建立胰腺癌斑马鱼患者来源异种移植模型用于化疗敏感性测试

摘要

临床前模型旨在增进对癌症生物学的认识并预测治疗效果。本文描述了利用肿瘤组织碎片建立基于斑马鱼的患者来源异种移植模型（zPDXs）的方法。对zPDXs进行化疗处理，并通过检测移植组织中细胞的凋亡情况来评估其治疗效果。

摘要

癌症是全球主要的死亡原因之一，且多种癌症的发病率持续上升。尽管在癌症筛查、预防和治疗方面已取得显著进展，但目前仍缺乏能够预测癌症患者化疗敏感性特征的临床前模型。为填补这一空白，一种 体内 建立并验证了基于斑马鱼的患者来源异种移植模型。 (Danio rerio) 受精后2天的胚胎，用作移植患者手术标本中肿瘤组织异种移植物片段的受体。

值得注意的是，为了维持对分析肿瘤行为及治疗反应至关重要的肿瘤微环境，活检样本未经过消化或分散处理。本方案详细描述了一种从原发性实体瘤手术切除组织建立基于斑马鱼的患者来源异种移植模型（zPDXs）的方法。经解剖病理学家筛选后，使用手术刀片对样本进行解剖，去除坏死组织、血管或脂肪组织，随后将其切割为 0.3 mm × 0.3 mm × 0.3 mm 的小块。

将组织块进行荧光标记后，异种移植到斑马鱼胚胎的卵黄周隙。该方法可低成本处理大量胚胎，实现高通量分析。 体内 对zPDXs进行多种抗癌药物的化疗敏感性分析。常规采集共聚焦图像，以检测和量化化疗处理组与对照组相比所诱导的细胞凋亡水平。该异种移植操作具有显著的时间优势，可在一天内完成，为开展共临床试验的治疗筛选提供了合理的时间窗口。

引言

临床癌症研究的问题之一在于，癌症并非单一疾病，而是一类可随时间演变的多种不同疾病，其治疗需根据肿瘤本身及患者的具体特征制定相应的个体化方案¹。因此，当前的挑战在于推动以患者为中心的癌症研究，以识别可用于早期预测癌症治疗效果的新型个体化策略²。这一点对于胰腺导管腺癌（PDAC）尤为关键，因为该类癌症治疗难度大，5年生存率仅为11%³。

胰腺导管腺癌（PDAC）的晚期诊断、快速进展以及缺乏有效疗法仍是目前最紧迫的临床问题。因此，主要挑战在于建立患者疾病模型，并鉴定可用于临床的生物标志物，以根据个体化医疗原则选择最有效的治疗方案^4,5,6。随着时间推移，已提出多种用于建模癌症疾病的新方法：源自人类肿瘤组织的患者来源类器官（PDOs）和小鼠患者来源异种移植瘤（mPDXs）。这些模型已被用于重现疾病，以研究治疗反应、耐药性以及疾病复发情况^7,8,9。

方案

所有所述动物实验均已获得意大利公共卫生部批准，符合欧盟关于动物使用与护理的 2010/63/EU 指令。本研究已获当地伦理委员会批准，注册编号为 70213。所有参与研究的受试者均签署了知情同意书。在开始实验前，应准备好所有溶液和设备（第 1 节），并完成鱼类的杂交（第 2 节）。

1. 溶液与设备的准备

注意：需配制的溶液和培养基详见表1。

1. 琼脂糖凝胶支撑
   1. 称取琼脂糖粉末置于可微波加热的烧瓶中，加入一定体积的E3斑马鱼培养基 配制成1%的凝胶。用微波炉加热至琼脂糖完全溶解。
      注意：切勿过度煮沸溶液。
   2. 将熔化的琼脂糖倒入培养皿中，静置至凝胶完全凝固。
   3. 使用剪去尖端的塑料巴斯德吸管制备小型琼脂糖圆柱体（高度约5 mm）。制备完成后，将其存放于培养皿中，用铝箔包裹后置于4 °C保存。
2. 玻璃微针
   1. 使用拉针仪将硼硅酸盐玻璃毛细管拉制成细针（设置参数：HEAT 990，PULL 550）。
      ​注意：一根毛细管可拉制出两根尖端直径为10 µm的细针。

结果

本方案描述了从原发性人胰腺导管腺癌建立斑马鱼患者来源的肿瘤移植模型（zPDX）的实验方法。按照方案第4节所述，采集肿瘤样本，将其切碎并用荧光染料染色。随后按照方案第5节所述，将肿瘤组织片段植入2天龄斑马鱼胚胎的卵黄周隙，成功建立了zPDX模型。如方案第6节所述，进一步对zPDX模型进行筛选，以鉴定患者来源癌细胞的化疗敏感性谱。例如，测试了FOLFOXIRI化疗方案（5-氟尿嘧啶、亚叶酸钙、奥沙利铂和伊立替康），因其被用作晚期胰腺导管腺癌以及转移性结直肠癌的一线化疗方案。采用共聚焦显微镜对zPDX样本进行整体成像，获取Z轴层扫图像，并按照方案第8和第9节所述分析细胞凋亡的诱导情况。如图1A、B所示，与对照组相比，联合治疗组细胞凋亡增加。在本案例研究中，与对照组相比，接受FOLFOXIRI治疗的移植异种移植物中凋亡细胞比例显著升高，差异具有统计学意义（图1C）。

讨论

体内肿瘤研究模型为理解肿瘤生物学和预测癌症治疗反应提供了宝贵的工具。目前已有多种体内模型可供选择，例如基因修饰动物（转基因小鼠和基因敲除小鼠）或来源于人类原代细胞的患者来源异种移植模型。尽管这些模型具有诸多优势，但各自仍存在一定的局限性。特别是上述模型缺乏可靠的方法来模拟患者肿瘤组织的微环境。

有研究表明，肿瘤微环境可能在药物反应中发挥多种重要作用¹⁸。因此，为了寻找一种能够维持肿瘤组织微环境的合适动物模型，研究人员开发了一种替代性的PDX模型，该模型将肿瘤组织碎片异种移植到2 dpf的斑马鱼胚胎中。本实验方案描述了如何在大量胚胎中进行异种移植，从而实现对单一药物或联合用药的高通量药物筛选。

这一创新方法的关键在于，与常用的单细胞悬液zPDX模型相比，它能够同时保留细胞间的相互作用以及肿瘤微环境。来自手术标本的胰腺导管腺癌（PDAC）组织会立即置于新鲜且低温的肿瘤培养基中，并被切割成小片段。生成zPDX模型的整体流程基于将患者肿瘤组织片段直接植.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5-氟尿嘧啶	Teva Pharma AG	SMP 1532755
48 孔多孔板	Sarstedt	83 3923
96 孔多孔板	Sarstedt	82.1581.001
丙酮	Merck	179124
琼脂糖粉末	Merck	A9539
两性霉素	Thermo Fisher Scientific	15290018
抗核抗体，克隆 235-1	Merck	MAB1281	1:200 稀释
水族网 QN6	Penn-plax	0-30172-23006-6
牛血清白蛋白（BSA）	Merck	A9418
CellTrace	Thermo Fisher Scientific	C34567
CellTracker CM-DiI	Thermo Fisher Scientific	C7001
CellTracker Deep Red	Thermo Fisher Scientific	C34565
裂解型 Caspase-3（Asp175）（5A1E）兔单克隆抗体	Cell Signaling Technology	9661S	1:250 稀释
二甲基亚砜（DMSO）	PanReac AppliChem ITW Reagents	A3672,0250
Dumont #5 镊子	World Precision Instruments	501985
亚叶酸 -  Lederfolin	Pfizer
玻璃毛细管，3.5"	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	外径 = 1.14 mm，内径 = 0.53 mm。
玻璃小瓶	VWR International	WHEAW224581
山羊抗兔 IgG （H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A-21244	1:500 稀释
山羊血清	Thermo Fisher Scientific	31872
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
伊立替康	Hospira
低温冷冻管	VWR International	479-1220
McIlwain 组织切片机	World Precision Instruments
微孔板混匀仪	SCILOGEX	822000049999
奥沙利铂	Teva
多聚甲醛	Merck	P6148-500G
PBS	Thermo Fisher Scientific	14190094
青霉素-链霉素	Thermo Fisher Scientific	15140122
100 mm 培养皿	Sarstedt	83 3902500
60 mm 培养皿	Sarstedt	83 3901
塑料巴斯德吸管	Sarstedt	86.1171.010
Poly-Mount 封片剂	Tebu-bio	18606-5
碘化丙啶	Merck	P4170
RPMI-1640 培养基	Thermo Fisher Scientific	11875093
10 号无菌不锈钢手术刀片	VWR International	SWAN3001
3 号手术刀柄	World Precision Instruments	500236
三卡因	Merck	E10521
Triton X-100	Merck	T8787
Tween 20	Merck	P9416
垂直微量移液器拉制仪	Shutter instrument	P-30