方法文章

接触性超敏反应小鼠模型中粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子产生型辅助性T细胞的分析

DOI：

10.3791/63755

⸱

2022年3月10日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Human Disease and Immunotherapies, West China Hospital, Sichuan University, 2Institute of Immunology and Inflammation, Frontiers Science Center for Disease-Related Molecular Network, West China Hospital, Sichuan University, 3Core Facilities of West China Hospital, Sichuan University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

此处介绍一种简单且标准化的方法，用于分析粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子产生型辅助性T细胞亚群 体内.

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

与传统的 Th1/Th2/Th17/Treg 细胞谱系并行，分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的辅助性 T 细胞（Th-GM 细胞）已被确认为辅助性 T 细胞的一个独特亚群（GM-CSF+ IFN-γ- IL-17A- IL-22- 效应CD4+ T细胞）在人类和小鼠中的研究。接触性超敏反应（CHS）被认为是研究人类变应性接触性皮炎（ACD）的优良动物模型，其表现出完整的T细胞介导的免疫应答。为在T细胞依赖性免疫应答中对Th-GM细胞亚群进行标准化和全面的分析，提供一种可靠的检测方法 体内，通过使用一种反应性低分子量有机半抗原2,4-二硝基氟苯（DNFB）进行致敏和激发，建立了小鼠CHS模型。效应CD4+ T细胞中的Th-GM亚群+ 通过流式细胞术分析了经半抗原免疫后产生的T细胞。我们发现，在DNFB诱导的接触性超敏反应小鼠模型中，Th-GM细胞主要在病变部位和引流淋巴结中扩增。该方法可用于进一步研究Th-GM细胞的生物学特性，以及在诸如变应性接触性皮炎（ACD）等多种疾病状态下，以GM-CSF为核心的治疗策略的药理学研究。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的辅助性T细胞——即Th-GM亚群——近年来被确认为在人类和小鼠中均存在的一类独特的辅助性T细胞亚群，被认为包含 "仅表达 GM-CSF" （GM-CSF+ IFN-γ- IL-17A- IL-22-通过单细胞RNA分析、质谱流式细胞术和GM-CSF命运图谱小鼠鉴定的CD4 T细胞1,2,32014年，Sheng等人报道了信号转导子和转录激活子5（STAT5）对Th-GM亚群的编程作用，并提出了该亚群的理论概念 "Th-GM" 首次进行子集分析4,5Th-GM细胞的特征是表达GM-CSF、IL-2、TNF-α、IL-3、CCL20等细胞因子，以及C-X-C趋化因子受体4型（CXCR4）或CXCR6等趋化因子受体。1,2STAT和/或NF-κB信号通路对于Th-GM谱系分化至关重要。 体外 建立了一种方法，利用IL-7在TCR刺激存在的情况下将初始CD4 T细胞分化为Th-GM细胞6同时，细胞因子IL-23和IL-1β被证明可维持Th-GM细胞的表达及其致病性 离体3,7.

Th-GM细胞的升高与多种自身免疫性疾病相关，例如多发性硬化症和类风湿性关节炎2,8,9，提示其在自身免疫发病机制中可能发挥重要作用10。越来越多的证据表明，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）可作为炎症介质发挥作用。在CD4+ T细胞中基因过表达Csf2（编码GM-CSF的基因）的小鼠会自发出现神经功能缺陷，并伴有吞噬细胞向中枢神经系统的浸润。在T细胞过继转移结肠炎模型中，将 Csf2−/− T细胞过继转移至Rag1−/−小鼠，可显著减轻疾病的临床表现和组织病理学特征。然而，关于Th-GM亚群在变应性接触性皮炎（ACD）等过敏性疾病中作用的研究报道尚少。

变应性接触性皮炎（ACD）是最常见的炎症性皮肤病之一，在工作和生活环境中的发病率较高11,12。它是一种由完整免疫回路介导的IV型迟发型超敏反应，其发生分为两个在时间上相继的阶段：致敏和激发。人类ACD由接触某些化学物质（半抗原或金属）引发，导致机体产生致敏。在此阶段，抗原呈递细胞呈递半抗原-蛋白质复合物，启动T细胞介导的免疫反应。当再次接触相同半抗原时，特异性的效应T细胞和记忆T细胞被重新激活并迁移至皮肤，此过程伴随多种免疫细胞群体的浸润。这种急性炎症反应被称为激发，最终导致皮损的完全形成13。人类ACD可通过接触性超敏反应（CHS）的动物模型进行研究14。

由一种反应性低分子量有机半抗原2,4-二硝基氟苯（DNFB）诱导的接触性超敏反应（CHS）模型是一种常用的小鼠模型，已被广泛用于研究变应性接触性皮炎（ACD）的病理机制及潜在的治疗干预措施15,16。因此，这一T细胞依赖性模型可用于研究过敏性疾病中Th-GM亚群的生成。本文中，我们采用DNFB诱导小鼠CHS模型，分析了病变部位及引流淋巴结中Th-GM亚群的生成情况，发现Th-GM亚群主要在再次接触相同半抗原时显著扩增。这表明Th-GM亚群可能在ACD的发展过程中起关键作用，并可作为ACD治疗的一个特异性靶点。

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方案

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本方案中使用的所有小鼠均为C57BL/6遗传背景，饲养于特定病原体阴性环境中，并可自由获取食物和水。ad libitum。所有实验均经四川大学华西医学中心动物福利伦理审查委员会批准（20210302059）。

1. 试剂与材料准备

  1. 0.5% DNFB 溶液作为致敏剂
    1. 为对 10 只小鼠进行致敏，准备 1.1 mL 体积比为 4:1 的丙酮/橄榄油（v/v）混合液：将 880 µL 丙酮与 220 µL 橄榄油混合，额外预留 0.1 mL 以补偿可能发生的微量体积损失。向 1.1 mL 均匀混合的丙酮/橄榄油 4:1 混合液中加入 5 µL DNFB。
      注意：应在致敏当天新鲜配制。丙酮/橄榄油混合液应在通风橱中配制。
  2. 0.2% DNFB 溶液作为激发剂
    1. 为激发 10 只小鼠，将 0.5 µL DNFB 加入 0.25 mL 均匀混合的丙酮/橄榄油 4:1 混合液中（该混合液配制方法见步骤 1.1）。在致敏后对小鼠进行激发时，使用丙酮/橄榄油 4:1 混合液作为溶剂。
      注意：丙酮/橄榄油混合液应在通风橱中配制。
  3. 水合氯醛作为麻醉剂
    1. 将 4 g 水合氯醛溶解于 50 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制成 8% 的工作液。过滤后于 4 °C 保存，最长可保存 3 个月。小鼠给药剂量为每克体重 5 µL。
  4. 50 倍浓度的 IV 型胶原酶储备液
    1. 将 100 mg IV 型胶原酶溶解于 1 mL 基础 RPMI 1640 培养基（不含抗生素和胎牛血清 [FBS]）中，配制成 100 mg/mL 的储备液。分装为 100 µL 每份，于 -20 °C 保存，最长可保存 6 个月。
  5. 1,000 倍浓度的 DNase I 储备液
    1. 将 5 mg DNase I 溶解于 1 mL 0.15 M NaCl 溶液中，配制成 5 mg/mL 的储备液。分装为 100 µL 每份，于 -20 °C 保存，最长可保存 6 个月。
  6. 终止缓冲液
    1. 将 1.681 g EDTA 溶解于 50 mL 基础 RPMI 1640 培养基中，配制成 100 mM 的储备液。于 4 °C 保存，最长可保存 2 周。
  7. 洗涤培养基
    1. 将 0.372 g EDTA 溶解于 500 mL PBS 中，终浓度为 2 mM，再加入 5 mL FBS，终浓度为 1%。过滤后于 4 °C 保存，最长可保存 1 个月。
  8. 染色缓冲液
    1. 将 0.372 g EDTA 溶解于 500 mL PBS 中，终浓度为 2 mM，再加入 10 mL FBS，终浓度为 2%。过滤后于 4 °C 保存，最长可保存 1 个月。
  9. 再刺激试剂
    1. 将 1 mg 佛波醇 12-十四烷酰-13-乙酸酯（PMA）溶解于 20 mL DMSO 中，配制成 50 µg/mL 储备液（500 倍浓度），分装为 50 µL 每份，于 -20 °C 保存。
    2. 将 250 µL 离子霉素溶液（4 mg/mL）加入 7.75 mL DMSO 中，配制成 500 µg/mL 储备液（500 倍浓度），分装为 50 µL 每份，于 -20 °C 保存。
    3. 将 1 mL 蛋白转运抑制剂溶液（含布雷菲德菌素 A）分装为 50 µL 每份，于 4 °C 保存。

2. 在小鼠中诱导 CHS

  1. 在第 -5 天，通过腹腔注射 400 mg/kg 水合氯醛对小鼠进行麻醉。
  2. 使用宠物剃毛器，将小鼠腹部约 2 cm × 2 cm 的区域剃毛。
    注意：避免划伤小鼠皮肤；保持皮肤屏障的完整性。
  3. 用带一次性吸头的移液器将 100 µL 的 0.5% DNFB 溶液均匀轻柔地涂抹于剃毛后的腹部区域。固定小鼠 5–10 秒，使部分溶剂挥发。
  4. 在第 -4 天，重复步骤 2.1–2.3，进行第二次致敏。
    注意：两次致敏的效果优于一次。
  5. 在第 0 天，使用带一次性吸头的移液器将 20 µL 的 0.2% DNFB 溶液涂抹于小鼠右耳进行激发，左耳则涂抹等体积的丙酮/橄榄油（4:1）混合液作为对照溶剂。
    注意：激发时应将等量的 DNFB 或对照溶剂分别涂抹于耳部的背侧和腹侧。
  6. 在接下来的 3 天内，每天使用数显测厚仪测量小鼠右耳和左耳的耳厚，并计算耳厚增加量：右耳厚度减去左耳厚度。
    ​注意：与对照溶剂处理的耳朵相比，接受 0.2% DNFB 激发的小鼠耳朵可观察到耳厚逐渐增加。

3. CHS 小鼠的样本采集

  1. 第3天，通过腹腔注射400 mg/kg水合氯醛对小鼠进行麻醉。等待5–10分钟，待小鼠进入无意识状态后，轻轻捏压双侧后肢脚趾，确认小鼠已深度麻醉。
  2. 使用相机拍摄每只小鼠双耳的照片。分别对耳部结痂（耳部脱屑）和红斑（耳部发红）进行评分，以评估炎症严重程度，评分标准为0至5分：0分，无；1分，轻微；2分，中等；3分，明显；4分，非常明显；5分，最严重。
  3. 通过颈椎脱臼法处死小鼠。用无菌的锋利剪刀和镊子剪下整个耳朵，并分离耳部平行引流的淋巴结。将组织置于冰上预冷的6孔板中的一个孔内，孔中含5 mL预冷的磷酸盐缓冲液（PBS），用于后续酶解或机械解离以制备单细胞悬液（补充图S1A 和 补充图S2A）。
  4. 对于组织学分析，将耳部样本固定于4%多聚甲醛中，随后进行脱水处理，并包埋于石蜡中，用于免疫组织化学染色，具体步骤参见其他文献17。

4. 耳组织单细胞悬液的制备

  1. 用两把弯头镊子夹住并撕开耳部组织的腹侧和背侧（补充图 S1B），将其放入6孔板的一个孔中，孔内含4.5 mL消化缓冲液，确保组织完全浸没在消化缓冲液中（补充图 S1C）。
    注意：消化缓冲液由含10% FBS的RPMI 1640培养基 + 25 mM HEPES + 2 mg/mL胶原酶IV + 5 µg/mL DNase I组成。
  2. 将耳部组织瓣置于37 °C细胞培养箱中孵育20分钟。用剪刀将耳部组织尽可能剪碎，以促进组织消化（补充图 S1D），然后将样品放回孵育箱继续孵育40分钟。
    注意：有效消化通常在40–50分钟内完成。在37 °C下过度消化会影响细胞活力。
  3. 每孔加入0.5 mL终止缓冲液，以中和胶原酶IV和DNase I的酶活性。后续步骤在冰上操作。
  4. 用一对弯头镊子将耳部组织碎片转移至含有70 µm细胞筛网的50 mL离心管中，并用移液器将全部培养基体积转移至同一细胞筛网中。
  5. 使用1 mL注射器活塞的顶端用力研磨组织，以环形方式按压70 µm细胞筛网，直至仅剩白色结缔组织为止（补充图 S1D）。
  6. 用1,000 µL洗涤液冲洗细胞筛网两次。将孔内全部液体体积通过40 µm细胞筛网转移至50 mL离心管中。将离心管置于冰上保存。

5. 制备引流淋巴结（dLNs）的单细胞悬液

  1. 用一对弯头镊子将淋巴结转移至6孔板孔中放置的70 µm细胞筛网上（补充图S2B）。使用1 mL注射器活塞的顶端轻轻研磨淋巴结，以环形按压方式作用于70 µm细胞筛网，直至仅剩白色残渣（补充图S2C）。
  2. 用1,000 µL洗涤液将细胞筛网冲洗两次。将孔内全部液体转移至5 mL离心管中。将离心管置于冰上保存。

6. 在蛋白转运抑制剂存在下，用佛波酯-12-肉豆蔻酸盐-13-乙酸盐（PMA）/离子霉素对 Th-GM 亚群进行再刺激

  1. 将耳部和引流淋巴结样本中分离的细胞在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 8 分钟，弃去上清液。用 1,000 µL 洗涤液轻轻重悬沉淀。
  2. 取每份样本的一小部分，使用血细胞计数板计数来自耳部和引流淋巴结的总细胞数。加入 0.04% 台盼蓝以测定细胞活力。
    注意：后续 T 细胞刺激与分析的细胞活力应高于 60%。细胞密度可为 1–5 × 106/mL。
  3. 将步骤 6.1 中的细胞离心并弃去上清液。用 1,000 µL 含 2% FBS 的 RPMI 1640 培养基轻轻重悬沉淀，并将 1 mL 单细胞悬液（106 个细胞/mL）接种至 12 孔平底组织培养板中。
  4. 向 12 孔板的每孔（含上述 1 mL 单细胞悬液）中加入 2 µL 佛波酯-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）（终浓度 100 ng/mL）、2 µL 离子霉素（终浓度 1,000 ng/mL）和 1 µL 蛋白转运抑制剂（含布雷菲德菌素 A），于 37 °C 孵育 4 小时。

7. 生成的 Th-GM 亚群分析 体内 通过细胞表面和细胞内染色

  1. 用移液器将刺激后的细胞转移至1.5 mL离心管中。在室温下以400 × g 离心8分钟，弃去上清液。
  2. 用1 mL染色缓冲液重悬细胞沉淀一次，并按照步骤7.1所述方法通过离心收集细胞。将细胞重悬于0.5 mL染色缓冲液中，浓度为1–10 × 106/mL。
  3. 向0.5 mL细胞悬液中加入0.5 µL活性染料原液（见材料表），立即涡旋混匀。室温避光孵育10分钟。用1 mL染色缓冲液洗涤细胞两次，并重复步骤7.1的离心操作以收集细胞沉淀。
  4. 将细胞沉淀重悬于0.1 mL染色缓冲液中。向三份0.1 mL的细胞悬液中分别加入1 µL抗CD4抗体（FITC标记）、1 µL抗CD44抗体（APC标记）和1 µL抗CD62L抗体（PE/Cyanine7标记）。立即涡旋混匀，并在避光条件下室温孵育15分钟。
  5. 重复步骤7.3中的洗涤和离心操作。
  6. 将细胞沉淀重悬于200 µL细胞内固定缓冲液中，避光孵育20分钟。同时，将1份透膜缓冲液（10x）与9份蒸馏水混合，配制成1x透膜缓冲液。用1 mL 1x透膜缓冲液在室温下以600 × g 离心5分钟，洗涤细胞两次。
  7. 将细胞沉淀重悬于0.1 mL 1x透膜缓冲液中，加入针对GM-CSF（PE标记，1 µL/测试）、IFN-γ（BV711标记，1 µL/测试）、IL-17A（BV421标记，1 µL/测试）和IL-22（PerCP/Cyanine5.5标记，5 µL/测试）的抗体，避光室温孵育30分钟。
  8. 重复步骤7.6中的洗涤和离心操作。
  9. 将细胞沉淀重悬于200 µL PBS中，并将悬液转移至圆底试管中。使用流式细胞仪检测染色后的细胞。

8. 鉴定 Th-GM 亚群的设门策略

  1. 使用流式细胞术分析软件（详见材料表中所用软件信息）并按照补充图S1所示的设门策略进行数据分析。对于此处使用的软件，需先下载并在计算机上安装配置。
  2. 通过点击软件中的文件 | 打开 | 导入FCS文件来导入流式细胞术数据，并通过选择重命名标签为每个样本标注组别和名称。
  3. 在FSC与SSC散点图上（FSClow SSClow，P1）选择淋巴细胞，以排除位于左下角的碎片以及体积较大、颗粒度较高的髓系细胞。点击密度图，并将该图的X轴设为FSC-A，Y轴设为SSC-A。
  4. 双击P1中的事件以生成另一个密度图，并通过该图中细胞高度与面积的关系（X轴为FSC-A，Y轴为FSC-H）将单细胞（呈直线相关分布，P2）与细胞聚集体区分开来。
  5. 双击P2中的事件以生成下一个密度图，将该图的X轴设为FSC-A，Y轴设为SSC-A。通过FVS 780-事件圈选活细胞群体（P3）。
  6. 双击P3中的事件以生成下一个密度图（X轴为CD4-A，Y轴为SSC-A），并通过选择CD4+细胞群（P4）来识别CD4 T细胞。
  7. 双击P4中的事件以生成另一个密度图（X轴为CD44-A，Y轴为CD62L-A），并通过选择该图右上象限的细胞群（CD62L- CD44+，P5）定义效应T辅助细胞。

9. 统计分析

  1. 采用非配对 t 检验进行统计分析，比较两组数据。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001（均值 ± 标准差）。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

小鼠中由DNFB诱导的CHS（接触性超敏反应）
为了在小鼠中诱导CHS，采用在耳部皮肤施加DNFB的方式对小鼠进行致敏和激发，如图1A所示。与对照溶剂处理的小鼠相比，经DNFB激发的小鼠耳部厚度（表皮海绵样变的指标）显著增加（图1B，第1天为70 vs 3 µm，第2天为203 vs 7.5 µm，第3天为276 vs 5 µm）。激发后72小时，小鼠右耳出现红斑、结痂和增厚现象，而对照溶剂处理的耳朵未见任何炎症迹象（图1C）。DNFB激发组小鼠耳朵的结痂和红斑评分均高于对照溶剂处理组（图1D）。

DNFB攻击后表皮增厚加剧及显著的炎性细胞浸润
对DNFB处理皮肤的H&E染色切片分析显示，与对照溶剂处理的皮肤相比，耳部皮肤的表皮增厚更为明显（

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案提供了一种简单的方法 体内 分析Th-GM细胞亚群生成与扩增的检测方法。必须使用由半抗原或抗原诱导的小鼠T细胞介导的疾病模型，以模拟人类体内的免疫激活过程。DNFB是一种小分子半抗原，相较于多肽或蛋白质抗原，其在诱导T细胞免疫反应方面更具经济性和时间效率。 体内18,19在疾病发展过程中，我们观察到，与使用其他半抗原（包括2,4,6-三硝基氯苯（TNCB）、氧杂蒽酮（OXA）或异硫氰酸荧光素（FITC））诱导相比，在C57BL/6J遗传背景的小鼠中，经DNFB激发产生的耳部肿胀反应幅度最大（数据未显示），尽管上述其他三种试剂已有报道可在小鼠中引发接触性敏感反应。14研究人员必须确定合适的小鼠品系和半抗原，以充分诱导疾病发生。

从耳组织中获得的细胞产量较低是处理较小鼠类组织时常遇到的最常见问题之一。这可能是由于胶原酶类型酶活性不足或所用消化试剂过期，导致酶消化不完全所致。为解决这...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作得到国家自然科学基金（编号 81602763、81803142、82003347）、中国博士后科学基金优秀博士后研究人员计划（编号 2017T100700）以及中国博士后科学基金常规项目（编号 2016M592673）的资助。作者谨此感谢四川大学华西医院科研公共服务平台王艳、朱梦莉（Yan Wang 和 Meng-Li Zhu）在本研究中提供的流式细胞术技术支援。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2,4-二硝基氟苯BT REAGENTP0001746CAS NO: 70-34-8
丙酮CHRON CHEMICALS/67-64-1
抗CD4抗体Biolegend3005061:100 稀释
抗CD44抗体Biolegend1030121:100 稀释
抗CD62L抗体Biolegend1044171:100 稀释
抗GM-CSF抗体BD Bioscience5545071:100 稀释
抗IFN-γ抗体Biolegend5058361:100 稀释
抗IL-17A抗体BD Bioscience5633541:100 稀释
抗IL-22抗体Biolegend5164115 µL/次检测
CD45Biolegend1031011:200 稀释
水合氯醛CHRON CHEMICALS/302-17-0
测微厚度计（0.01 mm型）PEACOCKG-1A/
DMSOLIFESCIENCESD837167-68-5
EDTA Na2SolarbioE80306381-92-6
F4/80Biolegend1231021:200 稀释
可固定活力染料780BD Bioscience5653881:1,000 稀释，活力染料
流式细胞仪BD BioscienceBD FACS ARIA II SORP/
GraphPad PrismGraphPad SoftwarePrism 7统计与绘图软件
胞内固定和通透缓冲液试剂盒Thermo Fisher88-8824-00新鲜配制
离子霉素Sigma-Aldrich407951CAS NO: 56092-81-0
Ly6GBiolegend1276021:200 稀释
NovoExpressAgilent/流式细胞术数据分析软件；https://www.agilent.com.cn/zh-cn/product/research-flow-cytometry/flow-cytometry-software/novocyte-novoexpress-software-1320805
橄榄油YUANYE BIOS305038001-25-0
PMASigma-AldrichP8139CAS NO: 16561-29-8
蛋白转运抑制剂（含布雷菲德菌素A）BD Bioscience5550291 µL/mL

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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