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方法文章

用于高通量低温电子显微镜的厚度可控微图案芯片的制备

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DOI：

10.3791/63739

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2022年4月21日

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical-Chemical Engineering, The Catholic University of Korea, 2Department of Biotechnology, The Catholic University of Korea, 3School of Chemical and Biological Engineering, and Institute of Chemical Processes, Seoul National University, 4Center for Nanoparticle Research, Institute of Basic Science (IBS), 5Institute of Engineering Research, College of Engineering, Seoul National University, 6Advanced Institutes of Convergence Technology, Seoul National University

本文内容

摘要

一种新开发的带有氧化石墨烯窗口的微图案芯片，通过应用微机电系统技术制备而成，可实现对多种生物分子和纳米材料的高效、高通量低温电子显微镜成像。

摘要

利用低温电子显微镜（cryo-EM）对生物大分子进行高效、高通量结构分析的一个主要限制因素，是难以在纳米尺度上制备出具有可控冰层厚度的cryo-EM样品。通过应用微机电系统（MEMS）技术，已开发出一种基于硅（Si）的芯片，该芯片具有规则排列的微孔阵列，微孔上覆盖有氧化石墨烯（GO）窗口，并沉积在厚度可控的氮化硅（SixNy）薄膜上。该微图案化芯片的批量生产采用了紫外光刻、化学气相沉积、薄膜的湿法与干法刻蚀，以及二维纳米片材料的滴涂法。通过调节微孔的深度，可根据待分析样品的尺寸按需控制冰层厚度。氧化石墨烯对生物分子具有良好的亲和性，可在cryo-EM样品制备过程中将目标生物分子富集于微孔内部。这种带有氧化石墨烯窗口的微图案化芯片，可实现对多种生物分子以及无机纳米材料的高通量cryo-EM成像。

引言

冷冻电子显微镜（cryo-EM）已发展成为解析蛋白质天然状态下三维（3D）结构的重要技术1,2,3,4。该技术通过将蛋白质固定在一层薄薄的玻璃态冰（厚度为10–100 nm）中，并在液氮温度下使用透射电子显微镜（TEM）获取随机取向蛋白质的投影图像。通过采集数千至数百万张投影图像，并利用计算算法重构出蛋白质的三维结构5,6。为了实现cryo-EM的成功分析，样品制备过程已实现自动化，采用控制 blotting 条件、湿度和温度的 plunge-freezing 设备进行操作。将样品溶液加载到带有孔状碳膜的TEM载网上，依次进行blotting以去除多余液体，随后浸入液态乙烷中快速冷冻，形成薄而均匀的玻璃态冰1,5,6。随着cryo-EM技术的进步以及样品制备的自动化发展7，该技术已被广泛用于解析多种蛋白质结构，包括病毒包膜蛋白和细胞膜上的离子通道蛋白8,9,10。病原性病毒颗粒包膜蛋白的结构研究对于理解病毒感染的病理机制，以及开发诊断系统和疫苗（例如引发COVID-19大流行的SARS-CoV-2）具有重要意义11。此外，近年来cryo-EM技术也被应用于材料科学领域，例如对电池中使用的电子束敏感材料12,13,14和催化体系14,15进行成像，以及对溶液状态下无机材料的结构进行分析16。

尽管冷冻电镜（cryo-EM）及相关技术已取得显著进展，但在冷冻样品制备方面仍存在局限性，限制了高通量三维结构分析的应用。制备具有理想厚度的玻璃态冰层对于获得生物材料的原子级分辨率三维结构尤为重要。冰层必须足够薄，以最大限度减少冰对电子散射产生的背景噪声，并防止生物分子在电子束路径上发生重叠1,17。然而，若冰层过薄，则可能导致蛋白质分子出现优势取向排列或发生变性18,19,20。因此，玻璃态冰的厚度应根据目标材料的尺寸进行优化。此外，通常需要大量工作来完成样品制备，并对制备好的透射电镜（TEM）载网上冰层质量和蛋白质完整性进行人工筛选。这一过程极为耗时，严重制约了高通量三维结构分析的效率。因此，提升冷冻电镜样品制备的可靠性与可重复性，将有助于推动冷冻电镜在结构生物学、商业化药物发现以及材料科学领域的更广泛应用。

本文介绍了用于制备具有氧化石墨烯（GO）窗口的微图案化芯片的微加工工艺，该芯片专为实现冰层厚度可控的高通量冷冻电镜（cryo-EM）而设计21。该微图案化芯片采用微机电系统（MEMS）技术制备，可根据成像需求调控芯片的结构与尺寸。带有GO窗口的微图案化芯片具有微孔结构，可用于装载样品溶液，并可通过调节微孔深度来控制玻璃态冰层的厚度。GO对生物分子具有强亲和力，可提高生物分子在成像区域的富集浓度，从而增强结构解析的效率。此外，该微图案化芯片由硅（Si）框架构成，为载网提供了良好的机械稳定性19，使其在样品制备及冷冻电镜成像过程中更易于操作。因此，采用MEMS技术制备的带有GO窗口的微图案化芯片可显著提升冷冻电镜样品制备的可靠性与可重复性，有助于实现高效、高通量的基于冷冻电镜的结构分析。

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方案

1. 带有氧化石墨烯窗口的微图案芯片的制备（图1）

  1. 沉积氮化硅。
    1. 采用低压化学气相沉积法（LPCVD），在830 °C、150 mTorr压力条件下，通入170 sccm二氯硅烷（SiH2Cl2，DCS）和38 sccm氨气（NH3），在硅片（直径4英寸，厚度100 µm）的两面沉积低应力氮化硅（SixNy）。
    2. 以约30 Å/min的沉积速率，通过调节沉积时间控制SixNy厚度在25–100 nm范围内。
      注意：操作硅片时需格外小心，因为该硅片非常薄且易碎。在操作或装入设备过程中，避免弯曲硅片。
  2. 光刻胶图形化。
    1. 在已沉积SixNy的硅片表面涂布六甲基二硅氮烷（HMDS）溶液，用量足以覆盖整个硅片表面，使用匀胶机以3,000 rpm转速旋涂30秒，并在热板上95°C烘烤30秒，使硅片表面疏水，从而确保光刻胶（PR）的良好附着。
    2. 涂布正性光刻胶（材料表），用量足以覆盖整个硅片表面，以3,000 rpm转速旋涂30秒，并在热板上100 °C烘烤90秒。旋涂后的光刻胶厚度为500 nm。
    3. 使用对准仪，通过铬掩膜版（图2A-D）以波长365 nm、强度20 mW/cm2的紫外光照射光刻胶涂层5秒。
    4. 使用显影液（材料表）显影1分钟，并将硅片浸入去离子水（DI水）中清洗两次。通过向硅片表面吹入N2气体彻底干燥经光刻胶图形化的硅片。
      注意：向硅片表面吹N2气体时需格外小心，因为硅片非常薄且易碎。切勿以高压垂直方向吹N2气体，以免导致硅片破裂。
  3. 氮化硅（SixNy）图形化。
    1. 在完成光刻胶图形化后，使用实验室自制的反应离子刻蚀机（RIE），以3 sccm六氟化硫（SF6）气体、50 W射频（RF）功率刻蚀暴露的SixNy。在此条件下刻蚀速率约为6 Å/s。根据所沉积SixNy层的厚度设定刻蚀时间。
      注意：刻蚀速率可能因所用RIE设备的具体参数而异，需在实验室内进行优化。
    2. 将经SixNy图形化的硅片浸入丙酮中，室温下浸泡30分钟以去除光刻胶，随后将硅片浸入去离子水中清洗两次。通过向硅片表面吹入N2气体彻底干燥硅片。
      注意：将硅片浸入或取出溶液时需格外小心，因为溶液的表面张力可能导致硅片破裂。切勿将硅片平行于液面浸入或取出。应使用碳纤维尖端的精密镊子操作硅片，避免用力夹持；先抬起硅片一侧，使其倾斜一定角度后再取出。若镊子夹持过紧，抬起时硅片弯曲可能导致破裂。
  4. 刻蚀硅（Si）。
    1. 在80 °C条件下，将KOH粉末溶于去离子水中，配制1.5 M的氢氧化钾（KOH）溶液。
    2. 将经SixNy图形化的硅片浸入KOH溶液中，刻蚀暴露的硅区域。持续搅拌，直至在图案化的SixNy对面观察到自由支撑的SixNy窗口。
      注意：湿法刻蚀时间因硅片厚度而异；对于100 µm厚的硅片，通常需要数小时。刻蚀过程中搅拌速度不宜过高，因为自由支撑的SixNy窗口非常薄且易碎，流体流动可能导致其破裂。本实验中搅拌速度设定为250 rpm。
    3. 将刻蚀后的硅片多次浸入去离子水浴中清洗，以去除刻蚀残留物。在空气中自然干燥硅片。
      注意：将经Si图形化的硅片浸入或取出溶液时需格外小心，因为自由支撑的SixNy窗口非常薄且易碎，可能因溶液表面张力而破裂。应以倾斜角度浸入或取出硅片，使硅片边缘首先接触或离开液面。
  5. 去除KOH刻蚀残留物。
    1. 用镊子轻轻按压芯片阵列的边界，获得可用于微图形化的芯片阵列（图1B）。
    2. 在80 °C条件下配制1.5 M KOH溶液并持续搅拌。
    3. 将芯片阵列浸入KOH溶液中30秒，并将其浸入去离子水中清洗两次。通过吹入N2气体彻底干燥芯片。
      注意：将芯片浸入溶液及用N2气体吹干时需格外小心，因为自由支撑的SixNy窗口非常薄且易碎。芯片浸入KOH溶液时应停止搅拌。芯片应以边缘首先垂直于液面方向浸入，并以平行方向吹入N2气体。
    4. 将芯片阵列在空气中自然干燥至少1小时。
  6. 光刻胶图形化。
    1. 准备一片空白的525 µm厚硅片作为固体支撑基底。按上述方法在硅片上旋涂HMDS和正性光刻胶，但在烘烤光刻胶前，将芯片阵列（自由支撑SixNy窗口面朝上）贴附于硅片上。光刻胶作为硅片与芯片阵列之间的粘合剂。将附有芯片阵列的硅片在热板上100 °C烘烤90秒。
    2. 按上述方法在芯片组上旋涂HMDS和正性光刻胶。
    3. 使用对准仪，通过铬掩膜版（图2E,F）以波长365 nm、强度20 mW/cm2的紫外光照射芯片组5秒。
    4. 使用显影液显影15秒，将芯片组浸入去离子水中清洗两次，并通过吹入N2气体彻底干燥经光刻胶图形化的芯片组。
  7. 制备微图形化的SixNy。
    1. 在完成光刻胶图形化后，使用实验室自制的RIE设备，以3 sccm SF6气体、50 W射频功率刻蚀SixNy。根据SixNy层的厚度控制刻蚀时间。
  8. 去除光刻胶。
    1. 将图形化的芯片组浸入60 °C的1-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）溶液中，静置过夜以去除光刻胶。将芯片组浸入去离子水中清洗两次，并通过吹入N2气体彻底干燥图形化的芯片组。
    2. 使用实验室自制的RIE设备，以100 sccm O2气体、150 W射频功率进行1分钟的O2等离子体处理，以去除残留的光刻胶。
  9. 清洗微图形化芯片。
    1. 在80 °C条件下配制1.5 M KOH溶液。
    2. 将微图形化芯片浸入KOH溶液中30秒，以彻底去除残留光刻胶，并将芯片浸入去离子水中清洗两次。通过吹入N2气体彻底干燥芯片。
    3. 将芯片在空气中自然干燥至少1小时。
  10. 采用滴涂法转移氧化石墨烯（GO）。
    1. 用去离子水将GO溶液（2 mg/mL）稀释至0.2 mg/L，并超声处理10分钟以打散GO片层的团聚体。将稀释后的GO溶液在300 x g条件下离心30秒。
    2. 使用辉光放电器（材料表）在15 mA条件下对微图形化芯片的硅刻蚀面进行辉光放电处理1分钟，使芯片表面带正电荷。
    3. 将3 µL GO溶液滴加至微图形化芯片的辉光放电处理面，静置1分钟。1分钟后，用滤纸吸去芯片表面多余的GO溶液。
    4. 用石蜡膜上制备的去离子水液滴清洗已转移GO的芯片，并用滤纸吸去芯片表面的去离子水。在GO转移面重复此操作2次，在另一面重复1次。在室温下自然干燥GO转移后的芯片过夜。
    5. 将带有GO窗口的微图形化芯片浸入去离子水中清洗，并用N2气体吹干。

2. 冷冻电镜成像

  1. 制备冷冻样品。
    1. 使用机械式冷冻投入仪制备冷冻样品（材料表），用于控制温度、湿度、压片时间及压力。将 blotting 垫片装入压片装置后，确保腔室内的湿度和温度分别维持在 100% 和 15 °C。
    2. 使用标准冷冻镊子夹取微图案化芯片，并将镊子装入冷冻投入仪中。取3 µL样品溶液，滴加至芯片的孔图案化一侧，底部带有石墨烯氧化物窗口。根据样品溶液的性质调节 blotting 时间和力度。
      注意：本实验中用于冷冻电镜成像的生物样本包括人免疫缺陷病毒（HIV-1）、铁蛋白、26S蛋白酶体、groEL、脱铁铁蛋白蛋白颗粒以及tau蛋白纤维。此外，还使用了多种无机材料，例如Fe2O3 纳米颗粒（NP）、金纳米颗粒、金纳米棒和二氧化硅纳米颗粒被用于冷冻电镜成像。针对不同类型的样品，在冷冻载网制备仪上设定了相应的滤纸吸附时间和压力。
    3. 印迹完成后，立即将载有样品的芯片浸入液态乙烷中进行骤冻。将芯片转移至液氮（LN₂）中的网格盒内2）并将其储存在液氮中2 冷冻电镜成像前
  2. 进行冷冻电镜成像。
    1. 将冷冻样品装载到温度维持在 -180 °C 的冷冻电镜载样杆上。
    2. 将冷冻电镜载样杆装入透射电子显微镜（TEM），并使用最小剂量系统（MDS）模式观察样品。

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结果

通过MEMS制造工艺和二维氧化石墨烯（GO）纳米片转移技术，制备了带有GO窗口的微图案化芯片。微图案化芯片可实现批量生产，每片4英寸晶圆可制备约500个芯片（图1B 和 图2A、B）。在光刻过程中，通过使用不同设计的铬掩模，可灵活调控微图案化芯片的设计（图2）。所制备的微图案化芯片具有可控数量和尺寸的自支撑SixNy薄膜。自支撑SixNy薄膜的数量可控制在48个（6 × 8）至50个（5 × 10）之间，尺寸范围为50 × 40 μm2 至250 × 40 μm2（图3A、B、F、G）。每个自支撑SixNy薄膜上可分布数十至数百个微孔，微孔直径可定制，范围为2–...

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讨论

本文介绍了用于制备具有石墨烯氧化物（GO）窗口的微图案化芯片的微加工工艺。所制备的微图案化芯片通过控制带有GO窗口的微孔深度，以调节玻璃态冰层的厚度，从而适应待分析材料的尺寸。该带有GO窗口的微图案化芯片采用一系列MEMS技术及二维纳米片转移方法制备而成（图1）。使用MEMS加工技术的主要优势在于其具备大规模生产的潜力，并且在光刻过程中可通过设计不同的铬掩模来灵活调控芯片的结构与尺寸（图2）。采用低压化学气相沉积（LPCVD）制备的低应力SixNy层可确保数十纳米厚的自支撑SixNy结构的稳定性23,24,25,26。然而，纳米尺度的自支撑SixN...

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致谢

M.-H.K.、S.K.、M.L. 和 J.P. 感谢基础科学研究所（IBS-R006-D1 号资助）提供的经费支持。S.K.、M.L. 和 J.P. 感谢首尔国立大学创意开拓研究人员计划（2021 年）以及韩国政府（MSIT）资助的国家研究基金会（NRF）项目（NRF-2020R1A2C2101871 和 NRF-2021M3A9I4022936 号资助）的支持。M.L. 和 J.P. 感谢浦项钢铁科学奖学金（POSCO TJ Park 基金会）以及韩国政府（MSIT）资助的国家研究基金会（NRF）项目（NRF-2017R1A5A1015365 号资助）的支持。J.P. 感谢韩国政府（MSIT）资助的国家研究基金会（NRF）项目（NRF-2020R1A6C101A183 号资助）以及首尔国立大学工学院和医学院跨学科研究倡议项目（2021 年）的支持。M.-H.K. 感谢韩国政府（MSIT）资助的国家研究基金会（NRF）项目（NRF-2020R1I1A1A0107416612 号资助）的支持。作者感谢首尔国立大学大分子与细胞成像中心（SNU CMCI）的工作人员和技术团队在冷冻电镜实验中所付出的不懈努力和坚持。作者感谢国家大学间研究设施中心的 S. J. Kim 在聚焦离子束-扫描电镜（FIB-SEM）实验中提供的协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）Sigma Aldrich, USA443778
丙酮
原子力显微镜（AFM）Park Systems, South KoreaNX-10
对准仪Midas System, South KoreaMDA-600S
AZ 300 MIF 显影液AZ Electronic Materials USA Corp., USA184411
冷冻电镜样品杆Gatan, USA626 单倾冷冻电镜样品杆
冷冻投入仪Thermo Fisher SCIENTIFIC, USAVitrobot Mark IV
聚焦离子束-扫描电子显微镜（FIB-SEM）FEI Company, USAHelios NanoLab 650
电晕放电仪Ted Pella Inc., USAPELCO easiGlow
氧化石墨烯（GO）溶液Sigma Aldrich, USA763705
六甲基二硅氮烷（HMDS），98+%Alfa Aesar, USA10226590
低压化学气相沉积（LPCVD）Centrotherm, GermanyLPCVD E1200
maP1205 正性光刻胶Micro resist technology, GermanyA15139
氢氧化钾（KOH），片状DAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., South Korea6597-4400
拉曼光谱仪NOST, South Korea共焦显微拉曼系统 HEDA
反应离子刻蚀机（RIE）Scientific Engineering, South Korea自制
扫描电子显微镜（SEM）Carl Zeiss, GermanySUPRA 55VP
硅片JP COMMERCE, South Korea4" 硅片，P(B)型，(100)，1-30 ohm·cm，DSP，厚度：100 μm
旋涂仪Dong Ah Trade Corp., South KoreaACE-200
透射电子显微镜（TEM）JEOL, JapanJEM-2100F

参考文献

  1. Dillard, R. S., et al. Biological applications at the cutting edge of cryo-electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 24 (4), 406-419 (2018).
  2. Meyerson, J. R., et al. Self-assembled monolayers improve protein distribution on holey carbon cryo-EM supports. Scientific Reports. 4, (2014).
  3. Palovcak, E., et al. A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).
  4. Xu, B. J., Developments Liu, L. applications, and prospects of cryo-electron microscopy. Protein Science. 29 (4), 872-882 (2020).
  5. Stewart, P. L. Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles. Wiley Interdisciplinary Reviews-Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (2), (2017).
  6. Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
  7. Darrow, M. C., et al. Chameleon: next generation sample preparation for cryoEM based on spotiton. Acta Crystallographica a-Foundation and Advances. 75, 424(2019).
  8. Hite, R. K., Tao, X., MacKinnon, R. Structural basis for gating the high-conductance Ca2+-activated K+ channel. Nature. 541 (7635), 52-57 (2017).
  9. Zhang, Y., et al. Cryo-EM structure of the activated GLP-1 receptor in complex with a G protein. Nature. 546 (7657), 248-253 (2017).
  10. Shaik, M. M., et al. Structural basis of coreceptor recognition by HIV-1 envelope spike. Nature. 565 (7739), 318-323 (2019).
  11. Liu, C., et al. The architecture of inactivated SARS-CoV-2 with postfusion spikes revealed by cryo-EM and cryo-ET. Structure. 28 (11), 1218-1224 (2020).
  12. Ren, X. C., Zhang, X. Q., Xu, R., Huang, J. Q., Zhang, Q. Analyzing energy materials by cryogenic electron microscopy. Advanced Materials. 32 (24), 1908293(2020).
  13. Li, Y. Z., et al. Atomic structure of sensitive battery materials and Interfaces revealed by cryo-electron microscopy. Science. 358 (6362), 506-510 (2017).
  14. Li, Y. B., Huang, W., Li, Y. Z., Chiu, W., Cui, Y. Opportunities for cryogenic electron microscopy in materials science and nanoscience. Acs Nano. 14 (8), 9263-9276 (2020).
  15. Kim, Y., et al. Uniform synthesis of palladium species confined in a small-pore zeolite via full ion-exchange investigated by cryogenic electron microscopy. Journal of Materials Chemistry A. 9 (35), 19796-19806 (2021).
  16. Baumgartner, J., et al. Nucleation and growth of magnetite from solution. Nature Materials. 12 (4), 310-314 (2013).
  17. Rice, W. J., et al. Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 38-44 (2018).
  18. D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747(2019).
  19. Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918(2019).
  20. Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).
  21. Kang, M. H., et al. Graphene oxide-supported microwell grids for preparing cryo-EM samples with controlled ice thickness. Advanced Materials. 33 (43), 2102991(2021).
  22. Johra, F. T., Lee, J. W., Jung, W. G. Facile and safe graphene preparation on solution based platform. Journal of Industrial and Engineering Chemistry. 20 (5), 2883-2887 (2014).
  23. Yang, C., Pham, J. Characteristic study of silicon nitride films deposited by LPCVD and PECVD. Silicon. 10 (6), 2561-2567 (2018).
  24. Olson, J. M. Analysis of LPCVD process conditions for the deposition of low stress silicon nitride. Part I: preliminary LPCVD experiments. Materials Science in Semiconductor Processing. 5 (1), 51-60 (2002).
  25. Zheng, B. R., Zhou, C., Wang, Q., Chen, Y. F., Xue, W. Deposition of low stress silicon nitride thin film and its application in surface micromachining device structures. Advances in Materials Science and Engineering. 2013, 835942(2013).
  26. Chuang, W. H., Fettig, R. K., Ghodssi, R. An electrostatic actuator for fatigue testing of low-stress LPCVD silicon nitride thin films. Sensors and Actuators a-Physical. 121 (2), 557-565 (2005).
  27. Shafikov, A., et al. Strengthening ultrathin Si3N4 membranes by compressive surface stress. Sensors and Actuators a-Physical. 317, 112456(2021).
  28. Ng, W. H., et al. Controlling and modelling the wetting properties of III-V semiconductor surfaces using re-entrant nanostructures. Scientific Reports. 8, 3544(2018).
  29. Han, D., et al. Nanopore-templated silver nanoparticle arrays photopolymerized in zero-mode waveguides. Frontiers in Chemistry. 7, 216(2019).
  30. Escobedo, C. On-chip nanohole array based sensing: a review. Lab Chip. 13, 2445-2463 (2013).

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