一种新开发的带有氧化石墨烯窗口的微图案芯片，通过应用微机电系统技术制备而成，可实现对多种生物分子和纳米材料的高效、高通量低温电子显微镜成像。
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本文内容
摘要
摘要
利用低温电子显微镜（cryo-EM）对生物大分子进行高效、高通量结构分析的一个主要限制因素，是难以在纳米尺度上制备出具有可控冰层厚度的cryo-EM样品。通过应用微机电系统（MEMS）技术，已开发出一种基于硅（Si）的芯片，该芯片具有规则排列的微孔阵列，微孔上覆盖有氧化石墨烯（GO）窗口，并沉积在厚度可控的氮化硅（SixNy）薄膜上。该微图案化芯片的批量生产采用了紫外光刻、化学气相沉积、薄膜的湿法与干法刻蚀，以及二维纳米片材料的滴涂法。通过调节微孔的深度，可根据待分析样品的尺寸按需控制冰层厚度。氧化石墨烯对生物分子具有良好的亲和性，可在cryo-EM样品制备过程中将目标生物分子富集于微孔内部。这种带有氧化石墨烯窗口的微图案化芯片，可实现对多种生物分子以及无机纳米材料的高通量cryo-EM成像。
引言
冷冻电子显微镜（cryo-EM）已发展成为解析蛋白质天然状态下三维（3D）结构的重要技术1,2,3,4。该技术通过将蛋白质固定在一层薄薄的玻璃态冰（厚度为10–100 nm）中，并在液氮温度下使用透射电子显微镜（TEM）获取随机取向蛋白质的投影图像。通过采集数千至数百万张投影图像，并利用计算算法重构出蛋白质的三维结构5,6。为了实现cryo-EM的成功分析，样品制备过程已实现自动化，采用控制 blotting 条件、湿度和温度的 plunge-freezing 设备进行操作。将样品溶液加载到带有孔状碳膜的TEM载网上，依次进行blotting以去除多余液体，随后浸入液态乙烷中快速冷冻，形成薄而均匀的玻璃态冰1,5,6。随着cryo-EM技术的进步以及样品制备的自动化发展7，该技术已被广泛用于解析多种蛋白质结构，包括病毒包膜蛋白和细....
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方案
1. 带有氧化石墨烯窗口的微图案芯片的制备（图1）
- 沉积氮化硅。
- 采用低压化学气相沉积法（LPCVD），在830 °C、150 mTorr压力条件下，通入170 sccm二氯硅烷（SiH2Cl2，DCS）和38 sccm氨气（NH3），在硅片（直径4英寸，厚度100 µm）的两面沉积低应力氮化硅（SixNy）。
- 以约30 Å/min的沉积速率，通过调节沉积时间控制SixNy厚度在25–100 nm范围内。
注意：操作硅片时需格外小心，因为该硅片非常薄且易碎。在操作或装入设备过程中，避免弯曲硅片。
- 光刻胶图形化。
- 在已沉积SixNy的硅片表面涂布六甲基二硅氮烷（HMDS）溶液，用量足以覆盖整个硅片表面，使用匀胶机以3,000 rpm转速旋涂30秒，并在热板上95°C烘烤30秒，使硅片表面疏水，从而确保光刻胶（PR）的良好附着。
- 涂布正性光刻胶（材料表），用量足以覆盖整个硅片表面，以3,000 rpm转速....
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结果
通过MEMS制造工艺和二维氧化石墨烯（GO）纳米片转移技术，制备了带有GO窗口的微图案化芯片。微图案化芯片可实现批量生产，每片4英寸晶圆可制备约500个芯片（图1B 和 图2A、B）。在光刻过程中，通过使用不同设计的铬掩模，可灵活调控微图案化芯片的设计（图2）。所制备的微图案化芯片具有可控数量和尺寸的自支撑SixNy薄膜。自支撑SixNy薄膜的数量可控制在48个（6 × 8）至50个（5 × 10）之间，尺寸范围为50 × 40 μm2 至250 × 40 μm2（图3A、B、F、G）。每个自支撑SixNy薄膜上可分布数十至数百个微孔，微孔直径可定制，范围为2–.......
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讨论
本文介绍了用于制备具有石墨烯氧化物（GO）窗口的微图案化芯片的微加工工艺。所制备的微图案化芯片通过控制带有GO窗口的微孔深度，以调节玻璃态冰层的厚度，从而适应待分析材料的尺寸。该带有GO窗口的微图案化芯片采用一系列MEMS技术及二维纳米片转移方法制备而成（图1）。使用MEMS加工技术的主要优势在于其具备大规模生产的潜力，并且在光刻过程中可通过设计不同的铬掩模来灵活调控芯片的结构与尺寸（图2）。采用低压化学气相沉积（LPCVD）制备的低应力SixNy层可确保数十纳米厚的自支撑SixNy结构的稳定性23,24,25,26。然而，纳米尺度的自支撑SixN.......
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致谢
M.-H.K.、S.K.、M.L. 和 J.P. 感谢基础科学研究所（IBS-R006-D1 号资助）提供的经费支持。S.K.、M.L. 和 J.P. 感谢首尔国立大学创意开拓研究人员计划（2021 年）以及韩国政府（MSIT）资助的国家研究基金会（NRF）项目（NRF-2020R1A2C2101871 和 NRF-2021M3A9I4022936 号资助）的支持。M.L. 和 J.P. 感谢浦项钢铁科学奖学金（POSCO TJ Park 基金会）以及韩国政府（MSIT）资助的国家研究基金会（NRF）项目（NRF-2017R1A5A1015365 号资助）的支持。J.P. 感谢韩国政府（MSIT）资助的国家研究基金会（NRF）项目（NRF-2020R1A6C101A183 号资助）以及首尔国立大学工学院和医学院跨学科研究倡议项目（2021 年）的支持。M.-H.K. 感谢韩国政府（MSIT）资助的国家研究基金会（NRF）项目（NRF-2020R1I1A1A0107416612 号资助）的支持。作者感谢首尔国立大学大分子与细胞成像中心（SNU CMCI）的工作人员和技术团队在冷冻电镜实验中所付出的不懈努力和坚持。作者感谢国家大学间研究设施中心的 S. J. Kim 在聚焦离子束-扫描电镜（FIB-SEM）实验中提供的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1-甲基-2-吡咯烷酮（NMP） | Sigma Aldrich, USA | 443778 | |
| 丙酮 | |||
| 原子力显微镜（AFM） | Park Systems, South Korea | NX-10 | |
| 对准仪 | Midas System, South Korea | MDA-600S | |
| AZ 300 MIF 显影液 | AZ Electronic Materials USA Corp., USA | 184411 | |
| 冷冻电镜样品杆 | Gatan, USA | 626 单倾冷冻电镜样品杆 | |
| 冷冻投入仪 | Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA | Vitrobot Mark IV | |
| 聚焦离子束-扫描电子显微镜（FIB-SEM） | FEI Company, USA | Helios NanoLab 650 | |
| 电晕放电仪 | Ted Pella Inc., USA | PELCO easiGlow | |
| 氧化石墨烯（GO）溶液 | Sigma Aldrich, USA | 763705 | |
| 六甲基二硅氮烷（HMDS），98+% | Alfa Aesar, USA | 10226590 | |
| 低压化学气相沉积（LPCVD） | Centrotherm, Germany | LPCVD E1200 | |
| maP1205 正性光刻胶 | Micro resist technology, Germany | A15139 | |
| 氢氧化钾（KOH），片状 | DAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., South Korea | 6597-4400 | |
| 拉曼光谱仪 | NOST, South Korea | 共焦显微拉曼系统 HEDA | |
| 反应离子刻蚀机（RIE） | Scientific Engineering, South Korea | 自制 | |
| 扫描电子显微镜（SEM） | Carl Zeiss, Germany | SUPRA 55VP | |
| 硅片 | JP COMMERCE, South Korea | 4" 硅片，P(B)型，(100)，1-30 ohm·cm，DSP，厚度：100 μm | |
| 旋涂仪 | Dong Ah Trade Corp., South Korea | ACE-200 | |
| 透射电子显微镜（TEM） | JEOL, Japan | JEM-2100F |
参考文献
- Dillard, R. S., et al. Biological applications at the cutting edge of cryo-electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 24 (4), 406-419 (2018).
- Meyerson, J. R., et al. Self-assembled monolayers improve protein dis....
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重印与许可
