接触性超敏反应小鼠模型中粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子产生型辅助性T细胞的分析

摘要

此处介绍一种简单且标准化的方法，用于分析粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子产生型辅助性T细胞亚群 体内.

摘要

与传统的 Th1/Th2/Th17/Treg 细胞谱系并行，分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的辅助性 T 细胞（Th-GM 细胞）已被确认为辅助性 T 细胞的一个独特亚群（GM-CSF⁺ IFN-γ^- IL-17A^- IL-22^- 效应CD4⁺ T细胞）在人类和小鼠中的研究。接触性超敏反应（CHS）被认为是研究人类变应性接触性皮炎（ACD）的优良动物模型，其表现出完整的T细胞介导的免疫应答。为在T细胞依赖性免疫应答中对Th-GM细胞亚群进行标准化和全面的分析，提供一种可靠的检测方法 体内，通过使用一种反应性低分子量有机半抗原2,4-二硝基氟苯（DNFB）进行致敏和激发，建立了小鼠CHS模型。效应CD4+ T细胞中的Th-GM亚群⁺ 通过流式细胞术分析了经半抗原免疫后产生的T细胞。我们发现，在DNFB诱导的接触性超敏反应小鼠模型中，Th-GM细胞主要在病变部位和引流淋巴结中扩增。该方法可用于进一步研究Th-GM细胞的生物学特性，以及在诸如变应性接触性皮炎（ACD）等多种疾病状态下，以GM-CSF为核心的治疗策略的药理学研究。

引言

分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的辅助性T细胞——即Th-GM亚群——近年来被确认为在人类和小鼠中均存在的一类独特的辅助性T细胞亚群，被认为包含 "仅表达 GM-CSF" （GM-CSF⁺ IFN-γ^- IL-17A^- IL-22^-通过单细胞RNA分析、质谱流式细胞术和GM-CSF命运图谱小鼠鉴定的CD4 T细胞^1,2,32014年，Sheng等人报道了信号转导子和转录激活子5（STAT5）对Th-GM亚群的编程作用，并提出了该亚群的理论概念 "Th-GM" 首次进行子集分析^4,5Th-GM细胞的特征是表达GM-CSF、IL-2、TNF-α、IL-3、CCL20等细胞因子，以及C-X-C趋化因子受体4型（CXCR4）或CXCR6等趋化因子受体。^1,2STAT和/或NF-κB信号通路对于Th-GM谱系分化至关重要。 体外 建立了一种方法，利用IL-7在TCR刺激存在....

方案

本方案中使用的所有小鼠均为C57BL/6遗传背景，饲养于特定病原体阴性环境中，并可自由获取食物和水。ad libitum。所有实验均经四川大学华西医学中心动物福利伦理审查委员会批准（20210302059）。

1. 试剂与材料准备

1. 0.5% DNFB 溶液作为致敏剂
   1. 为对 10 只小鼠进行致敏，准备 1.1 mL 体积比为 4:1 的丙酮/橄榄油（v/v）混合液：将 880 µL 丙酮与 220 µL 橄榄油混合，额外预留 0.1 mL 以补偿可能发生的微量体积损失。向 1.1 mL 均匀混合的丙酮/橄榄油 4:1 混合液中加入 5 µL DNFB。
      注意：应在致敏当天新鲜配制。丙酮/橄榄油混合液应在通风橱中配制。
2. 0.2% DNFB 溶液作为激发剂
   1. 为激发 10 只小鼠，将 0.5 µL DNFB 加入 0.25 mL 均匀混合的丙酮/橄榄油 4:1 混合液中（该混合液配制方法见步骤 1.1）。在致敏后对小鼠进行激发时，使用丙酮/橄榄油 4:1 混合液作为溶剂。
      注意：丙酮/橄榄油混合液应在通风橱中配制。
3. 水合氯醛作为麻醉剂
   1. 将 4 g 水合氯醛溶解于 50 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制成 8%....

结果

小鼠中由DNFB诱导的CHS（接触性超敏反应）
为在小鼠中诱导CHS，采用在耳部皮肤施加DNFB的方式对小鼠进行致敏和激发，如图1A所示。与对照溶剂处理的小鼠相比，经DNFB激发的小鼠耳部厚度（表皮海绵样变的指标）显著增加（图1B，第1天为70 vs 3 µm，第2天为203 vs 7.5 µm，第3天为276 vs 5 µm）。激发后72小时，小鼠右耳出现红斑、结痂和增厚现象，而对照溶剂处理的耳朵未见任何炎症迹象（图1C）。DNFB激发组小鼠耳朵的结痂和红斑评分高于对照溶剂处理组（图1D）。

DNFB攻击后表皮增厚加剧及显著的炎性细胞浸润
对DNFB处理皮肤的H&E染色切片分析显示，与对照溶剂处理的皮肤相比，耳部皮肤的表皮增厚更为明显（

讨论

本方案提供了一种简单的方法 体内 分析Th-GM细胞亚群生成与扩增的检测方法。必须使用由半抗原或抗原诱导的小鼠T细胞介导的疾病模型，以模拟人类体内的免疫激活过程。DNFB是一种小分子半抗原，相较于多肽或蛋白质抗原，其在诱导T细胞免疫反应方面更具经济性和时间效率。 体内^18,19在疾病发展过程中，我们观察到，与使用其他半抗原（包括2,4,6-三硝基氯苯（TNCB）、氧杂蒽酮（OXA）或异硫氰酸荧光素（FITC））诱导相比，在C57BL/6J遗传背景的小鼠中，经DNFB激发产生的耳部肿胀反应幅度最大（数据未显示），尽管上述其他三种试剂已有报道可在小鼠中引发接触性敏感反应。¹⁴研究人员必须确定合适的小鼠品系和半抗原，以充分诱导疾病发生。

从耳组织中获得的细胞产量较低是处理较小鼠类组织时常遇到的最常见问题之一。这可能是由于胶原酶类型酶活性不足或所用消化试剂过期，导致酶消化不完全所致。为解决这.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2,4-二硝基氟苯	BT REAGENT	P0001746	CAS NO: 70-34-8
丙酮	CHRON CHEMICALS	/	67-64-1
抗CD4抗体	Biolegend	300506	1:100 稀释
抗CD44抗体	Biolegend	103012	1:100 稀释
抗CD62L抗体	Biolegend	104417	1:100 稀释
抗GM-CSF抗体	BD Bioscience	554507	1:100 稀释
抗IFN-γ抗体	Biolegend	505836	1:100 稀释
抗IL-17A抗体	BD Bioscience	563354	1:100 稀释
抗IL-22抗体	Biolegend	516411	5 µL/次检测
CD45	Biolegend	103101	1:200 稀释
水合氯醛	CHRON CHEMICALS	/	302-17-0
测微厚度计（0.01 mm型）	PEACOCK	G-1A	/
DMSO	LIFESCIENCES	D8371	67-68-5
EDTA Na2	Solarbio	E8030	6381-92-6
F4/80	Biolegend	123102	1:200 稀释
可固定活力染料780	BD Bioscience	565388	1:1,000 稀释，活力染料
流式细胞仪	BD Bioscience	BD FACS ARIA II SORP	/
GraphPad Prism	GraphPad Software	Prism 7	统计与绘图软件
胞内固定和通透缓冲液试剂盒	Thermo Fisher	88-8824-00	新鲜配制
离子霉素	Sigma-Aldrich	407951	CAS NO: 56092-81-0
Ly6G	Biolegend	127602	1:200 稀释
NovoExpress	Agilent	/	流式细胞术数据分析软件；https://www.agilent.com.cn/zh-cn/product/research-flow-cytometry/flow-cytometry-software/novocyte-novoexpress-software-1320805
橄榄油	YUANYE BIO	S30503	8001-25-0
PMA	Sigma-Aldrich	P8139	CAS NO: 16561-29-8
蛋白转运抑制剂（含布雷菲德菌素A）	BD Bioscience	555029	1 µL/mL