光诱导 原位 透射电子显微镜观察液体-软物质相互作用

摘要

本方案介绍了配备光照系统的透射电子显微镜（TEM）的改造方法、液体样品池的制备以及 原位 细菌细胞与光敏剂在光照下相互作用的透射电子显微镜观察。同时讨论了样品制备方法、电子束损伤及成像技术。

摘要

当前方案描述了透射电子显微镜（TEM）装置的改造方法，以用于 原位 光诱导现象观测。在物镜极靴上方的电子柱中插入一根玻璃光纤，并使用激光器作为可调节光源来构建该装置。在利用外部测量系统对光源进行校准后，可根据被观测过程的需求调节照明强度。该照明系统被用于成像抗菌光动力治疗现象，该领域目前正处于深入研究阶段。样品制备方法如下：将细菌悬浮液滴加至碳膜、石墨烯或氮化硅基底上，吸去多余溶液，随后滴加光敏剂溶液，再次吸去多余液体，最后用另一层基底或石墨烯薄膜封装形成液体池。成像实验过程包括：首先使用低倍率和最低电子剂量选择合适的观测区域，然后循环开启光源，在指定时间间隔内以尽可能少的电子剂量获取连续图像。由于所观测现象较为复杂，且该过程同时受光和电子共同驱动，因此必须准确记录每次曝光的电子剂量以及光照的时间和强度。实际实验完成后，还需进行额外的对照观测，即在不施加额外光照的条件下使用相同的电子剂量，以及在强光照下使用更低的电子剂量。该对照方法可有效区分生命科学和材料科学领域中由光诱导产生的微结构效应与电子束引起的效应。

引言

高分辨率下的光诱导现象在纳米工程^1,2,3、催化^4,5以及生物光子学⁶等多个领域均具有重要意义。文献中已报道了一些可用于此类实验的原创设计，包括对样品台的改进^1,4,7,8,9 以及显微镜上连接的光纤装置^10,11。

光照、液体环境与透射电子显微镜（TEM）相结合，为光诱导过程的详细动态研究提供了极佳的机会。然而，显微镜内部的高真空条件对许多液体（尤其是水溶液）极为不利。通过使用主要基于石墨烯¹²、氮化硅¹³或碳¹⁴基底的技术，可实现对液体的封装，从而使其免受环境影响。除了在材料科学领域的研究应用外²，这种所谓的液体池还为在接近天然状态下对生物样本进行非常规显微观察提供了可能¹⁵。此类观察极具挑战性，尤其针对如细菌细胞等活体微生物。电子束作为一种电离辐射，会对含水样本造成不可逆的损伤，因此必须严格限定电子剂量¹⁶。这是为了最大限度地减少不利影响、控制损伤程度，并避免产生令人误解的人工假象。目前，能够允许对活细胞进行观察的最大电子剂量仍存在争议¹⁶，但30 e⁻/nm²的剂量似乎是一个临界值，至少对于细菌而言是如此¹⁷。

此类显微研究的一些关注对象包括抗菌光动力疗法（APDT）过程中的变化¹⁸。简而言之，该疗法的实施过程如下：细菌细胞被一种称为光敏剂的光敏性液体包围。当以特定波长的光照射时，激发态的光敏剂分子通过能量或电荷转移，将溶液中天然存在的氧气转化为具有细胞毒性的活性氧物种（ROS）。暴露于ROS的病原体会被迅速高效地灭活，且无副作用¹⁹。不同微生物对该疗法的反应各异——例如，同一种光敏剂对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的作用可能显著不同²⁰。总体而言，已有研究证实ROS的主要靶点是细胞的外部结构，这些结构受损会导致细胞膜功能紊乱，进而导致细菌死亡^21,22。然而，核酸和蛋白质的损伤也可能导致微生物失活¹⁸，因此目前尚不清楚在此过程中哪些细胞结构是主要靶点¹⁹。深入理解这些损伤机制有助于优化这一治疗手段。与APDT研究中常用的光学显微技术相比²³，透射电子显微镜（TEM）技术能够以更高的分辨率和放大倍数观察APDT的作用机制²⁴。TEM已成功应用于治疗过程中细胞的观察，使我们能够研究革兰氏阳性菌的损伤情况，并详细描述细胞壁内部发生的变化^6,25。

本方案介绍了一种适用于利用透射电子显微镜（TEM）对光诱导细菌失活过程进行高分辨率成像的实验设置，该方法需要配备适当的光照系统、细胞液相封装技术以及严格的电子剂量控制。实验中所用细菌为Staphylococcus aureus ，并采用亚甲蓝溶液作为光敏剂。特殊的光照装置由可调谐半导体激光器通过光纤直接连接至显微镜镜筒构成。该设计使光纤几乎与显微镜轴平行排列，从而在整个样品上实现均匀照射。激光产生的高强度单色光可用于研究多种光化学效应。实验中使用的光波长为660 nm，因为在可见光范围内，亚甲蓝在613 nm和664 nm处具有吸收峰²⁶。液相封装方案基于碳基底材料，使操作过程快速且简便。最后，本文介绍了一种在液相环境中对细胞进行低剂量原位（in situ）TEM观测的方法。文中还讨论了样品制备中的难点、电子剂量对敏感样品的影响以及图像合理解读的相关问题。

方案

1. 透射电子显微镜的改造

1. 通过将光纤（参见材料表）连接到物镜顶部的镜筒位置，对透射电子显微镜进行改装。在物镜与聚光镜之间预留几厘米的空间，并保留一个用于配件的空闲插槽。
   注意：也可使用专用样品台⁴或反向配置的阴极荧光观测用样品台¹。
2. 使用粗真空泵检查系统是否存在泄漏。若系统未显示真空泄漏，则在高真空条件下测试系统。
   1. 检查真空系统的操作是否与标准放气状态下的显微镜启动流程一致。若模块在运行、组装或调试过程中出现问题，请联系授权服务人员或设备制造商。
      注意：正确制作并安装的照明装置不会遮挡电子束。若在显微镜运行过程中电子束持续偏移，说明非导电光纤未被金属屏蔽层充分覆盖，从而积聚了电荷。此时应将光纤向导电护套内部推入更深位置。
3. 使用光电二极管功率传感器（参见材料表）测量光强。若物镜极靴之间的空间不允许在显微镜内部进行测量，则测量样品与照明装置的几何结构，并在外置测量装置中复现相同条件。
4. 若显微镜未配备电子剂量测量系统，可通过法拉第杯（参见材料表）测量束流，并通过数值计算确定轰击样品的电子密度²⁷。

2. 用光敏剂包封细菌

1. 将两个未处理的透射电镜（TEM）载网（表面覆盖无定形碳）放置在两把交叉的镊子之间，碳膜面朝上。尽量靠近载网边缘夹持。
   注意：对于某些基底、溶液和样品组合，可能需要对一个或两个载网进行辉光放电处理，以去除出厂杂质并获得最大亲水性表面²⁸。以金黄色葡萄球菌（S. aureus）细菌和亚甲蓝溶液为例，研究发现，在未经额外辉光放电或等离子清洗的新铜网碳膜上，可获得最佳且最可重复的结果⁶。
2. 在其中一个载网上滴加 4 µL 细菌溶液。样品的光密度值必须在 5–10 范围内。
   注意：本研究中使用的细菌已从培养物中纯化，并分散于 PBS 缓冲液中。强烈建议每次使用新鲜样品时均检测细菌浓度，例如采用负染色法，并遵循已建立的实验方案^29,30,31。
3. 静置 60 秒，然后用滤纸小心吸去液体。在此过程中，尽量使液体均匀铺展至整个载网表面。
4. 在同一载网上滴加 4 µL 光敏剂。
   注意：本研究中使用浓度为 2 µg/mL 的亚甲蓝作为光敏剂。
5. 5 秒后，吸去液体，仅在基底上保留一层极薄的液膜。
6. 迅速将干燥的载网放置在覆盖液体的载网上方。
7. 轻轻将上方载网移至下方载网的边缘，并用镊子在边缘处挤压两个基底。
   注意：此阶段可能会有部分液体从样品中流出，表明液体未完全吸除。但这种情况并不一定意味着液相电池的形成会失败。
8. 小心地重复挤压操作。
   注意：可通过将镊子旋转 90°，使其垂直于实验台面，并保持两个镊子尖端处于相同高度（不随开合状态改变），从而更方便地完成此步骤。
9. 将液相电池在镊子间静置 1 分钟。
10. 制备完成后立即插入透射电镜样品杆中。
    注意：样品杆固定板/环的张力有助于基底贴合，并将液体保留在内部。
    1. 如条件允许，应将样品杆送入外部抽气站进行预抽气，以减少液体挥发对显微镜造成的污染。

3. 原位 液相透射电镜观察细菌细胞的电子剂量效应

1. 将样品插入显微镜中。
2. 以低倍模式开始观察，以找到合适的观察区域。
   注意：由于电子束散射，较暗的区域很可能是液体。
   1. 在观察过程中，应尽可能保持电子剂量最低。延长曝光时间（对于150 kV的加速电压和5,000倍的放大倍数，最长可达2秒）。对于底置相机而言，5,000倍的放大倍数（视场范围约为10 µm）足以对直径约为1 µm的细菌进行成像。
      注意：有时很难区分液体，因此在观察初期，将电子束聚焦在可能含有液体的区域会有所帮助。当电子束聚焦时，液体应会发生移动，并出现气泡。在确认液体存在后，需另寻其他区域进行后续观察。
3. 在适当的放大倍数下，结合延长的曝光时间，找到被液体包围的细胞，并立即捕获第一张图像。保持电子剂量恒定，每隔30秒采集一次图像，以观察细胞的变化。
4. 仔细检查图像，并计算对应于细胞中首次出现可见变化的总电子剂量²⁷。

4. 原位 细菌细胞与光敏剂之间光诱导过程的透射电子显微镜观察

1. 实验开始前，通过调节电流值来设定激光光强。根据光敏剂的吸收光谱选择合适的波长。依据之前的校准曲线图（步骤 1.4），选择对应最低光强的电流值。
   注意：本研究中使用的光波长为 660 nm。
2. 将样品插入显微镜，并按照前一节中的步骤 3.2 找到观察区域。
3. 在开始照射样品前，先拍摄细胞的首幅图像，并使用电子束快门关闭电子束，以避免电子辐照的影响。
4. 打开激光器。由于激光光强相对较高，起始照射时间应较短（此处为 30 s）。该时间结束后，关闭光源。
5. 关闭电子束快门并立即拍摄图像。如有可能，使用自动算法仅在拍摄图像所需的时间内暴露样品。仔细测量电子辐照时间，以计算成像所用的电子剂量²⁷。
6. 重复步骤 4.4 和步骤 4.5，以达到预期的光照时间。

结果

实验装置旨在以高分辨率观察液体中发生的光诱导过程。通过对图像进行对比分析，我们能够区分电子束造成的损伤与光化学反应引起的改变。电子束对敏感样品（本实验中为封装在液体中的细胞）的影响在整个辐照区域均可见，因为电子均匀地穿透了样品。当然，这种影响取决于电子剂量，因此使用更聚焦的电子束时，样品形貌的显著变化会更快出现。与这种严重的损伤相比，光动力失活的实际破坏效应仅出现在细胞的特定部位，且局限于被光照激活的光敏剂所包围的区域。

在细菌成像的示例中，根据文献报道，30 e⁻/nm² 的剂量似乎是细菌的致死阈值¹⁷，而作者此前的研究中所使用的剂量已远超该值^6,25。然而，在电子剂量达到 6000 e⁻/nm² 之前，并未观察到细胞的明显变化。结果显示，经过1分钟的光照后，光敏剂在光照下产生活性氧物种，导致细胞外层出现显著降解（

讨论

照明器的安装与调试需要基本的维修知识，且可能损坏显微镜。将光线引入显微镜最简单的方法是通过物镜上方连接光纤，该位置通常留有透射电子显微镜（TEM）偏转线圈和附加探测器的空间。在较早的顶入式设备中，该位置还可提供更多的自由空间，因为此处同时容纳了样品真空锁和样品安装机构。这种配置已在先前的一篇报告²⁵中广泛描述，其中包含一个典型的照明器设计示例。如果显微镜内部结构不允许在物镜上方安装光纤，则可从侧面将照明器安装于物镜极靴内部³²。其他解决方案包括使用专用样品台⁴，或反向使用阴极荧光观测所用的样品台¹。

通常情况下，液体样品的透射电子显微镜（TEM）制样过程较为复杂，需要经验与手工操作技能。液体池制备的关键步骤是本方案中的第2.6步。必须迅速放置第二片载网，以避免液体蒸发。本文介绍的方法简单，且无需使用非常见材料；但该方法可能并不适用于所有液体。在某些情况下，使用等离子体清洗基底以提高其亲水性是有...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
200目铜网碳膜载网	Agar Scientific	AGS160	用于观察和液体池制备的标准透射电镜载网
交叉式镊子	Dumont	N5	液体池制备所必需的镊子
光电二极管功率传感器	ThorLabs	S130C	用于光强测量的传感器
聚酰亚胺涂层多模光纤	Thorlabs	FG400UEP	必须根据10.1016/j.ultramic.2021.113388文献中现场制作的适配器将其集成到显微镜中
透射电子显微镜	Hitachi	H-800	可替换为任何侧向插入式显微镜，且可进行改装
可调谐二极管激光器	CNI	MRL-III-660D	光波长必须根据光敏剂的吸收光谱进行选择