的异质性表达，从而引起病理性分流19。通常测量单位面积内灌注毛细血管的总长度，并以功能性毛细血管密度（FCD）表示。

实时研究肺部白细胞的募集需要使用荧光染料或荧光标记的抗体对生物靶标进行标记20。或者，也可利用多种转基因小鼠品系，例如溶菌酶M-绿色荧光蛋白（LysM-GFP）小鼠，以成像特定的免疫细胞亚群（如中性粒细胞）21,22。随后可采用宽场荧光显微镜、共聚焦显微镜或多光子显微镜对荧光标记的白细胞进行观察。这些技术通过使用特定的激发波长并检测发射的荧光信号，同时阻断激发光波长的检测，从而实现对比成像，突出显示被标记的结构。

目前关于小鼠肺部白细胞滚动、黏附和功能性毛细血管密度定量的研究主要依赖于手动视频分析。这可以通过开源软件（如 Fiji6,23）、商业软件（如 CapImage12）或自行开发的图像处理系统24来实现。相比之下，多种商业软件平台（例如 NIS Element、Imaris、Volocity、MetaMorph）能够自动测量多种其他生理参数，包括前述的许多参数5,6,7,8,9,10,11,12,13,15。

利用肺部活体显微成像（lung IVM）已对急性肺损伤（ALI）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的病理过程取得重要发现。ARDS的特征是肺内存在多种病理生理过程，包括由内皮和上皮屏障功能障碍引起的肺水肿和肺泡损伤25。在小鼠模型中发现，脓毒症诱导的ALI与肺微环境中免疫细胞迁移发生显著有害改变密切相关26。在脓毒症诱导ALI的小鼠肺毛细血管中募集的中性粒细胞被发现会阻碍微循环，从而加重ALI中的缺氧状态26。此外，IVM还被用于揭示ARDS发生后组织修复的潜在机制27。肺部IVM也是研究多种阻塞性肺疾病中病理生理变化的重要工具。例如，在囊性纤维化（CF）和慢性阻塞性肺疾病（COPD）等疾病中对黏液运输的可视化观察，促进了针对黏液清除的新型及现有治疗方法的研究28。在这些条件下，白细胞的迁移行为也已被分析17。

本方案在 Lamm 等人最初描述的方法29基础上进行了拓展，用于通过常规荧光显微镜研究白细胞-内皮细胞相互作用。所述操作流程采用一种体内肺部成像系统，该系统包括一个16.5 cm × 12.7 cm的金属底座、微操作器和真空成像窗（图1）。该系统安装在一个20 cm × 23.5 cm的3D打印平台上（补充文件1），以牢固固定呼吸机管路和加热垫。该方法可实现对小鼠肺微循环进行可重复且可量化的体内成像。文中详细说明了手术准备的重要步骤以及真空稳定肺成像系统的正确使用方法。最后，采用急性肺损伤（ALI）的实验模型，展示了炎症状态下白细胞滚动、白细胞黏附及毛细血管灌注改变的代表性成像与分析结果。本方案的应用将有助于进一步深入研究急性疾病状态下肺微循环的病理生理变化。

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方案

本文所述所有操作均事先获得戴尔豪斯大学实验动物委员会（UCLA）的批准。

1. 准备

  1. 肺部成像系统：准备窗口时，在外环顶部涂抹一层薄薄的真空脂，注意避免污染真空通道。将一块干净的8 mm玻璃盖玻片放置在窗口上，并轻轻按压以形成密封。
  2. 宽场荧光显微镜：使用配备20倍/0.40长工作距离物镜和黑白电荷耦合器件（CCD）相机（帧率为25 FPS）的传统宽场荧光显微镜进行成像。采用530–550 nm带通激发滤光片激发罗丹明-6G，以及460–490 nm带通滤光片激发异硫氰酸荧光素（FITC）。
  3. 真空系统：将成像窗口连接至配备数字压力计的真空泵，该真空泵可提供50–60 mmHg的恒定负压，如补充图1所示。具体连接方式为：通过内径1.0 mm聚乙烯管、内径1.0 cm聚乙烯管、真空瓶和串联的0.2 µm滤器，将成像窗口与真空泵相连。
  4. 呼吸机：设置小型啮齿类动物呼吸机，根据小鼠体重计算通气频率和潮气量，实施压力控制通气。在整个实验过程中维持5 cmH2O的呼气末正压（PEEP），并将目标压力设为20 cmH2O。
  5. 麻醉剂：使用低流量麻醉气体输送系统，用99.9%异氟烷预充一支5.0 mL注射器。采用废气清除系统，以最大限度降低外科操作人员吸入麻醉气体的风险。

2. 麻醉

  1. 将一只12周龄、体重20-25 g的雄性C57Bl/6小鼠放入麻醉诱导室中。关闭诱导室后，以500 mL/min的流速和3%的浓度开始异氟烷气体麻醉诱导。
  2. 当小鼠进入麻醉状态（表现为呼吸频率减慢）后，将其转移至气管插管架，并将其上门齿固定于悬挂缝线上。
  3. 拉紧缝线，使小鼠吻部固定在鼻罩内，并以2.5%的浓度通过鼻罩持续供给麻醉气体。
  4. 在进行下一步操作前，通过脚趾夹捏试验确认麻醉深度是否充分。

3. 插管

  1. 旋转固定架，使固定架的背面和小鼠的背侧朝向手术者。
  2. 将一根20 cm长的光纤电缆的尖端穿过20 G气管插管导管，并将电缆尖端浸入1%盐酸利多卡因（Lidocaine HCl）中，以利于电缆通过喉部。
  3. 使用钝头镊子抬起小鼠下颌，并移开舌头，以确保呼吸道通畅。
  4. 插入一个经过改装的耳镜（约去除60°的耳镜套管周缘），使上门齿嵌入耳镜的缺口处。调整耳镜和舌头的位置，直至会厌和声带清晰可见。
  5. 将带有气管插管导管的光纤电缆经耳镜缺口插入喉部。通过微小的环形动作，使电缆穿过声带进入气管。
  6. 沿光纤电缆推进插管导管，使其穿过声带并进入气管。

4. 通气

  1. 将小鼠从气管插管架上取下，置于加热垫上，保持右侧卧位。
  2. 将套管连接至呼吸机管路并启动呼吸机。将麻醉浓度降至1.5%，通过检测足底反射监测麻醉深度。若反射仍存在，可逐步增加麻醉浓度，最高至2%。
  3. 在小鼠眼睛中涂抹眼用凝胶，防止角膜干燥。
  4. 使用医用胶带将套管固定于鼻部。使用标签胶带将右前肢固定在加热垫上，位置约为9点钟方向。将左后肢向尾侧伸展，并固定在加热垫上，位置约为6点钟方向。
  5. 使用布质胶带将左前肢轻轻拉伸至12点钟方向，并将胶带另一端固定在IVM平台顶部，如图2A 所示（此处保持轻微张力有助于后续开胸手术）。
  6. 插入直肠温度探头，并用胶带将其固定在加热垫上。将脉搏血氧仪探头置于右后肢，并小心固定于加热垫上，注意避免影响血液循环。
  7. 当体温稳定在37.0 °C ± 0.1 °C时，开始进行开胸手术。

5. 开胸术

  1. 用70%酒精棉片对小鼠胸腹部进行消毒。在小鼠左侧（从胸骨至脊柱，从肩部至肋笼底部）涂抹一层薄薄的矿物油，以压平毛发。
  2. 使用钝头镊子和直剪刀，在肋笼底部附近做一个小的纵向切口，以暴露其下方的肌肉层。
  3. 向腹侧方向推进，采用钝性分离法将表皮和脂肪组织与肌肉层分开。对任何暴露的血管进行电凝止血。在出血风险降低后，将原切口向腹侧延伸至剑突。
  4. 在背侧重复此操作，直至距脊柱约5 mm的外侧位置。
  5. 向头侧方向推进，采用钝性分离暴露肋笼。对任何暴露的血管进行电凝，以维持血流动力学稳定。
  6. 在出血风险降低后，将切口从剑突延伸至腋窝。
  7. 在切口的背侧重复此操作，直至左耳下方约1 cm处。
  8. 使用止血钳夹住已分离的表皮和脂肪组织，并将其移开手术区域（图2B）。
  9. 通过尾静脉注射罗丹明-6G溶液（0.5 mg/mL；1.5 mL/kg）以可视化白细胞，同时注射牛FITC-白蛋白（50 mg/mL；1 mL/kg）以可视化毛细血管灌注。
  10. 使用有齿镊子夹住吸气末肺底下方的第一根肋骨，并轻微牵拉，使肋骨与肺组织分离。剪断该肋骨以诱发气胸。
  11. 沿肋间肌向两侧横向延伸切口，注意避免接触暴露的肺表面。
  12. 使用钝头镊子夹住上方相邻的肋骨并轻微牵拉，使肺组织自然脱离胸壁。若肺未自行分离，可轻压胸壁使其贴附于肺表面，促使肺与壁层胸膜粘连，从而更易分离。
  13. 继续将原切口向腹侧延伸至胸骨，向头侧延伸至暴露肺尖。使用棉签和纱布控制任何出现的出血。
  14. 抬起肋笼，暴露胸腔背侧的肋间血管。注意避免损伤肺组织，靠近脊柱处电凝最下方的肋间血管，然后剪断相应肋骨。依次向头侧和腹侧方向重复操作，直至切除一段约1 cm × 1.5 cm的肋笼区域（图2C）。
  15. 使用小条纱布通过毛细作用清除胸腔内多余的液体积聚。
  16. 在进行显微成像前，静置约5分钟，使胸膜腔内液体充分消散，以确保肺组织与成像窗口之间形成更稳定的接触界面。

6. 显微镜检查

  1. 打开真空泵，并将压力调节至约 50–60 mmHg。
  2. 将 IVM 平台转移至显微镜载物台。调整金属支架和显微操作器，使成像窗口正对暴露的肺组织，且窗口臂从大约 3 点钟位置接近肺组织。
  3. 使用显微操作器小心降低成像窗口，直至其贴附并稳定肺表面（图 3A）。
  4. 使用 20 倍物镜和 460-490 nm 带通激发滤光片，根据血流汇聚模式识别一支肺小静脉。将血管置于视野中央，并录制 30 秒视频。
    1. 切换至 530-550 nm 带通激发滤光片，在同一视野下录制 30 秒视频。
    2. 重复上一步骤，直至完成五支肺小静脉的成像。
  5. 使用 460-490 nm 带通激发滤光片，根据血流发散模式识别一支肺小动脉。将血管置于视野中央，并录制 30 秒视频。
    1. 切换至 530-550 nm 带通激发滤光片，在同一视野下录制 30 秒视频。
    2. 重复上一步骤，直至完成五支肺小动脉的成像。
  6. 使用 460-490 nm 带通激发滤光片，定位一个未被较大血管穿过的肺泡和毛细血管区域，并录制 30 秒视频。
    1. 切换至 530-550 nm 带通激发滤光片，在同一视野下录制 30 秒视频。
    2. 重复上一步骤，直至完成五个毛细血管区域的成像。

7. 安乐死与清洁方案

  1. 将IVM平台从显微镜载物台上取下，并将异氟烷输送浓度调整为5%，持续5分钟以处死小鼠。
  2. 等待期间，丢弃盖玻片，并将成像窗口从平台断开。用小刷子清洁成像窗口，并使用30 G注射器插入通道，用蒸馏水反复冲洗数次。然后，使用真空泵以95%乙醇冲洗。
  3. 5分钟后，停止呼吸机，并通过颈椎脱位确保小鼠完全处死。

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结果

为了说明通过本方案可获得的结果，在成像前6小时采用鼻内滴注细菌脂多糖（LPS）模型诱导急性肺损伤（ALI）。简言之，小鼠（n = 3）以异氟烷麻醉后，将来自Pseudomonas aeruginosa的LPS无菌生理盐水溶液（10 mg/mL）以5 mg/kg剂量滴入左侧鼻孔。同时设置未处理小鼠（n = 3；无鼻内给药）作为对照。

成像后，可通过多个因素判断手术准备是否成功。肺组织应相对稳定，呼吸引起的周期性位移不应超过25 µm。肺泡应清晰可见，并可能表现出随呼吸周期的扩张与收缩。使用蓝光（波长450–490 nm）激发可观察到血流方向，甚至可能分辨出单个红细胞（补充视频1、补充视频3和补充视频5）。使用绿光（波长530–560 nm，补充视频2、补充视频4和补充视频6）激发时，白细胞可被清晰识别。在完成成像并移除负压窗口后，肺表面可能出现轻微瘀斑，但成像区域内...

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讨论

本文所述方案需要经过练习，并注意几个关键步骤。首先，在开始插管和手术之前，必须预先准备好成像窗口。使用极少量真空脂涂抹在成像窗口的外环，装上盖玻片，并用一滴蒸馏水测试负压吸力。提前准备好此装置，可防止在安装过程中暴露的肺组织干燥。虽然可以用温盐水冲洗，但这样做可能会损伤脆弱的肺组织。

插管后，在将小鼠转移至活体显微成像（IVM）平台的过程中，导管偶尔可能发生移位。为防止此情况，可考虑将导管绑在小鼠的前牙上，或将其缝合固定于口周皮肤。若采用压力控制通气，应全程密切监测潮气量，其值应稳定在约0.20 mL；若显著降低（例如约0.10 mL），可能提示单侧肺通气。一旦发生此情况，可轻微回撤气管导管以解决问题。使用吸入性麻醉剂（异氟烷）可在小鼠通气期间便于调控麻醉深度。其他实验室也曾采用其他麻醉方式（如静脉注射氯胺酮/赛拉嗪10,11），各类方法均有其相应的优缺点。

手术过程中采用钝性分离以尽量降低切断血管的风险。在分...

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披露

Kamala D. Patel 博士是 Luxidea 的总裁兼联合创始人，本实验所使用的成像窗即由该公司购得。

致谢

作者谨此感谢 Pina Colarusso 博士，她在本论文的编辑与修订过程中提供了重要的专业指导。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 mL BD 鲁尔滑动接头无菌一次性注射器Becton, Dickinson and Company3096591 mL 注射器
ADSON 敷料镊，尖端宽度 0.6 mm，齿长 11.5 mm，12 cmRWD Life Science Co.F12002-12钝头镊子
牛血清白蛋白-异硫氰酸荧光素Sigma-AldrichA9771-1GFITC-白蛋白
70% 体积比异丙醇酒精棉片Canadian Custom Packaging Company80002455酒精擦拭片
AVDC110 高级数字视频转换器Canopus00631069602029数字视频转换器
黑白 CCD 相机Horn ImagingBC-71相机
Bovie Deluxe 高温电灼套装Fine Science Tools18010-00电灼器
C57BL/6 小鼠Charles River Laboratories InternationalC57BL/6NCrlC57BL/6 小鼠
棉签Puritan806-WC棉签
CS-8R 8 mm 圆形玻璃盖玻片Warner Instruments64-0701玻璃盖玻片
数字压力计ITM Instruments Inc.DG2551L0NAM02L0IM&V数字压力计
Dr Mom Slimline 不锈钢 LED 耳镜Dr. Mom Otoscopes1001耳镜
95% 体积比乙醇Commercial AlcoholsP016EA9595% 乙醇
精细剪刀 - 马氏体不锈钢Fine Science Tools14094-11剪刀
Fisherbrand 彩色标签胶带Fisher Scientific1590110标签胶带
Gast DOA-P704-AA 高容量真空泵Cole-Parmer Canada CompanyZA-07061-40真空泵
Hartman 止血钳Fine Science Tools13003-10止血镊
高真空润滑脂Dow CorningDC976VF真空润滑脂
异氟烷 USPFresenius KabiCP0406V2异氟烷
1% 利多卡因盐酸盐注射液 50 mg/5 mLTeligent Canada0121AD011% 盐酸利多卡因
Lung SurgiBoardLuxidea, Inc.IMCH-0001专为肺部活体显微镜设计
矿物油Teva Canada00485802矿物油
小鼠经气管插管套装Kent Scientific CorporationETI-MSE插管支架、麻醉面罩、20 G 气管导管、光纤电缆
MST49 荧光显微镜Leica Microsystems10 450 022荧光显微镜
N Plan L 20x/0.40 长工作距离显微镜物镜Leica Microsystems56603520x 物镜
无纺纱布 2" x 2"AMD-RitmedA2101-CH纱布
Optixcare Eye Lube PlusAventix5914322人工泪液凝胶
Original Prusa i3 MK3S+ 3D 打印机Prusa ResearchPRI-MK3S-KIT-ORG-PEI3D 打印机
压缩氧气Linde Canada Inc.氧气
PrecisionGlide 针头 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm)Becton, Dickinson and Company30510630 G 针头
Pyrex 5340-2L 5340 过滤瓶，2000 mLCole-Parmer Canada Company5340-2L真空过滤瓶
罗丹明 6GSigma-Aldrich252433罗丹明 6G
Secure Soft 布质医用胶带 - 3"PrimedPM5-630709布质胶带
医用级硅胶管，内径 0.040 英寸，外径 0.085 英寸Dow Corning602-2051.0 mm 内径聚乙烯管
Somnosuite 低流量麻醉系统Kent Scientific CorporationSS-01, SS-04-module小型啮齿动物呼吸机、低流量麻醉系统、加热垫、直肠温度探头、脉搏血氧仪
组织镊，12.5 cm 长，弯曲，1 x 2 齿World Precision Instruments501216有齿镊
Transpore 医用胶带，1527-1，1 英寸 x 10 码 (2.5 cm x 9.1 m)3M7000002795医用胶带
透明管，内径 3/8 英寸Grainger CanadaUSSZUSA-HT33141.0 cm 内径聚乙烯管
Whatman 6720-5002 50 mm 在线过滤器，PTFE 材质，0.2 µmCole-Parmer Canada Company6720-5002在线 0.2µm 过滤器

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