建立胰腺癌斑马鱼患者来源的异种移植物进行化学敏感性测试

临床癌症研究的一个问题是，癌症不是一种单一的疾病，而是可以随着时间的推移而演变的各种不同的疾病，需要根据肿瘤本身^{和患者的特点}进行特定的治疗1。因此，挑战在于转向以患者为导向的癌症研究，以便为癌症治疗结果的早期预测确定新的个性化策略²。这与胰腺导管腺癌（PDAC）尤其相关，因为它被认为是一种难以治疗的癌症，5年生存率为11%³。

诊断较晚、进展迅速、缺乏有效治疗仍然是PDAC最紧迫的临床问题。因此，主要的挑战是对患者进行建模并确定可在临床中应用的生物标志物，以选择符合个性化医疗^的最有效疗法4，^5，6。随着时间的推移，已经提出了新的方法来模拟癌症疾病:患者来源的类器官（PDO）和小鼠患者来源的异种移植物（mPDX）起源于人类肿瘤组织的来源。它们已被用于复制疾病以研究对治疗的反应和抵抗力，以及疾病复发⁷，^8，9。

同样，对基于斑马鱼的患者来源异种移植（zPDX）模型的兴趣也有所增加，这要归功于其独特且有前途的特性¹⁰，代表了癌症研究的快速和低成本工具^11，12。zPDX模型只需要很小的肿瘤样本量，这使得化疗的高通量筛选成为可能¹³。用于zPDX模型的最常见技术是基于原代细胞群的完整样品消化和植入，其部分复制肿瘤，但具有缺乏肿瘤微环境和恶性细胞与健康细胞之间串扰的缺点¹⁴。

这项工作展示了如何将zPDXs用作临床前模型来识别胰腺癌患者的化学敏感性特征。有价值的策略促进了异种移植过程，因为不需要细胞扩增，从而加速了化疗筛选。该模型的优势在于，所有微环境成分都保持原样，因为它们在患者癌症组织中，因为众所周知，肿瘤的行为取决于它们的相互作用^15，16。这比文献中的替代方法非常有利，因为它可以保持肿瘤异质性并有助于以患者特异性的方式提高治疗结果和复发的可预测性，从而使zPDX模型能够用于联合临床试验。这份手稿描述了制作zPDX模型所涉及的步骤，从一段患者肿瘤切除开始，然后对其进行治疗以分析对化疗的反应。

意大利公共卫生部根据关于动物使用和护理的指令2010/63 / EU批准了所有描述的动物实验。当地伦理委员会批准了这项研究，注册号为70213。从所有相关受试者获得知情同意。在开始之前，应准备好所有溶液和设备（第1节），并应将鱼穿过（第2节）。

1. 溶液和设备的准备

注:有关要制备的溶液和培养基，请参见 表1 。

1. 琼脂糖凝胶支持
   1. 称取琼脂糖粉末在微波炉烧瓶中，并将其溶解在给定体积的E3斑马鱼培养基中以制成1%凝胶。在微波炉中加热，直到琼脂糖完全溶解。
      注意:不要将溶液煮沸。
   2. 将融化的琼脂糖倒入培养皿中，等待凝胶完全凝固。
   3. 使用塑料巴斯德移液管制作小琼脂糖圆柱体（~5 mm高），尖端被切断。准备好后，储存在4°C的培养皿中，用铝箔包裹。
2. 玻璃微针
   1. 用拉拔器拉动硼硅酸盐玻璃毛细管以获得细针（设置:HEAT 990，PULL 550）。
      注意:从一个毛细管中，可以获得两个尖端直径为10μm的细针。

2. 鱼穿越和采卵

1. 如Avdesh等人所述，在组织植入前3天将成年鱼转移到繁殖池中，如Avdesh等人所述¹⁷。
2. 注意:建议男性与女性的比例为 1:1 或 2:3。鱼的密度应为每升水最多五条鱼。用屏障将男性和女性隔开过夜。
3. 第二天，移除屏障，让鱼交配。
4. 将鱼从养殖箱中取出并将它们放回其住房水箱中。
5. 通过细网将养殖池中的水倒入。将受精卵转移到带有E3斑马鱼培养基的培养皿中。
6. 用体视显微镜检查培养皿并丢弃浑浊的鸡蛋。将受精卵保存在28°C的新鲜E3斑马鱼培养基中。

3. 标本采集

注意:高压灭菌器镊子和手术刀手柄。

1. 即时处理
   1. 在4°C的10mL肿瘤培养基中收集肿瘤的手术标本（肿瘤标本直径范围为5mm至10mm）。将样品在4°C下从所需位置转移以进行立即处理。
2. 过夜存储（可选）
   1. 将手术肿瘤标本收集在10mL肿瘤培养基中，并将样品在4°C下储存过夜。
3. 储存在-80°C（可选，不推荐）
   1. 将样品储存在-80°C的低温小瓶中，其中含有补充有5%二甲基亚砜（DMSO）的肿瘤培养基。

4. 样品处理

注意:在无菌组织培养层流罩下执行步骤。

1. 用 5 mL 新鲜肿瘤培养基清洗整个肿瘤组织，使用塑料巴斯德移液管上下移液 10 次。吸出并丢弃洗涤介质。重复此步骤 3 次。
   注意:避免抽吸肿瘤组织，因为它可能会继续附着在塑料巴斯德移液器上。
2. 将样品转移到培养皿中，并将其浸没在1-2mL新鲜肿瘤培养基中。使用手术刀刀片将肿瘤样品切成小块（1-2 mm³），并将它们放入带有肿瘤培养基的无菌5 mL塑料管中。
3. 将麦克尔韦恩组织切碎器设置为 100 μm 厚度。将标本碎片放在直升机的圆形塑料桌上并切碎。将桌子旋转 90°，然后重复切碎。
4. 将碎片以300 ×g 离心3分钟。然后，小心地吸出上清液并将其丢弃。
5. 用荧光细胞示踪剂CM-DiI（Dulbecco磷酸盐缓冲盐水[DPBS]中的终浓度为10μg/ mL），深红（DPBS中的终浓度为1μL / mL）或CellTrace（DPBS中的终浓度为5μM）孵育片段30分钟，将管置于37°C水浴中。
6. 每 10 分钟轻轻上下移液一次，重悬碎片。
   注意:如果是CellTrace，请根据制造商的说明在孵育结束时添加含有至少1%蛋白质的培养基。
7. 以300× g 离心3分钟，弃去上清液。用 1 mL DPBS 重复此步骤 3 次以去除未掺入的染料。
8. 将片段悬浮在 60 mm 培养皿中的 5 mL DPBS 中。
   注意:确保纸巾不会变干。

5. zPDX的成立

注意:在无菌组织培养层流罩下执行步骤。

1. 在 E3 斑马鱼培养基中用 0.16 mg/mL 三卡因麻醉受精后 2 天 （dpf） 胚胎。
2. 将三个琼脂糖圆柱体（步骤1.1.3）放入培养皿中，并将斑马鱼胚胎放在圆柱体上，露出一侧。去除多余的溶液，将胚胎保持在薄膜中。
3. 用无菌镊子将染色组织从培养皿转移到胚胎躺着的1%琼脂糖载体上。拿起组织，将其放在胚胎卵黄的顶部，然后使用热拉玻璃微针将其推入周围空间（步骤1.2.1）。
4. 轻轻地将几滴E3 1%青霉素链霉素（Pen-Strep）滴入胚胎中，使其重新进入液体中。
5. 对所有胚胎重复步骤5.2-5.4，最后，从培养皿中取出琼脂糖载体并在35°C孵育胚胎。
6. 使用荧光体视显微镜在植入后2小时检查胚胎是否有正确的异种移植物（阳性染色）。丢弃带有不完全在围膜空间内的肿瘤碎片的胚胎，以及死亡的胚胎。将胚胎随机分布在六个多孔板中（最多n = 20个胚胎/孔），根据实验计划平均分成几组（例如，对照和FOLFOXIRI）。

6. 治疗

1. 将药物（例如 5-氟尿嘧啶、奥沙利铂、伊立替康）稀释到 E3 1% Pen-Strep 中，通过上下移液数次彻底混合。正如Usai等人所建议的¹²，相对于当量血浆浓度（EPC），在鱼水中使用五倍的药物稀释度。
2. 混合药物以制备鸡尾酒（例如，FOLFOXIRI）。
3. 从每个孔中取出培养基，并在植入后2小时加入药物鸡尾酒。
4. 治疗胚胎3天。每天更新药物鸡尾酒。

7. 全安装免疫荧光染色

注意:在开始之前，将丙酮置于-20°C并制备表1中列出的溶液。

1. 第一天:
   1. 用1mL的4%多聚甲醛在4°C的玻璃小瓶中固定幼虫过夜。
2. 第二天:
   1. 用1mL PBS洗涤幼虫3 x 5分钟，在实验室平台摇杆（400 rpm）上轻轻搅拌。
   2. 在-20°C下储存在1mL的100%甲醇中过夜（或长期储存）。
   3. 用 1 mL PTw（PBS 中的 0.1% 吐温）再水化 3 x 10 分钟，在实验室平台摇杆 （400 rpm） 上轻轻搅拌。
   4. 用1mL的150mM Tris-HCl在pH 8.8下在室温下透化5分钟，然后在70°C下加热15分钟。
   5. 用 1 mL PTw 洗涤 2 x 10 分钟，在实验室平台摇杆 （400 rpm） 上轻轻搅拌。
   6. 用1mL_dH2 O洗涤2 x 5分钟，在实验室平台摇杆（400rpm）上轻轻搅拌。
   7. 用1mL冰冷的丙酮在-20°C下透化20分钟。
   8. 用1mL_dH2 O洗涤2 x 5分钟，在实验室平台摇杆（400rpm）上轻轻搅拌。
   9. 用 1 mL PTw 洗涤 2 x 5 分钟，在实验室平台摇杆 （400 rpm） 上轻轻搅拌。
   10. 将幼虫在1mL封闭缓冲液中在4°C下孵育3小时，在实验室平台摇杆（400rpm）上轻轻搅拌。
   11. 将幼虫置于每组划分的孔板中，如下所示:96孔板中50μL体积/孔中的10个幼虫或48孔板中100μL体积/孔中的20个幼虫。
   12. 丢弃封闭缓冲液，将幼虫与在孵育缓冲液中稀释在4°C的孵育缓冲液中过夜的黑暗中孵育幼虫（400rpm）。有关建议的卷，请参阅步骤 7.2.11。
3. 第三天:
   1. 用 1 mL PBS-TS（10% 山羊血清，1% Triton X-100 在 PBS 中）依次洗涤幼虫 3 x 1 小时，然后用 1 mL PBS-T（1% Triton X-100 在 PBS 中）和 2 x 1 小时用 1 mL PBS-TS 洗涤幼虫。在每次洗涤中，在振动板（400rpm）上轻轻搅拌含有幼虫的板。
   2. 用荧光染料偶联的二抗（例如，山羊抗兔 IgG [H+L] 交叉吸附二抗，Alexa Fluor 647，1:500）和 100 μg/mL Hoechst 33258 在黑暗的孵育缓冲液中稀释过夜，在 4 °C 下孵育过夜，在摇床板上轻轻搅拌 （400 rpm）。二抗溶液的推荐体积见步骤7.2.11。
4. 第四天:
   1. 用1mL的PBS-TS洗涤3 x 1小时，用1mL的PTw洗涤2 x 1小时，在摇床板（400rpm）上轻轻搅拌。
   2. 在显微镜载玻片上用珐琅质（厚度~0.5-1毫米）形成圆形层。让牙釉质变干，将幼虫放在圆形层的中心，露出异种移植物的侧面。
   3. 干燥过量溶液，并用水溶性、无荧光的封片剂安装玻璃盖玻片。

8. 成像

1. 使用40倍物镜在共聚焦显微镜下捕获图像。使用以下采集参数:分辨率为 1024 x 512 像素，Z 间距为 5 μm。

9. 通过ImageJ分析细胞凋亡

1. 加载（斐济只是）ImageJ 软件 （https://imagej.net/Fiji/Downloads） 并打开 Z 堆栈文件映像（单击 "文件"|"打开）。在弹出窗口中，选择堆栈 查看/超堆栈 ，然后单击 确定。
2. 通过选择 "图像 |颜色 |使复合。
3. 拖动图像底部的 Z 栏以浏览 Z 堆栈图像并识别异种移植区域（荧光细胞追踪器阳性的细胞。参见步骤4.5）在斑马鱼周围空间。
4. 选择 点工具 并计数凋亡人类细胞的数量（对荧光细胞追踪器和裂解的半胱天冬酶-3呈阳性），如 补充视频S1所示。
5. 双击 点工具 图标，更改计数器，并计数人类细胞核（CM-DiI阳性细胞的细胞核）的总数。

该协议描述了从原发性人胰腺腺癌中建立zPDX的实验方法。收集肿瘤样品，切碎并使用荧光染料染色，如方案第4节所述。然后通过将一块肿瘤植入 2 个 dpf 斑马鱼胚胎的围膜空间成功建立 zPDX，如协议第 5 节所述。如方案第6节所述，进一步筛选zPDX以确定患者来源癌细胞的化疗敏感性谱。例如，测试了化疗组合 FOLFOXIRI（5-氟尿嘧啶、亚叶酸、奥沙利铂和伊立替康），因为它被用作晚期胰腺导管腺癌和转移性结直肠癌的一线化疗。在共聚焦显微镜上以Z堆栈的形式获取zPDX的全安装图像，并按照方案第8节和第9节所述分析细胞凋亡诱导。如图1A，B所示，与对照组相比，联合治疗导致细胞凋亡增加。在这里报告的案例研究中，与对照组相比，FOLFOXIRI处理组的植入异种移植物中凋亡细胞的比例在统计学上显着增加（图1C）。

表 1:协议中使用的溶液和培养基。

补充图S1:PDAC肿瘤样品被DiO染色（绿色）并异种移植到2个dpf斑马鱼胚胎的周围空间中。孵育3天后，向zPDX注射2μg/mL碘化丙啶（PI;红色），然后进行3D共聚焦成像。通过测量人类细胞总数（DiO阳性）中的PI阳性细胞来检查细胞活力。比例尺 = 100 μm。缩写:PDAC = 胰腺导管腺癌;DPF = 受精后天数;zPDX = 斑马鱼患者来源的异种移植物。请点击此处下载此文件。

补充视频S1:使用ImageJ的多点工具进行凋亡人类细胞计数的示例。 该视频是植入后 3 天 zPDX 的 Z 堆栈，在裂解半胱天冬酶-3 和 Hoechst 33258 免疫染色后获得。缩写:zPDX = 斑马鱼患者来源的异种移植物。 请点击此处下载此视频。

作者没有利益冲突需要声明。