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方法文章

接触性超敏反应小鼠模型中粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子产生型辅助性T细胞的分析

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DOI：

10.3791/63755

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2022年3月10日

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1Laboratory of Human Disease and Immunotherapies, West China Hospital, Sichuan University, 2Institute of Immunology and Inflammation, Frontiers Science Center for Disease-Related Molecular Network, West China Hospital, Sichuan University, 3Core Facilities of West China Hospital, Sichuan University

本文内容

摘要

此处介绍一种简单且标准化的方法，用于分析粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子产生型辅助性T细胞亚群 体内.

摘要

与传统的 Th1/Th2/Th17/Treg 细胞谱系并行，分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的辅助性 T 细胞（Th-GM 细胞）已被确认为辅助性 T 细胞的一个独特亚群（GM-CSF+ IFN-γ- IL-17A- IL-22- 效应CD4+ T细胞）在人类和小鼠中的研究。接触性超敏反应（CHS）被认为是研究人类变应性接触性皮炎（ACD）的优良动物模型，其表现出完整的T细胞介导的免疫应答。为在T细胞依赖性免疫应答中对Th-GM细胞亚群进行标准化和全面的分析，提供一种可靠的检测方法 体内，通过使用一种反应性低分子量有机半抗原2,4-二硝基氟苯（DNFB）进行致敏和激发，建立了小鼠CHS模型。效应CD4+ T细胞中的Th-GM亚群+ 通过流式细胞术分析了经半抗原免疫后产生的T细胞。我们发现，在DNFB诱导的接触性超敏反应小鼠模型中，Th-GM细胞主要在病变部位和引流淋巴结中扩增。该方法可用于进一步研究Th-GM细胞的生物学特性，以及在诸如变应性接触性皮炎（ACD）等多种疾病状态下，以GM-CSF为核心的治疗策略的药理学研究。

引言

分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的辅助性T细胞——即Th-GM亚群——近年来被确认为在人类和小鼠中均存在的一类独特的辅助性T细胞亚群，被认为包含 "仅表达 GM-CSF" （GM-CSF+ IFN-γ- IL-17A- IL-22-通过单细胞RNA分析、质谱流式细胞术和GM-CSF命运图谱小鼠鉴定的CD4 T细胞1,2,32014年，Sheng等人报道了信号转导子和转录激活子5（STAT5）对Th-GM亚群的编程作用，并提出了该亚群的理论概念 "Th-GM" 首次进行子集分析4,5Th-GM细胞的特征是表达GM-CSF、IL-2、TNF-α、IL-3、CCL20等细胞因子，以及C-X-C趋化因子受体4型（CXCR4）或CXCR6等趋化因子受体。1,2STAT和/或NF-κB信号通路对于Th-GM谱系分化至关重要。 体外 建立了一种方法，利用IL-7在TCR刺激存在的情况下将初始CD4 T细胞分化为Th-GM细胞6同时，细胞因子IL-23和IL-1β被证明可维持Th-GM细胞的表达及其致病性 离体3,7.

Th-GM细胞的升高与多种自身免疫性疾病相关，例如多发性硬化症和类风湿性关节炎2,8,9，提示其在自身免疫发病机制中可能发挥重要作用10。越来越多的证据表明，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）可作为炎症介质发挥作用。在CD4+ T细胞中基因过表达Csf2（编码GM-CSF的基因）的小鼠会自发出现神经功能缺陷，并伴有吞噬细胞向中枢神经系统的浸润。在T细胞过继转移结肠炎模型中，将 Csf2−/− T细胞过继转移至Rag1−/−小鼠，可显著减轻疾病的临床表现和组织病理学特征。然而，关于Th-GM亚群在变应性接触性皮炎（ACD）等过敏性疾病中作用的研究报道尚少。

变应性接触性皮炎（ACD）是最常见的炎症性皮肤病之一，在工作和生活环境中的发病率较高11,12。它是一种由完整免疫回路介导的IV型迟发型超敏反应，其发生分为两个在时间上相继的阶段：致敏和激发。人类ACD由接触某些化学物质（半抗原或金属）引发，导致机体产生致敏。在此阶段，抗原呈递细胞呈递半抗原-蛋白质复合物，启动T细胞介导的免疫反应。当再次接触相同半抗原时，特异性的效应T细胞和记忆T细胞被重新激活并迁移至皮肤，此过程伴随多种免疫细胞群体的浸润。这种急性炎症反应被称为激发，最终导致皮损的完全形成13。人类ACD可通过接触性超敏反应（CHS）的动物模型进行研究14。

由一种反应性低分子量有机半抗原2,4-二硝基氟苯（DNFB）诱导的接触性超敏反应（CHS）模型是一种常用的小鼠模型，已被广泛用于研究变应性接触性皮炎（ACD）的病理机制及潜在的治疗干预措施15,16。因此，这一T细胞依赖性模型可用于研究过敏性疾病中Th-GM亚群的生成。本文中，我们采用DNFB诱导小鼠CHS模型，分析了病变部位及引流淋巴结中Th-GM亚群的生成情况，发现Th-GM亚群主要在再次接触相同半抗原时显著扩增。这表明Th-GM亚群可能在ACD的发展过程中起关键作用，并可作为ACD治疗的一个特异性靶点。

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方案

本方案中使用的所有小鼠均为C57BL/6遗传背景，饲养于特定病原体阴性环境中，并可自由获取食物和水。ad libitum。所有实验均经四川大学华西医学中心动物福利伦理审查委员会批准（20210302059）。

1. 试剂与材料准备

  1. 0.5% DNFB 溶液作为致敏剂
    1. 为对 10 只小鼠进行致敏，准备 1.1 mL 体积比为 4:1 的丙酮/橄榄油（v/v）混合液：将 880 µL 丙酮与 220 µL 橄榄油混合，额外预留 0.1 mL 以补偿可能发生的微量体积损失。向 1.1 mL 均匀混合的丙酮/橄榄油 4:1 混合液中加入 5 µL DNFB。
      注意：应在致敏当天新鲜配制。丙酮/橄榄油混合液应在通风橱中配制。
  2. 0.2% DNFB 溶液作为激发剂
    1. 为激发 10 只小鼠，将 0.5 µL DNFB 加入 0.25 mL 均匀混合的丙酮/橄榄油 4:1 混合液中（该混合液配制方法见步骤 1.1）。在致敏后对小鼠进行激发时，使用丙酮/橄榄油 4:1 混合液作为溶剂。
      注意：丙酮/橄榄油混合液应在通风橱中配制。
  3. 水合氯醛作为麻醉剂
    1. 将 4 g 水合氯醛溶解于 50 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制成 8% 的工作液。过滤后于 4 °C 保存，最长可保存 3 个月。小鼠给药剂量为每克体重 5 µL。
  4. 50 倍浓度的 IV 型胶原酶储备液
    1. 将 100 mg IV 型胶原酶溶解于 1 mL 基础 RPMI 1640 培养基（不含抗生素和胎牛血清 [FBS]）中，配制成 100 mg/mL 的储备液。分装为 100 µL 每份，于 -20 °C 保存，最长可保存 6 个月。
  5. 1,000 倍浓度的 DNase I 储备液
    1. 将 5 mg DNase I 溶解于 1 mL 0.15 M NaCl 溶液中，配制成 5 mg/mL 的储备液。分装为 100 µL 每份，于 -20 °C 保存，最长可保存 6 个月。
  6. 终止缓冲液
    1. 将 1.681 g EDTA 溶解于 50 mL 基础 RPMI 1640 培养基中，配制成 100 mM 的储备液。于 4 °C 保存，最长可保存 2 周。
  7. 洗涤培养基
    1. 将 0.372 g EDTA 溶解于 500 mL PBS 中，终浓度为 2 mM，再加入 5 mL FBS，终浓度为 1%。过滤后于 4 °C 保存，最长可保存 1 个月。
  8. 染色缓冲液
    1. 将 0.372 g EDTA 溶解于 500 mL PBS 中，终浓度为 2 mM，再加入 10 mL FBS，终浓度为 2%。过滤后于 4 °C 保存，最长可保存 1 个月。
  9. 再刺激试剂
    1. 将 1 mg 佛波醇 12-十四烷酰-13-乙酸酯（PMA）溶解于 20 mL DMSO 中，配制成 50 µg/mL 储备液（500 倍浓度），分装为 50 µL 每份，于 -20 °C 保存。
    2. 将 250 µL 离子霉素溶液（4 mg/mL）加入 7.75 mL DMSO 中，配制成 500 µg/mL 储备液（500 倍浓度），分装为 50 µL 每份，于 -20 °C 保存。
    3. 将 1 mL 蛋白转运抑制剂溶液（含布雷菲德菌素 A）分装为 50 µL 每份，于 4 °C 保存。

2. 在小鼠中诱导 CHS

  1. 在第 -5 天，通过腹腔注射 400 mg/kg 水合氯醛对小鼠进行麻醉。
  2. 使用宠物剃毛器，将小鼠腹部约 2 cm × 2 cm 的区域剃毛。
    注意：避免划伤小鼠皮肤；保持皮肤屏障的完整性。
  3. 用带一次性吸头的移液器将 100 µL 的 0.5% DNFB 溶液均匀轻柔地涂抹于剃毛后的腹部区域。固定小鼠 5–10 秒，使部分溶剂挥发。
  4. 在第 -4 天，重复步骤 2.1–2.3，进行第二次致敏。
    注意：两次致敏的效果优于一次。
  5. 在第 0 天，使用带一次性吸头的移液器将 20 µL 的 0.2% DNFB 溶液涂抹于小鼠右耳进行激发，左耳则涂抹等体积的丙酮/橄榄油（4:1）混合液作为对照溶剂。
    注意：激发时应将等量的 DNFB 或对照溶剂分别涂抹于耳部的背侧和腹侧。
  6. 在接下来的 3 天内，每天使用数显测厚仪测量小鼠右耳和左耳的耳厚，并计算耳厚增加量：右耳厚度减去左耳厚度。
    ​注意：与对照溶剂处理的耳朵相比，接受 0.2% DNFB 激发的小鼠耳朵可观察到耳厚逐渐增加。

3. CHS 小鼠的样本采集

  1. 第3天，通过腹腔注射400 mg/kg水合氯醛对小鼠进行麻醉。等待5–10分钟，待小鼠进入无意识状态后，轻轻捏压双侧后肢脚趾，确认小鼠已深度麻醉。
  2. 使用相机拍摄每只小鼠双耳的照片。分别对耳部结痂（耳部脱屑）和红斑（耳部发红）进行评分，以评估炎症严重程度，评分标准为0至5分：0分，无；1分，轻微；2分，中等；3分，明显；4分，非常明显；5分，最严重。
  3. 通过颈椎脱臼法处死小鼠。用无菌的锋利剪刀和镊子剪下整个耳朵，并分离耳部平行引流的淋巴结。将组织置于冰上预冷的6孔板中的一个孔内，孔中含5 mL预冷的磷酸盐缓冲液（PBS），用于后续酶解或机械解离以制备单细胞悬液（补充图S1A 和 补充图S2A）。
  4. 对于组织学分析，将耳部样本固定于4%多聚甲醛中，随后进行脱水处理，并包埋于石蜡中，用于免疫组织化学染色，具体步骤参见其他文献17。

4. 耳组织单细胞悬液的制备

  1. 用两把弯头镊子夹住并撕开耳部组织的腹侧和背侧（补充图 S1B），将其放入6孔板的一个孔中，孔内含4.5 mL消化缓冲液，确保组织完全浸没在消化缓冲液中（补充图 S1C）。
    注意：消化缓冲液由含10% FBS的RPMI 1640培养基 + 25 mM HEPES + 2 mg/mL胶原酶IV + 5 µg/mL DNase I组成。
  2. 将耳部组织瓣置于37 °C细胞培养箱中孵育20分钟。用剪刀将耳部组织尽可能剪碎，以促进组织消化（补充图 S1D），然后将样品放回孵育箱继续孵育40分钟。
    注意：有效消化通常在40–50分钟内完成。在37 °C下过度消化会影响细胞活力。
  3. 每孔加入0.5 mL终止缓冲液，以中和胶原酶IV和DNase I的酶活性。后续步骤在冰上操作。
  4. 用一对弯头镊子将耳部组织碎片转移至含有70 µm细胞筛网的50 mL离心管中，并用移液器将全部培养基体积转移至同一细胞筛网中。
  5. 使用1 mL注射器活塞的顶端用力研磨组织，以环形方式按压70 µm细胞筛网，直至仅剩白色结缔组织为止（补充图 S1D）。
  6. 用1,000 µL洗涤液冲洗细胞筛网两次。将孔内全部液体体积通过40 µm细胞筛网转移至50 mL离心管中。将离心管置于冰上保存。

5. 制备引流淋巴结（dLNs）的单细胞悬液

  1. 用一对弯头镊子将淋巴结转移至6孔板孔中放置的70 µm细胞筛网上（补充图S2B）。使用1 mL注射器活塞的顶端轻轻研磨淋巴结，以环形按压方式作用于70 µm细胞筛网，直至仅剩白色残渣（补充图S2C）。
  2. 用1,000 µL洗涤液将细胞筛网冲洗两次。将孔内全部液体转移至5 mL离心管中。将离心管置于冰上保存。

6. 在蛋白转运抑制剂存在下，用佛波酯-12-肉豆蔻酸盐-13-乙酸盐（PMA）/离子霉素对 Th-GM 亚群进行再刺激

  1. 将耳部和引流淋巴结样本中分离的细胞在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 8 分钟，弃去上清液。用 1,000 µL 洗涤液轻轻重悬沉淀。
  2. 取每份样本的一小部分，使用血细胞计数板计数来自耳部和引流淋巴结的总细胞数。加入 0.04% 台盼蓝以测定细胞活力。
    注意：后续 T 细胞刺激与分析的细胞活力应高于 60%。细胞密度可为 1–5 × 106/mL。
  3. 将步骤 6.1 中的细胞离心并弃去上清液。用 1,000 µL 含 2% FBS 的 RPMI 1640 培养基轻轻重悬沉淀，并将 1 mL 单细胞悬液（106 个细胞/mL）接种至 12 孔平底组织培养板中。
  4. 向 12 孔板的每孔（含上述 1 mL 单细胞悬液）中加入 2 µL 佛波酯-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）（终浓度 100 ng/mL）、2 µL 离子霉素（终浓度 1,000 ng/mL）和 1 µL 蛋白转运抑制剂（含布雷菲德菌素 A），于 37 °C 孵育 4 小时。

7. 生成的 Th-GM 亚群分析 体内 通过细胞表面和细胞内染色

  1. 用移液器将刺激后的细胞转移至1.5 mL离心管中。在室温下以400 × g 离心8分钟，弃去上清液。
  2. 用1 mL染色缓冲液重悬细胞沉淀一次，并按照步骤7.1所述方法通过离心收集细胞。将细胞重悬于0.5 mL染色缓冲液中，浓度为1–10 × 106/mL。
  3. 向0.5 mL细胞悬液中加入0.5 µL活性染料原液（见材料表），立即涡旋混匀。室温避光孵育10分钟。用1 mL染色缓冲液洗涤细胞两次，并重复步骤7.1的离心操作以收集细胞沉淀。
  4. 将细胞沉淀重悬于0.1 mL染色缓冲液中。向三份0.1 mL的细胞悬液中分别加入1 µL抗CD4抗体（FITC标记）、1 µL抗CD44抗体（APC标记）和1 µL抗CD62L抗体（PE/Cyanine7标记）。立即涡旋混匀，并在避光条件下室温孵育15分钟。
  5. 重复步骤7.3中的洗涤和离心操作。
  6. 将细胞沉淀重悬于200 µL细胞内固定缓冲液中，避光孵育20分钟。同时，将1份透膜缓冲液（10x）与9份蒸馏水混合，配制成1x透膜缓冲液。用1 mL 1x透膜缓冲液在室温下以600 × g 离心5分钟，洗涤细胞两次。
  7. 将细胞沉淀重悬于0.1 mL 1x透膜缓冲液中，加入针对GM-CSF（PE标记，1 µL/测试）、IFN-γ（BV711标记，1 µL/测试）、IL-17A（BV421标记，1 µL/测试）和IL-22（PerCP/Cyanine5.5标记，5 µL/测试）的抗体，避光室温孵育30分钟。
  8. 重复步骤7.6中的洗涤和离心操作。
  9. 将细胞沉淀重悬于200 µL PBS中，并将悬液转移至圆底试管中。使用流式细胞仪检测染色后的细胞。

8. 鉴定 Th-GM 亚群的设门策略

  1. 使用流式细胞术分析软件（详见材料表中所用软件信息）并按照补充图S1所示的设门策略进行数据分析。对于此处使用的软件，需先下载并在计算机上安装配置。
  2. 通过点击软件中的文件 | 打开 | 导入FCS文件来导入流式细胞术数据，并通过选择重命名标签为每个样本标注组别和名称。
  3. 在FSC与SSC散点图上（FSClow SSClow，P1）选择淋巴细胞，以排除位于左下角的碎片以及体积较大、颗粒度较高的髓系细胞。点击密度图，并将该图的X轴设为FSC-A，Y轴设为SSC-A。
  4. 双击P1中的事件以生成另一个密度图，并通过该图中细胞高度与面积的关系（X轴为FSC-A，Y轴为FSC-H）将单细胞（呈直线相关分布，P2）与细胞聚集体区分开来。
  5. 双击P2中的事件以生成下一个密度图，将该图的X轴设为FSC-A，Y轴设为SSC-A。通过FVS 780-事件圈选活细胞群体（P3）。
  6. 双击P3中的事件以生成下一个密度图（X轴为CD4-A，Y轴为SSC-A），并通过选择CD4+细胞群（P4）来识别CD4 T细胞。
  7. 双击P4中的事件以生成另一个密度图（X轴为CD44-A，Y轴为CD62L-A），并通过选择该图右上象限的细胞群（CD62L- CD44+，P5）定义效应T辅助细胞。

9. 统计分析

  1. 采用非配对 t 检验进行统计分析，比较两组数据。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001（均值 ± 标准差）。

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结果

小鼠中由DNFB诱导的CHS（接触性超敏反应）
为在小鼠中诱导CHS，采用在耳部皮肤施加DNFB的方式对小鼠进行致敏和激发，如图1A所示。与对照溶剂处理的小鼠相比，经DNFB激发的小鼠耳部厚度（表皮海绵样变的指标）显著增加（图1B，第1天为70 vs 3 µm，第2天为203 vs 7.5 µm，第3天为276 vs 5 µm）。激发后72小时，小鼠右耳出现红斑、结痂和增厚现象，而对照溶剂处理的耳朵未见任何炎症迹象（图1C）。DNFB激发组小鼠耳朵的结痂和红斑评分高于对照溶剂处理组（图1D）。

DNFB攻击后表皮增厚加剧及显著的炎性细胞浸润
对DNFB处理皮肤的H&E染色切片分析显示，与对照溶剂处理的皮肤相比，耳部皮肤的表皮增厚更为明显（

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讨论

本方案提供了一种简单的方法 体内 分析Th-GM细胞亚群生成与扩增的检测方法。必须使用由半抗原或抗原诱导的小鼠T细胞介导的疾病模型，以模拟人类体内的免疫激活过程。DNFB是一种小分子半抗原，相较于多肽或蛋白质抗原，其在诱导T细胞免疫反应方面更具经济性和时间效率。 体内18,19在疾病发展过程中，我们观察到，与使用其他半抗原（包括2,4,6-三硝基氯苯（TNCB）、氧杂蒽酮（OXA）或异硫氰酸荧光素（FITC））诱导相比，在C57BL/6J遗传背景的小鼠中，经DNFB激发产生的耳部肿胀反应幅度最大（数据未显示），尽管上述其他三种试剂已有报道可在小鼠中引发接触性敏感反应。14研究人员必须确定合适的小鼠品系和半抗原，以充分诱导疾病发生。

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作得到国家自然科学基金（编号 81602763、81803142、82003347）、中国博士后科学基金优秀博士后研究人员计划（编号 2017T100700）以及中国博士后科学基金常规项目（编号 2016M592673）的资助。作者谨此感谢四川大学华西医院科研公共服务平台王艳、朱梦莉（Yan Wang 和 Meng-Li Zhu）在本研究中提供的流式细胞术技术支援。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2,4-二硝基氟苯BT REAGENTP0001746CAS NO: 70-34-8
丙酮CHRON CHEMICALS/67-64-1
抗CD4抗体Biolegend3005061:100 稀释
抗CD44抗体Biolegend1030121:100 稀释
抗CD62L抗体Biolegend1044171:100 稀释
抗GM-CSF抗体BD Bioscience5545071:100 稀释
抗IFN-γ抗体Biolegend5058361:100 稀释
抗IL-17A抗体BD Bioscience5633541:100 稀释
抗IL-22抗体Biolegend5164115 µL/次检测
CD45Biolegend1031011:200 稀释
水合氯醛CHRON CHEMICALS/302-17-0
测微厚度计（0.01 mm型）PEACOCKG-1A/
DMSOLIFESCIENCESD837167-68-5
EDTA Na2SolarbioE80306381-92-6
F4/80Biolegend1231021:200 稀释
可固定活力染料780BD Bioscience5653881:1,000 稀释，活力染料
流式细胞仪BD BioscienceBD FACS ARIA II SORP/
GraphPad PrismGraphPad SoftwarePrism 7统计与绘图软件
胞内固定和通透缓冲液试剂盒Thermo Fisher88-8824-00新鲜配制
离子霉素Sigma-Aldrich407951CAS NO: 56092-81-0
Ly6GBiolegend1276021:200 稀释
NovoExpressAgilent/流式细胞术数据分析软件；https://www.agilent.com.cn/zh-cn/product/research-flow-cytometry/flow-cytometry-software/novocyte-novoexpress-software-1320805
橄榄油YUANYE BIOS305038001-25-0
PMASigma-AldrichP8139CAS NO: 16561-29-8
蛋白转运抑制剂（含布雷菲德菌素A）BD Bioscience5550291 µL/mL

参考文献

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Th-GM细胞产GM-CSF的T细胞变应性接触性皮炎效应CD4 T细胞流式细胞术引流淋巴结T细胞免疫应答24-二硝基氟苯

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