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维持人胶质母细胞瘤的细胞多样性 离体 使用三维类器官培养

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DOI：

10.3791/63745

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2022年8月25日

 ,  ,  , 
1Department of Neurological Surgery, Cleveland Clinic, 2Cardiovascular and Metabolic Sciences, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic

通讯作者： Christopher G. Hubert <hubertc@ccf.org>

本文内容

摘要

在此，我们描述了一种从原代患者样本或患者来源的细胞培养物中生成胶质母细胞瘤（GBM）类器官并将其培养至成熟的方法。这些GBM类器官包含表型多样化的细胞群体，并可重建肿瘤微环境 离体.

摘要

胶质母细胞瘤（GBM）是最常见的原发性恶性脑癌，预后极差。肿瘤内部的细胞和分子异质性，以及肿瘤微环境之间复杂的相互作用，使得寻找有效治疗方法充满挑战。传统的贴壁培养或球体培养方法可能掩盖这些复杂性，而三维类器官培养则能够重现区域性的微环境梯度。类器官是一种三维GBM培养方法，能更好地模拟患者肿瘤的结构，包含表型多样化的细胞群体，并可用于中等通量的实验。尽管与传统培养方法相比，三维类器官培养更为耗时且劳动密集，但它具有独特优势，能够在现有的体外（in vitro）和体内（in vivo）系统之间架起桥梁。类器官已成为癌症生物学家研究肿瘤行为和耐药机制不可或缺的工具，其应用范围仍在不断扩大。本文详细介绍了生成和维持GBM类器官的方法，同时描述了如何使用冷冻和石蜡包埋技术进行类器官样本的包埋与切片，以及在类器官切片上开展免疫组织化学和免疫荧光染色的实验步骤建议，还包括总体类器官细胞活力的测定方法。

引言

胶质母细胞瘤（GBM）是最常见的原发性脑肿瘤，其预后极差，自确诊起中位生存期约为15个月1。在临床前研究中有效的治疗方法，往往在患者中疗效不佳2,3。临床疗效不佳归因于多种因素，包括GBM的微环境异质性以及复杂的瘤内相互作用。这些因素在实验室中使用传统的贴壁培养或球体培养方法难以重现4。GBM中存在一类具有自我更新能力的肿瘤干细胞（CSCs），也可能加剧了这种复杂性5,6。CSCs对肿瘤的增殖至关重要，可通过促进血管生成、肿瘤侵袭以及对放疗等治疗手段的耐受来维持肿瘤生长7,8,9。CSCs在肿瘤内的分布并不均匀，而是在特定的微环境区域富集，例如血管周围微环境和坏死周围区域，这些区域各自为CSCs的细胞状态提供独特的分子调控10,11,12,13,14。CSCs并非被动接受微环境信号，而是具备重塑自身微环境的能力7,15,16。CSC的微环境可在营养缺乏、pH变化和缺氧等压力条件下促进干细胞状态的维持17,18,19,20，提示这些条件在模型系统中的重要性。因此，重现肿瘤内多样化的细胞微环境对于理解治疗耐药机制并发现新的治疗策略至关重要。

近年来，三维培养技术的使用日益广泛21,22。类器官已被应用于其他类型的癌症研究，将其细胞维持在类器官状态的主要目的是支持异质性细胞群体的生长（其中许多细胞在更为均一的球状培养中通常会被竞争淘汰）以及实现空间多样性，这种多样性表现为具有遗传特异性的区域性肿瘤微环境4,23,24,25,26。目前存在多种用于癌细胞三维培养的方法，每种方法均有其优缺点27,28,29。类器官培养并非旨在取代传统的贴壁培养或球状培养，而是在需要深入探究细胞微环境与肿瘤细胞反应之间相互作用的特定科学问题时，作为二维培养方法的有力补充技术使用。

本文介绍了一种从原代患者样本或患者来源的培养物中可靠且可重复地生成胶质母细胞瘤（GBM）类器官的方法。我们针对三维类器官培养提出了 两个不同的目标：（1）从原代患者组织建立类器官，优先考虑最大化的细胞植入潜力，而不要求类器官的均一性；或（2）培养均一的类器官，以用于更定量的实验研究。在将原代标本建立为类器官时，无需进行单细胞过滤或细胞计数，因为保留最大数量和种类的细胞以建立初始培养是首要任务。然而，在为比较性实验培养类器官时，则需要进行单细胞过滤和细胞计数，以确保重复类器官之间的可比性，从而保证实验的一致性。本方案详细说明了如何建立类器官培养体系并生成均一类器官，同时还包括类器官包埋与保存的优化方法，以及标准的细胞培养实验操作，如免疫组织化学、免疫荧光染色和对GBM类器官总细胞活力的评估。

方案

以下详述的所有实验步骤均根据克利夫兰诊所机构审查委员会（IRB）协议第2559号和机构生物安全委员会（IBC）批准第1711号进行开发和实施。类球体和类器官在"Neurobasal完全培养基"（NBMc）中培养。具体操作说明见表1。

1. 制备类器官模具

  1. 取下聚四氟乙烯膜（Parafilm）片（约 4 cm × 4 cm）上的蜡纸，并将其置于两个无菌的 96 孔聚合酶链式反应（PCR）板之间。
    1. 在培养罩内执行这些步骤，并特别注意保持 "Parafilm 内侧"（即被蜡纸覆盖的一面）清洁。此清洁面应形成凹陷的凹面。
  2. 对上方的 96 孔 PCR 板施加均匀压力，使 Parafilm 上形成小凹坑。目标是使凹坑深度约为 2 mm，同时不刺穿 Parafilm 形成孔洞。
  3. 轻柔地分开两个 96 孔 PCR 板。带有凹坑的 Parafilm 将附着在上层板上。将其放置于干冰上约 30 秒。
  4. Parafilm 在干冰上放置 30 秒后，使用无菌镊子将其从上层 96 孔 PCR 板上剥离。
    1. 移除 Parafilm 时，应快速操作，而非过于 "小心"。冷冻的 Parafilm 比升温后的更容易剥离，后者可能导致凹坑翻转。
  5. 将制备完成的 Parafilm 模具放入一个加盖的无菌 10 cm 细胞培养皿中。若保持无菌状态，模具可预先制备并储存。

2. 患者组织样本的宏观解剖

  1. 在无菌培养皿（10 cm 细胞培养板）中，使用两把无菌剃须刀片在均匀施压的同时将患者标本仔细切碎。
    ​注意：在培养皿中加入约 500 µL NBMc 时切碎标本最为方便。应尽量使用剃须刀片将组织切至最细，理想情况下单个组织块应为 1 mm3 或更小。
  2. 使用剪口的 p1000 移液器吸头将切碎的肿瘤组织转移至 15 mL 离心管中。
    注意：在处理类器官时，务必仅使用剪口的 p1000 移液器吸头。这些吸头可用锋利剃须刀片切割至所需开口大小（约 5 至 8 mm），并进行高压灭菌。
  3. 加入 2 mL 室温（RT）细胞解离溶液（材料表），并将离心管置于 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育约 10 分钟。
    注意：每隔几分钟观察并混匀一次。不同细胞解离溶液或标本可能需要不同的孵育时间。若出现结块现象，提示可能因细胞裂解而释放 DNA，应立即进入下一步。
  4. 加入 8 mL NBMc 培养基以中和细胞解离溶液，并在 65 × g 条件下离心 3 分钟。
  5. 吸除上清液，并将组织重悬于 1–2 mL NBMc 培养基中。

3. 从原代患者组织生成类器官

注意：使用原代患者组织制备类器官的目标是建立三维培养体系。无需过滤获得单细胞或进行细胞计数，而应通过肉眼观察尽量使初始接种的细胞量保持均匀。初始类器官在生长和形成过程中存在异质性是正常现象。每个类器官体积为 20 µL（包含 16 µL 富含层粘连蛋白的细胞外基质（lrECM）和 4 µL 悬浮于 NBMc 中的组织，来自步骤 2.5）。可根据预期制备的类器官数量调整操作说明；通常目标是从原代患者样本中制备约 20–30 个类器官。

  1. 在冰桶或冷块中放置lrECM和一个小离心管。将适量的lrECM（16 µL × 预期类器官数量）加入小离心管中。
  2. 加入步骤 2.5 中适量的组织悬液 （4 µL × （预期的类器官数量）加入预冷的离心管中，置于冰上。
  3. 用移液器小心地将20 µL lrECM/细胞悬液混合物滴加到石蜡膜模具上，形成珍珠状液滴。
    1. 务必充分混匀lrECM/细胞悬液混合物；细胞在lrECM中容易快速沉降，导致类器官分布不均。
    2. 将 lrECM/细胞悬液混合物置于冰上。若 lrECM 温度升高，可能发生聚合，影响类器官形成。每处理两到三个类器官后，务必冷却移液枪头，以防止 lrECM 聚合。避免将气泡引入类器官中（避免 "双推" 移液器）。
  4. 将所需数量的类器官用移液枪接种至10 cm细胞培养皿中的石蜡膜模具上后，盖上培养皿盖，进行孵育 在37 °C、5% CO₂的细胞培养孵育箱中2 1-2 小时。
  5. 类器官凝固后，使用 NBMc 培养基将类器官从石蜡膜模具上轻轻冲洗下来，转移至新的无菌 10 cm 培养皿中，总体积为 20 mL NBMc 培养基。使用 p1000 移液器吸头冲洗类器官效果最佳；类器官将轻柔滑落。
    注意：当类器官从模具中冲洗到细胞培养板时，应在培养基中呈现为可见的小粉红色球体。如果类器官在培养基中出现解体或碎裂现象，表明之前存在lrECM过早聚合的问题，此时类器官仍可能生长，但大小将极难保持均一。
  6. 将10 cm培养皿置于37 °C、5% CO₂的细胞培养孵箱中2 静置培养4天（不摇动）。
    注意：在培养初期将类器官置于轨道摇床上可能导致其解体。请确保在第4天之前不要进行振荡。
  7. 4天后更换培养基，置于37 °C、5% CO₂的细胞培养孵育箱中，以80 rpm的速度在摇床上培养。2.
    1. 更换未成熟类器官的培养基具有挑战性，因为它们难以观察。将细胞培养皿倾斜，静置至少20秒，类器官会沉降至底部，此时可缓慢使用10–20 mL玻璃或塑料移液管移除上方的培养基。
    2. 需仔细观察类器官在底部的聚集情况；若在移除培养基时类器官因操作力度而悬浮搅动，最好暂停操作，待其重新沉降。随着类器官逐渐成熟且更易观察，该过程的操作难度将降低。
      注意：有时将一张黑色纸片放在细胞培养板下方有助于观察未成熟的类器官。建议不要使用带有真空吸力的巴斯德吸管来移除培养基，因为类器官很容易被吸入而丢失。
    3. 当类器官初次建立时，其培养基消耗速度不及成熟类器官。采用50%的培养基更换比例可减少不必要的培养基使用。 并降低在换液过程中意外损伤或吸除新生类器官的风险。

4. 从已建立的胶质母细胞瘤球状体、贴壁培养物或类器官培养物中生成类器官

注意：此处的目标是制备大小和细胞数量均一的类器官，用于比较实验，因此需使用单细胞过滤器并进行细胞计数以确保均一性。

  1. 从胶质母细胞瘤（GBM）球状培养物制备单细胞悬液。
    注意：GBM细胞的球状培养物在NBMc培养基中维持。
    1. 将球状体放入15 mL离心管中，在120 × g 条件下离心5分钟。
    2. 弃去上清液，加入2 mL室温细胞解离液，置于37 °C培养箱中孵育3分钟。
    3. 加入8 mL NBMc培养基以中和细胞解离液。通过单细胞过滤器（70 µm）过滤，然后在120 × g 条件下离心5分钟。
    4. 弃去管中上清液，将剩余细胞重悬于约1 mL NBMc培养基中。计数细胞（使用细胞非渗透性染料），然后跳至步骤4.4。
  2. 从GBM贴壁培养物制备单细胞悬液。
    1. 移除培养板中的旧培养基，向板中加入2 mL室温细胞解离液，置于37 °C培养箱中孵育3分钟。
    2. 在显微镜下确认细胞已从培养板上脱离。
    3. 加入8 mL NBMc培养基以中和细胞解离液。通过单细胞过滤器（70 µm）过滤。
      注意：在处理贴壁培养物时，单细胞过滤为可选步骤。
    4. 在120 × g 条件下离心5分钟。弃去上清液，将剩余细胞重悬于约1 mL NBMc培养基中。计数细胞（使用细胞非渗透性染料），然后跳至步骤4.4。
  3. 从GBM类器官培养物制备单细胞悬液。
    1. 使用剪口的p1000移液枪头将类器官转移至10 cm培养皿中，并小心尽可能去除残留培养基。
    2. 使用两把无菌剃刀小心将类器官充分切碎。用剪口的p1000枪头将切碎的类器官转移至15 mL离心管中，加入约2–3 mL NBMc培养基。
    3. 在120 × g 条件下离心3分钟，弃去上清液（建议使用移液枪头而非真空抽吸完成此步骤）。
    4. 加入2 mL冷的细胞解离液，孵育10分钟。
      注意：细胞解离液应直接从4 °C取出使用，不得预先加热。这有助于软化残留的Matrigel并提高细胞回收率。
    5. 随后转移至37 °C培养箱中孵育10–20分钟，每隔几分钟观察并轻轻混匀。若出现细胞聚团（可能提示细胞裂解），应立即进入下一步。
    6. 加入8 mL NBMc培养基以稀释细胞解离液。通过单细胞过滤器（70 µm）过滤，并在120 × g 条件下离心5分钟。
    7. 弃去管中上清液，将剩余细胞重悬于约1 mL NBMc培养基中。计数细胞（使用细胞非渗透性染料），然后进入步骤4.4。
  4. 由单细胞悬液生成类器官
    1. 在冰桶或冷块上放置lrECM和一个小离心管。将适量lrECM（16 µL × 预期类器官数量）加入小离心管中。
    2. 配制细胞混合液，总体积为（4 µL × 预期类器官数量），确保每类器官含20,000个细胞，并将此混合液加入含lrECM的冰上小离心管中。
    3. 小心地将20 µL lrECM/细胞悬液混合物滴加至Parafilm模具上，形成珍珠状液滴。
      1. 务必充分混匀lrECM/细胞悬液混合物，因为细胞易在lrECM中沉降，否则将导致类器官异质性。
      2. 保持lrECM/细胞悬液混合物处于冰上。若lrECM温度升高，可能发生聚合，影响类器官形成。
      3. 每制备两到三个类器官后应冷却移液枪头，防止lrECM聚合。避免将气泡引入类器官中（避免"双次按压"移液枪头）。
    4. 当所需数量的类器官已滴加至10 cm培养皿中的Parafilm模具上后，置于细胞培养箱中37 °C孵育1–2小时。
    5. 类器官固化后，使用NBMc培养基轻轻冲洗，使其从Parafilm模具上脱离，并转移至含20 mL NBMc培养基的新无菌10 cm培养皿中。使用p1000枪头冲洗类器官效果最佳；类器官将平滑滑落。
      注意：建议每10 cm培养皿中放置约15–20个类器官。
    6. 将10 cm培养皿放入培养箱中（不摇动），培养4天。
    7. 4天后更换培养基，并将培养皿置于细胞培养箱内的轨道摇床上，以80 RPM振荡。此后每2–3天更换一次培养基。
      1. 更换未成熟类器官的培养基较为困难，因其难以观察。可倾斜培养皿并静置至少20秒，使类器官沉降至底部，随后用大口径玻璃移液管缓慢吸除上方培养基。
      2. 需仔细观察类器官在底部的聚集情况；若因吸液力度导致类器官被搅动，应暂停操作并等待其重新沉降。随着类器官成熟并更易观察，该过程将变得简单。
        注意：有时可在培养皿下方放置一张深色纸张以帮助观察未成熟类器官。切勿使用带有真空抽吸的巴斯德移液管去除培养基，因极易导致类器官被吸入而丢失。
      3. 类器官刚建立时，其培养基消耗速度低于成熟类器官。建议初始采用50%换液量，以 减少不必要的培养基消耗，并降低在换液过程中意外损伤或吸走新生类器官的风险。

5. 冷冻包埋

  1. 将每个类器官放入含有1 mL 4%多聚甲醛（PFA）的单独1.5 mL离心管中（使用剪去尖端的p1000枪头）。于4 °C条件下过夜保存。若需将类器官包埋于石蜡中，请继续进行第6步。
  2. 在4% PFA中固定过夜后，用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤类器官三次。
  3. 将类器官转移至新的1.5 mL离心管中（使用剪去尖端的p1000移液枪头），管内含1 mL去离子水中配制的30%蔗糖溶液，并于4 °C过夜保存。
  4. 向冷冻模具中加入少量（通常为1–2 mL）最佳切割温度化合物（OCT），覆盖模具底部并填充模具深度的约1/3至1/2。
  5. 使用剪去尖端的p1000移液枪头将单个类器官转移至冷冻模具中。此过程会不可避免地带入少量培养基。使用更小的移液枪头小心吸除类器官周围的培养基，避免扰动类器官。
    注意：此步骤可能难以直观观察，但缓慢移液时可明显感受到培养基与OCT之间的密度差异，因此在一定程度上需“凭手感”操作""）。
  6. 将冷冻模具置于干冰托盘上。OCT将开始冻结，并在此过程中变为不透明。
  7. 继续添加OCT，完全覆盖类器官，并填满冷冻模具的剩余空间。制备好的组织块可在-20 °C短期保存数天，或在-80 °C长期无限期保存。

6. 石蜡包埋

  1. 根据类器官大小进行分选（小型类器官直径小于3 mm，大型类器官直径大于3 mm）。使用剪去尖端的p1000移液器吸头将每个类器官转移至组织学包埋盒中，并根据表2或表3的流程进行石蜡包埋。
    注意：组织学包埋盒的尺寸和结构由使用者自行决定。
  2. 将类器官从包埋盒转移至包埋模具中，加入1–2 mL熔化的石蜡，冷却至石蜡呈半固态。
  3. 当石蜡部分凝固后，在模具顶部再添加适量石蜡。将标记好的包埋盒盖置于模具上方，并转移至冷台。继续冷却直至石蜡完全凝固。
  4. 石蜡完全凝固后，使用切片机对组织块进行切片。或者，可将组织块在室温或4 °C条件下储存，以备后续切片使用。

7. 免疫荧光（IF）

  1. 使用载玻片染色缸，按照以下步骤对5-12 μm厚的石蜡包埋组织切片进行脱蜡和水化。
    注意：若使用OCT包埋类器官的切片，建议采用12 μm厚度的切片。通过在PBS中震荡载玻片30分钟去除OCT，然后直接跳至步骤7.2。
    1. 在二甲苯中孵育5分钟，重复三次。然后在100%乙醇中孵育10分钟，重复一次。
    2. 在95%乙醇中孵育10分钟，重复一次。用蒸馏水清洗切片两次，每次5分钟。
  2. 抗原修复时，将载玻片浸入1x柠檬酸抗原修复液（材料表）中，于微波炉中加热至接近沸腾温度10分钟。注意避免溶液沸腾。
    注意：建议先以高火加热约2分钟至溶液开始沸腾，随后降低功率并密切观察，防止溶液溢出。理想的抗原修复温度略低于100 °C，最佳为98 °C。
  3. 在室温下，将载玻片置于同一1x柠檬酸抗原修复液中冷却30分钟。
    注意：此处使用的是相同的1x柠檬酸溶液，此步骤无需更换溶液。
  4. 用蒸馏水清洗载玻片两次，每次5分钟。
  5. 用1x TBST（含0.1% Tween 20的Tris缓冲盐水）缓冲液清洗载玻片5分钟。
  6. 从TBST中取出载玻片，使用实验室擦拭纸小心擦干组织周围区域，注意避免组织切片干燥。待载玻片充分干燥后，用疏水屏障笔在组织周围画圈。
  7. 每张切片加入100-400 µL的10%血清封闭液，在室温下封闭1小时。封闭液的选择应根据二抗来源决定。例如，若二抗来源于驴，则使用10%正常驴血清溶于1x TBST中作为封闭液。
  8. 去除封闭液后，向每张切片加入100-400 µL用封闭液稀释至所需浓度的一抗溶液。
  9. 在4 °C条件下，将切片与一抗孵育过夜。
  10. 去除一抗溶液，用1x TBST清洗载玻片三次，每次5分钟。
  11. 向每张切片加入100-400 µL二抗溶液（按1:1000比例用封闭液稀释，或根据制造商说明操作），在室温下孵育1.5小时。
  12. 用1x TBST清洗载玻片两次，每次5分钟；然后用1x PBS清洗一次，每次5分钟。
  13. 从PBS中取出载玻片，用实验室擦拭纸小心擦干组织周围。滴加数滴液态固化封片剂，小心加盖盖玻片。待载玻片完全干燥后，置于-20 °C避光保存，直至进行成像分析。

8. 免疫组织化学

  1. 使用载玻片染色缸对石蜡包埋的组织切片进行脱蜡和水化，步骤如下：
    注意：若使用OCT包埋类器官的切片，需将载玻片在PBS中振荡30分钟以去除OCT，随后直接跳至步骤8.2。
    1. 在二甲苯中孵育5分钟，重复两次。
    2. 在100%乙醇中孵育10分钟，再重复一次。
    3. 在95%乙醇中孵育10分钟，再重复一次。
    4. 用蒸馏水清洗切片，每次5分钟，共两次。
  2. 抗原修复时，将载玻片浸入1×柠檬酸抗原修复液中，微波加热至接近沸腾温度10分钟，注意避免溶液沸腾。
  3. 在室温下于1×柠檬酸抗原修复液中冷却载玻片30分钟。
  4. 用蒸馏水清洗载玻片，每次5分钟，共三次。
  5. 在3%过氧化氢中孵育载玻片10分钟。
  6. 用蒸馏水清洗载玻片两次，每次5分钟。
  7. 用1× TBST清洗载玻片5分钟。
  8. 将载玻片从1× TBST中取出，用实验室擦拭纸的角落小心擦干组织切片周围的液体。
  9. 待载玻片干燥后，使用疏水屏障笔在组织切片周围画圈。
  10. 在疏水屏障圈内的每个切片上加入100–400 µL封闭液，在室温下孵育1小时。可使用10%正常驴血清（NDS）或0.75%牛血清白蛋白（BSA）溶于1× TBST中配制封闭液。
  11. 随后吸除封闭液，并在每个切片上加入100–400 µL一抗。使用厂家推荐的稀释液将一抗稀释至所需浓度。
  12. 4 °C孵育过夜。移除一抗溶液后，用1× TBST清洗载玻片，每次5分钟，共三次。
  13. 在每个切片上加入100–400 µL免疫组化检测试剂，在室温下孵育1小时。根据所使用的一抗选择相应的免疫组化检测试剂。
  14. 每个切片用1× TBST清洗两次，每次5分钟，随后用1× PBS清洗一次，每次5分钟。
  15. 根据厂家说明书配制3,3-二氨基联苯胺（DAB）溶液。在每个组织切片上加入100–400 µL DAB溶液，并在显微镜下密切观察。通常1–10分钟即可获得理想的染色强度；请记录此时间，并确保所有组织切片染色时间保持一致。
  16. 达到理想染色强度后，将载玻片浸入蒸馏水中终止反应。
  17. 根据表4中的说明进行苏木精复染及载玻片脱水，以备封片。
  18. 将载玻片从二甲苯替代物（材料表）中取出，用实验室擦拭纸擦去组织切片周围的多余液体。滴加少量永久性封片剂，盖上盖玻片并使其自然干燥。

9. 总细胞活力的测定

  1. 将每个类器官转移至一个 2 mL 离心管中，并使用小枪头小心吸除类器官周围的所有多余培养基（该操作的示意图见图3）。
    注意：细胞活力检测必须使用由相同数量细胞生成的类器官进行。本实验不应使用直接来自手术患者样本、通过切割已形成类器官获得的类器官，或其他未经过滤和计数单细胞的情况制备的类器官。
  2. 将发光法细胞活力检测试剂与 1× PBS 按 1:1 比例配制，每管加入 500 µL。
  3. 使用 p1000 枪头剧烈吹打混匀以破碎类器官，静置 5 分钟。此时类器官应已部分解离并变软；再次使用 p1000 枪头进行混合。
  4. 目标是使 96 孔板每孔总体积为 100 µL。取步骤 9.3 中的混合液 25 µL（足以进行多个技术重复），再加入 75 µL 剩余的发光法细胞活力检测试剂与 PBS 混合液。
  5. 将板置于摇床上震荡 2 分钟，随后在室温下孵育 20 分钟。
  6. 使用酶标仪的发光模式读板并收集数据（见图4）。

结果

图1 显示了通过10倍光学显微镜观察到的类器官早期生长情况。图1A 显示了单个细胞从中部视野穿过lrECM发生迁移和侵袭。细胞将持续扩展并“定植”于lrECM中，肉眼观察下会逐渐变得更为致密，最终呈不透明状。图1B 显示了多个成熟的类器官（培养7周后）在无放大情况下的大小，相对于一枚十分硬币的尺寸。

图2展示了胶质母细胞瘤类器官中磷酸化组蛋白H3的免疫组织化学染色结果，该蛋白是活跃增殖的标志物。与类器官核心区域相比，增殖最活跃的细胞主要位于类器官的周边区域。阳性染色呈现棕褐色/铜色外观。

图3 描述了使用一种针对3D培养物的荧光细胞活力检测法，对胶质母细胞瘤类器官进行均质化处理并测定总细胞数的流程。由于胶质母细胞瘤类器官中细胞数量较多，需首先将较大的类器官结构在荧光检测试剂中通过吹打重悬的方式进行均质化处理。随后，取部分总体裂解液分别加入各个孔中，并在孵育及使用合适的多孔板读板仪检测前，加入额外的荧光检测试剂进行稀释。

图4展示了类器官的DMSO（常用溶剂）对照数据。所绘制的数据表明类器官内部及类器官之间的结果具有一致性。在生成实验数据时，发光法检测的存活率数据通常会以每个样本的对照组为基准进行归一化处理。

显微镜下真菌生长；硬币大小比较，示意图；真菌形态与大小研究。
图 1：光学显微镜下视野（10倍）。（A）早期类器官生长，显示胶质母细胞瘤细胞在富含层粘连蛋白的细胞外基质中迁移/侵袭。（B）成熟类器官与一角硬币大小的比较。请点击此处查看此图的放大版本。

组织学切片、染色组织、显微分析、细胞结构、放大插图
图 2：胶质母细胞瘤类器官的免疫组织化学分析。 （A、B）胶质母细胞瘤类器官显示磷酸化组蛋白 H3 染色细胞，提示活跃增殖。A 和 B 的比例尺分别为 600 µm 和 300 µm。 请点击此处查看该图的高清版本。

类器官活力检测示意图：培养、吹打分散、试剂稀释、发光信号测定。
图3：类器官发光法细胞活力检测流程。（A）将单个类器官转移至小型离心管中，并吸除多余培养基。（B）向每管中加入500 µL 1:1 PBS与发光法细胞活力检测试剂的混合液，用力吹打以解离类器官。（C）向96孔板的每个孔中加入25 µL上述类器官混合液和75 µL相同的1:1 PBS与发光法细胞活力检测试剂混合液。（D）置于摇床上震荡2分钟，随后在室温下孵育20分钟，然后使用酶标仪读取发光信号。该图使用BioRender.com制作。请点击此处查看此图的放大版本。

类器官在0.1% DMSO中的细胞活力图；相对光单位数据分析。
图4：细胞活力。 四个患者样本中每个样本四个类器官的技术重复六次，在0.1%二甲基亚砜（DMSO）条件下的类器官细胞活力数据。请点击此处查看该图的放大版本。

组分体积
无酚红 Neurobasal 培养基500 mL
不含维生素 A 的 B-27 添加剂（50 倍浓度）10 mL
抗生素-抗真菌剂（100 倍浓度）5 mL
丙酮酸钠（100 mM）5 mL
氯化钠溶液（0.85%）中的谷氨酰胺（200 mM）5 mL
重组人碱性成纤维细胞生长因子（250 µg/mL）20 µL
重组人表皮生长因子蛋白（250 µg/mL）20 µL
酚红500 µL

表1：完全神经基础培养基（NBMc）配方

试剂时间
50% 乙醇3 分钟
75% 乙醇3 分钟
95% 乙醇3 分钟
95% 乙醇4 分钟
100% 乙醇2 分钟
100% 乙醇3 分钟
100% 乙醇4 分钟
二甲苯替代物2 分钟
二甲苯替代物3 分钟
二甲苯替代物4 分钟
石蜡15 分钟
石蜡15 分钟

表2：小型类器官（直径小于3 mm）的处理时间表

试剂时间
50% Ethanol6 min
75% Ethanol6 min
95% Ethanol5 min
95% Ethanol8 min
100% Ethanol5 min
100% Ethanol5 min
100% Ethanol8 min
Xylene substitute5 min
Xylene substitute5 min
Xylene substitute8 min
Paraffin wax30 min
Paraffin wax30 min

表3：大型类器官（直径大于3 mm）的处理时间表

试剂时间
Hematoxylin2 min
Running diH2O2 min
Nuclear hematoxylin clarifying reagent1 min
Running diH2O1 min
Bluing Reagent1 min
Running diH2O2 min
70% ethanol1 min
100% ethanol1 min
100% ethanol1 min
Xylene substitute2 min
Xylene substitute2 min

表4：苏木精复染

讨论

GBM类器官是一种对传统球体培养方法的补充，具有更高的细胞和微环境异质性4,22,30。尽管类器官培养需要更多的时间和资源，但它能够为肿瘤内部行为及药物耐药机制提供有价值的见解。

胶质母细胞瘤（GBM）由一群肿瘤干细胞（CSCs）驱动5,31，这些方法的建立旨在支持该CSC群体的持续生长和自我更新。表皮生长因子（EGF）和成纤维细胞生长因子（FGF）已知可增强干细胞的维持与增殖，并提供活跃的受体酪氨酸激酶（RTK）信号传导。GBM肿瘤内异质性细胞群体的形成以及独特的肿瘤微环境依赖于对CSC行为的支持。选用低重构基底膜基质（lrECM）可模拟富含层粘连蛋白的脑内环境，支持类器官培养中的细胞通过侵袭实现自我组织和迁移。尽管已有部分研究团队建立了无需使用lrECM或EGF/FGF富集培养基的类器官培养方法24,28，这可能使该培养方法更节省时间，并加强对驱动生长的致癌信号通路的选择性，但本研究选择这些条件是为了优化利于干细胞的环境，以最大程度地建立类器官的细胞异质性。在既往文献中，已有使用lrECM构建脑类器官和GBM类器官的报道21,32,33。尽管我们已掌握有关类器官内肿瘤细胞群体及其空间分布的数据，但对于类器官中非肿瘤细胞群体的情况，以及它们自原始患者样本中存活的时间，目前仍了解较少。某些免疫组化染色（如CD45）可能提供此类信息，未来结合类器官模型开展相关研究将是一个值得关注的方向。

了解类器官培养的预期用途对于选择适当的方法至关重要。从原代样本建立类器官与为特定实验培养均一类器官的流程略有不同。理解类器官如何成熟以及在lrECM支架中逐渐填充的形态变化，有助于合理分配类器官培养所需的时间和资源。类器官中细胞稀疏的区域会缓慢扩展并生长，以填满lrECM，这一过程通常需要2至8周，具体时间取决于样本的生长特性。这种生长速率在一定程度上是各样本固有的，且在不同批次的类器官中保持一致，并与类球体生长的相对速率较为相符。类器官可维持培养超过1年，并在移植至小鼠体内后仍保留成瘤能力；然而，建议根据明确的研究目的进行培养，以避免浪费实验室资源（包括材料和时间）4。已针对多种孔板规格和培养格式测试了类器官的生长情况，结果表明，10 cm培养皿是维持细胞最佳存活率的理想选择，其次为6孔板，每孔接种3个类器官34。与二维培养相比，类器官消耗更多的培养基，使用更小孔径的培养格式无法实现有效的维持培养。例如，96孔板中的单个孔相对于类器官的尺寸而言，其空间和培养基体积均不足以支持类器官的持续生长。

随着类器官的建立，密切观察对于提高成功率至关重要。初期类器官对培养基的消耗较慢，但随着其密度增加并逐渐成熟，培养基的消耗速度会加快。在培养基中添加酚红可作为培养基消耗情况的指示剂。当培养基颜色变黄时，提示我们需要调整换液方案，例如增加换液量、提高培养板中的总培养基体积、将类器官分种到多个细胞培养板以适应其生长，甚至调整实验的时间安排。

在许多方面，类器官进行癌症研究的效率较低。与胶质母细胞瘤（GBM）球体培养相比，类器官培养耗时较长，且成本高昂、资源消耗大。然而，与用于重建细胞和微环境多样性的另一种替代方法——患者来源的异种移植模型（PDX）相比，类器官则更为简便、成本更低且更易于控制。对癌症研究人员而言，选择最适宜使用类器官的时机至关重要。类器官并非旨在取代传统的球体培养或贴壁培养，也不意在取代异种移植模型。当应用于恰当的科学问题时，类器官能够结合这两种系统的优点，使我们得以观察到原本可能被掩盖的肿瘤细胞生物学特性。科学界才刚刚开始理解类器官所提供的研究机遇，但显然，它们将在未来成为解析GBM复杂生物学机制的宝贵工具。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们谨向Justin Lathia博士表示感谢 宝贵的建议和持续的支持。我们还要感谢 Katrina Fife、Lisa Wallace 和 Maya Camhi 提供出色的技术支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3,3-二氨基联苯胺（DAB）片剂MP Biomedicals089806813,3-二氨基联苯胺（DAB）片剂
96孔PCR板ThermoFisher Scientific96孔PCR板
AccutaseThermoFisher ScientificSCR005细胞解离溶液
抗生素-抗真菌剂ThermoFisher Scientific15240062抗生素-抗真菌剂
B-27添加剂（不含维生素A）ThermoFisher Scientific12587001B-27添加剂（不含维生素A）（50倍浓缩）
GelCode Blue 染色试剂ThermoFisher Scientific24590染色显影试剂
细胞筛（70 µm）CellTreat Scientific229483细胞筛（70 µm）
CellTiter-Glo 3DPromegaG9681化学发光细胞活力检测
Clarifier 2ThermoFisher Scientific7301细胞核苏木精澄清试剂
Clear-Rite 3ThermoFisher Scientific6901二甲苯替代物
Epredia Gill 2 苏木精ThermoFisher Scientific72504苏木精
0.85% NaCl中的谷氨酰胺ThermoFisher Scientific350500610.85% NaCl中的谷氨酰胺（200 mM）
MatrigelThermoFisher Scientific354234富含层粘连蛋白的细胞外基质
微型PAP笔ThermoFisher Scientific008877疏水屏障笔
封片介质ThermoFisher Scientific22-050-102封片介质
不含酚红的Neurobasal培养基ThermoFisher Scientific12349015不含酚红的Neurobasal培养基（500 mL）
正常驴血清（NDS）Jackson ImmunoResearch017-000-121正常驴血清（NDS）
4%多聚甲醛PBS溶液ThermoFisher ScientificAAJ19943K24%多聚甲醛PBS溶液
酚红SigmaP0290酚红（0.5%）
含DAPI的ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂ThermoFisher ScientificP10144液体固化封片剂
重组人EGF蛋白R&D systems236-EG-01M重组人EGF蛋白（250 µg/mL）
重组人碱性FGFR&D systems4144-TC-01重组人碱性FGF（250 µg/mL）
SignalStain 抗体稀释液Cell Signaling8112抗体稀释液
SignalStain Boost IHC 检测试剂Cell Signaling8114免疫组织化学检测试剂
SignalStain 枸橼酸抗原修复液Cell Signaling14746枸橼酸抗原修复液
单边剃须刀片UlineH-595B单边剃须刀片
丙酮酸钠ThermoFisher Scientific11360070丙酮酸钠（100 mM）
Tissue-Tek 冷冻模具VWR25608-916一次性冷冻模具
Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂VWR25608-930最佳切割温度包埋剂
台盼蓝染色液ThermoFisher ScientificT10282细胞非渗透性染色液（0.4%）
二甲苯ThermoFisher ScientificX3P-1GAL二甲苯

参考文献

  1. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
  2. Heffernan, J. M., Sirianni, R. W. Modeling microenvironmental regulation of glioblastoma stem cells: a biomaterials perspective. Frontiers in Materials. 5, 7(2018).
  3. Zanders, E. D., Svensson, F., Bailey, D. S. Therapy for glioblastoma: is it working. Drug Discovery Today. 24 (5), 1193-1201 (2019).
  4. Hubert, C. G., et al. A Three-dimensional organoid culture system derived from human glioblastomas recapitulates the hypoxic gradients and cancer stem cell heterogeneity of tumors found in vivo. Cancer Research. 76 (8), 2465-2477 (2016).
  5. Lathia, J. D., Heddleston, J. M., Venere, M., Rich, J. N. Deadly teamwork: neural cancer stem cells and the tumor microenvironment. Cell Stem Cell. 8 (5), 482-485 (2011).
  6. Meyer, M., et al. Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 851-856 (2015).
  7. Bao, S., et al. Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor. Cancer Research. 66 (16), 7843-7848 (2006).
  8. Yu, S. C., Bian, X. W. Enrichment of cancer stem cells based on heterogeneity of invasiveness. Stem Cell Reviews and Reports. 5 (1), 66-71 (2009).
  9. Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
  10. Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. Brain tumour stem cells. Nature Reviews. Cancer. 6 (6), 425-436 (2006).
  11. Zhu, T. S., et al. Endothelial cells create a stem cell niche in glioblastoma by providing NOTCH ligands that nurture self-renewal of cancer stem-like cells. Cancer Research. 71 (18), 6061-6072 (2011).
  12. Calabrese, C., et al. A perivascular niche for brain tumor stem cells. Cancer Cell. 11 (1), 69-82 (2007).
  13. Charles, N., et al. Perivascular nitric oxide activates notch signaling and promotes stem-like character in PDGF-induced glioma cells. Cell Stem Cell. 6 (2), 141-152 (2010).
  14. Seidel, S., et al. A hypoxic niche regulates glioblastoma stem cells through hypoxia inducible factor 2 alpha. Brain. 133, 983-995 (2010).
  15. Yan, K., et al. Glioma cancer stem cells secrete Gremlin1 to promote their maintenance within the tumor hierarchy. Genes & Development. 28 (10), 1085-1100 (2014).
  16. Cheng, L., et al. Glioblastoma stem cells generate vascular pericytes to support vessel function and tumor growth. Cell. 153 (1), 139-152 (2013).
  17. Flavahan, W. A., et al. Brain tumor initiating cells adapt to restricted nutrition through preferential glucose uptake. Nature Neuroscience. 16 (10), 1373-1382 (2013).
  18. Hjelmeland, A. B., et al. Acidic stress promotes a glioma stem cell phenotype. Cell Death and Differentiation. 18 (5), 829-840 (2011).
  19. Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres. The American Journal of Pathology. 177 (3), 1491-1502 (2010).
  20. Li, Z., et al. Hypoxia-inducible factors regulate tumorigenic capacity of glioma stem cells. Cancer Cell. 15 (6), 501-513 (2009).
  21. Azzarelli, R., Ori, M., Philpott, A., Simons, B. D. Three-dimensional model of glioblastoma by co-culturing tumor stem cells with human brain organoids. Biology Open. 10 (2), 056416(2021).
  22. Linkous, A., et al. Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids. Cell Reports. 26 (12), 3203-3211 (2019).
  23. da Silva, B., Mathew, R. K., Polson, E. S., Williams, J., Wurdak, H. Spontaneous glioblastoma spheroid infiltration of early-stage cerebral organoids models brain tumor invasion. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 23 (8), 862-868 (2018).
  24. Jacob, F., et al. A Patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity. Cell. 180 (1), 188-204 (2020).
  25. Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
  26. Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell-and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
  27. Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: what is the impact for novel discoveries. Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).
  28. Lenin, S., et al. A drug screening pipeline using 2D and 3D patient-derived in vitro models for preclinical analysis of therapy response in glioblastoma. International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4322(2021).
  29. Rybin, M. J., Ivan, M. E., Ayad, N. G., Zeier, Z. Organoid models of glioblastoma and their role in drug discovery. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15 (4), 605255(2021).
  30. Shakya, S., et al. Altered lipid metabolism marks glioblastoma stem and non-stem cells in separate tumor niches. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 101(2021).
  31. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  32. Bian, S., et al. Genetically engineered cerebral organoids model brain tumor formation. Nature Methods. 15 (8), 631-639 (2018).
  33. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  34. Sundar, S. J., et al. Three-dimensional organoid culture unveils resistance to clinical therapies in adult and pediatric glioblastoma. Translational Oncology. 15 (1), 101251(2021).

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