本方案介绍了配备光照系统的透射电子显微镜（TEM）的改造方法、液体样品池的制备以及 原位 细菌细胞与光敏剂在光照下相互作用的透射电子显微镜观察。同时讨论了样品制备方法、电子束损伤及成像技术。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
当前方案描述了透射电子显微镜（TEM）装置的改造方法，以用于 原位 光诱导现象观测。在物镜极靴上方的电子柱中插入一根玻璃光纤，并使用激光器作为可调节光源来构建该装置。在利用外部测量系统对光源进行校准后，可根据被观测过程的需求调节照明强度。该照明系统被用于成像抗菌光动力治疗现象，该领域目前正处于深入研究阶段。样品制备方法如下：将细菌悬浮液滴加至碳膜、石墨烯或氮化硅基底上，吸去多余溶液，随后滴加光敏剂溶液，再次吸去多余液体，最后用另一层基底或石墨烯薄膜封装形成液体池。成像实验过程包括：首先使用低倍率和最低电子剂量选择合适的观测区域，然后循环开启光源，在指定时间间隔内以尽可能少的电子剂量获取连续图像。由于所观测现象较为复杂，且该过程同时受光和电子共同驱动，因此必须准确记录每次曝光的电子剂量以及光照的时间和强度。实际实验完成后，还需进行额外的对照观测，即在不施加额外光照的条件下使用相同的电子剂量，以及在强光照下使用更低的电子剂量。该对照方法可有效区分生命科学和材料科学领域中由光诱导产生的微结构效应与电子束引起的效应。
引言
高分辨率下的光诱导现象在纳米工程1,2,3、催化4,5以及生物光子学6等多个领域均具有重要意义。文献中已报道了一些可用于此类实验的原创设计，包括对样品台的改进1,4,7,8,9 以及显微镜上连接的光纤装置10,11。
光照、液体环境与透射电子显微镜（TEM）相结合，为光诱导过程的详细动态研究提供了极佳的机会。然而，显微镜内部的高真空条件对许多液体（尤其是水溶液）极为不利。通过使用主要基于石墨烯12、氮化硅
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 透射电子显微镜的改造
- 通过将光纤（参见材料表）连接到物镜顶部的镜筒位置，对透射电子显微镜进行改装。在物镜与聚光镜之间预留几厘米的空间，并保留一个用于配件的空闲插槽。
注意：也可使用专用样品台4或反向配置的阴极荧光观测用样品台1。 - 使用粗真空泵检查系统是否存在泄漏。若系统未显示真空泄漏，则在高真空条件下测试系统。
- 检查真空系统的操作是否与标准放气状态下的显微镜启动流程一致。若模块在运行、组装或调试过程中出现问题，请联系授权服务人员或设备制造商。
注意：正确制作并安装的照明装置不会遮挡电子束。若在显微镜运行过程中电子束持续偏移，说明非导电光纤未被金属屏蔽层充分覆盖，从而积聚了电荷。此时应将光纤向导电护套内部推入更深位置。
- 检查真空系统的操作是否与标准放气状态下的显微镜启动流程一致。若模块在运行、组装或调试过程中出现问题，请联系授权服务人员或设备制造商。
- 使用光电二极管功率传感器（参见材料表）测量光强。若物镜极靴之间的空间不允许在显微镜内部进行测量，则测量样品与照明装置的几何结构，并在外置测量装置中复现相同条件。
- 若显微镜未配备电子剂量测量系统，可通过法拉第杯（参见材料表）测量束流，并通过数值计算确定轰击样品的电子密度27。....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
实验装置旨在以高分辨率观察液体中发生的光诱导过程。通过对图像进行对比分析，我们能够区分电子束造成的损伤与光化学反应引起的改变。电子束对敏感样品（本实验中为封装在液体中的细胞）的影响在整个辐照区域均可见，因为电子均匀地穿透了样品。当然，这种影响取决于电子剂量，因此使用更聚焦的电子束时，样品形貌的显著变化会更快出现。与这种严重的损伤相比，光动力失活的实际破坏效应仅出现在细胞的特定部位，且局限于被光照激活的光敏剂所包围的区域。
在细菌成像的示例中，根据文献报道，30 e−/nm2 的剂量似乎是细菌的致死阈值17，而作者此前的研究中所使用的剂量已远超该值6,25。然而，在电子剂量达到 6000 e−/nm2 之前，并未观察到细胞的明显变化。结果显示，经过1分钟的光照后，光敏剂在光照下产生活性氧物种，导致细胞外层出现显著降解（
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
照明器的安装与调试需要基本的维修知识，且可能损坏显微镜。将光线引入显微镜最简单的方法是通过物镜上方连接光纤，该位置通常留有透射电子显微镜（TEM）偏转线圈和附加探测器的空间。在较早的顶入式设备中，该位置还可提供更多的自由空间，因为此处同时容纳了样品真空锁和样品安装机构。这种配置已在先前的一篇报告25中广泛描述，其中包含一个典型的照明器设计示例。如果显微镜内部结构不允许在物镜上方安装光纤，则可从侧面将照明器安装于物镜极靴内部32。其他解决方案包括使用专用样品台4，或反向使用阴极荧光观测所用的样品台1。
通常情况下，液体样品的透射电子显微镜（TEM）制样过程较为复杂，需要经验与手工操作技能。液体池制备的关键步骤是本方案中的第2.6步。必须迅速放置第二片载网，以避免液体蒸发。本文介绍的方法简单，且无需使用非常见材料；但该方法可能并不适用于所有液体。在某些情况下，使用等离子体清洗基底以提高其亲水性是有.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由波兰国家科学中心迷你项目资助（Miniatura 资助项目编号：2019/03/X/NZ3/02100）。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 200目铜网碳膜载网 | Agar Scientific | AGS160 | 用于观察和液体池制备的标准透射电镜载网 |
| 交叉式镊子 | Dumont | N5 | 液体池制备所必需的镊子 |
| 光电二极管功率传感器 | ThorLabs | S130C | 用于光强测量的传感器 |
| 聚酰亚胺涂层多模光纤 | Thorlabs | FG400UEP | 必须根据10.1016/j.ultramic.2021.113388文献中现场制作的适配器将其集成到显微镜中 |
| 透射电子显微镜 | Hitachi | H-800 | 可替换为任何侧向插入式显微镜，且可进行改装 |
| 可调谐二极管激光器 | CNI | MRL-III-660D | 光波长必须根据光敏剂的吸收光谱进行选择 |
参考文献
- Vadai, M., Angell, D. K., Hayee, F., Sytwu, K., Dionne, J. A. In-situ observation of plasmon-controlled photocatalytic dehydrogenation of individual palladium nanoparticles. Nature Communications. 9 (1), 1-8 (2018).
- Weng, B., et al.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
