我们描述了一种可重复、自动化且无偏倚的成像系统，该系统利用人源工程化骨骼肌组织和光遗传学运动神经元来表征神经肌肉接头功能。该系统能够随时间对神经肌肉连接的功能进行定量分析，并可检测由神经毒素及重症肌无力患者血清引起的神经肌肉功能下降。
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摘要
摘要
许多神经肌肉疾病（如重症肌无力，MG）均与神经肌肉接头（NMJ）功能障碍相关，但由于动物与人类之间存在生理差异，该接头在动物模型中难以准确表征。组织工程技术为提供 体外 可用于诊断和研究神经肌肉接头（NMJ）病理并测试潜在治疗手段的功能性人源NMJ模型。通过将光遗传蛋白引入诱导性多能干细胞（iPSCs），我们构建了可被特定波长光刺激的神经元。若NMJ结构健康且功能正常，运动神经元发出的神经化学信号将引发肌肉收缩。结合光遗传学、微加工技术与组织工程学，我们建立了一种基于视频分析的无偏倚、自动化方法，用于表征NMJ功能。本研究制定了标准化操作流程，涵盖NMJ构建、同步进行光学刺激与视频记录，以及组织收缩性的视频分析。利用光刺激光遗传学运动神经元以诱导骨骼肌收缩，可模拟人类NMJ的生理过程，并实现对NMJ功能在不同时间点及不同干预条件下的重复性功能检测。我们展示了该平台能够呈现神经肌肉连接功能随时间改善的能力，并可表征重症肌无力患者抗体或神经毒素对NMJ功能造成的损害效应。
引言
神经肌肉接头（NMJ）是运动神经元（MNs）与骨骼肌细胞（SkM）之间的化学突触，介导肌肉收缩。某些毒素（如神经毒素α-银环蛇毒素（BTX））或神经肌肉疾病（NMD）（如重症肌无力（MG））可导致NMJ退化，进而造成肌肉控制能力下降1。与动物模型相比，生物工程化的人体组织模型能更真实地模拟人类NMJ的功能和生理机制，并具有更高的转化应用潜力。
尽管动物模型推动了对神经肌肉接头（NMJ）形成与功能的理解，但人类与动物突触之间存在显著差异，这限制了研究结果向人类的转化，也使得在体（in vivo）条件下对NMJ的表征变得困难2,3,4。研究表明，小鼠与人类的NMJ在生理特性上存在明显差异。与人类NMJ相比，小鼠的NMJ更大，但活性区密度更低4。此外，在动物模型中开展的药物研究并不总能反映人类临床试验中观察到的效果。工程化的人体组织模型为研究NMJ的正常发育过程、神经肌肉疾病的病理机制以及开展药物筛选提供了可能。人诱导多能干细胞（hiPSCs）5可被分化为多种细胞类型，包括骨骼肌细胞
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方案
本研究中使用的所有细胞系均按照美国纽约哥伦比亚大学的机构指南创建和使用。
1. 生物反应器准备
- 制作生物反应器模具
- 从补充CAD文件下载生物反应器的CAD文件，或自行设计定制方案。
- 使用CAM软件根据3D模型生成数控（CNC）加工路径。
- 使用数控铣床加工聚甲醛（acetal）模具。
- 生物反应器的制备
- 按10:1的基础剂与固化剂比例混合聚二甲基硅氧烷（PDMS，每4个平台/模具使用77 g混合物）。
- 将混合物放入真空腔室，关闭所有阀门，开启真空泵，至少脱气30分钟，直至无气泡残留。将混合物倒入模具中，并将模具置于真空腔室内继续脱气1小时。
- 用模具的上半部分以正确方向盖合模具。在中心位置放置一根钢制六角棒，并在两侧夹紧。
- 用PDMS重新填充顶部空隙。
- 在65 °C烘箱中固化至少4小时。
- 冷却至室温后，将平台从模具中取出。
- 使用超声波清洗机依次以洗洁精、400 mL 100%异丙醇和蒸馏水各清洗1小时，对装置进行清洁。
- 在65 °C下干燥过夜。
- 将玻璃盖玻片浸泡在1%非离子型聚醇表....
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结果
通过共培养光遗传学人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的运动神经元与非光遗传学骨骼肌组织，生成了神经肌肉接头。将人原代骨骼肌成肌细胞（SkM）接种至培养平台中，并采用为期2周的方案分化为多核肌管。光遗传学运动神经元在肌管分化的同时单独进行分化，随后接种至平台中（图1）。在运动神经元接种后7–12天，组织开始在蓝光刺激下发生收缩，表明神经肌肉接头已成功形成并趋于成熟。神经肌肉接头在运动神经元接种后可培养、刺激和成像长达40天，但最佳观测时间点为第16天19。分化过程的形态学与生化验证以及光遗传学蛋白的表达情况见于补充图1，并在先前的研究中得到验证18,19。
为了证明该方案可轻松适配于不同的培养系统，本研究采用两种不同的区室化反应器进行了验证：一种微流控装置和一种开放式培养孔生物反应器。这两种系统具有相似的设计，其中一个腔室设有用.......
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讨论
该系统是一种经过工程化设计的三维人体组织模型，结合了光遗传学与视频处理技术，可实现对神经肌肉接头（NMJ）功能的自动化且无偏倚的评估。通过采用标准化的实验方案，我们已证明该系统能够测量生理发育过程中NMJ功能的变化，并表征诸如神经毒素暴露以及重症肌无力患者血清等病理条件对NMJ造成的损害效应。
既往研究报道，可通过将重症肌无力（MG）患者血清与光遗传学人多能干细胞（hPSC）来源的运动神经元和骨骼肌肌管共培养，建立MG的体外模型22。然而，该系统为二维培养，且在随机位置记录肌肉收缩，从而限制了实验的可重复性，并降低了模型的定量分析能力。与二维系统相比，本系统最大的优势在于能够模拟三维环境，更真实地促进运动神经元（MNs）与骨骼肌细胞（SkMs）之间的细胞相互作用和形态发育。大量证据表明，三维系统在模拟组织表现出类似其天然生理状态所需的生物力学信号方面具有显著优势13,14,
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们衷心感谢美国国立卫生研究院（NIH）[资助编号 EB025765 和 EB027062]、美国国防部（DOD）[奖项编号 W81XWH-18-1-0095] 以及加州大学旧金山分校健康创新工程中心（HIVE 奖学金）提供的资金支持。我们衷心感谢哥伦比亚大学干细胞中心在细胞重编程方面提供的帮助与指导。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>细胞 | |||
| SkMDC | Cook Myosite | P01059-14M | |
| <强>培养基与添加剂 | |||
| 高级DMEM/F12 | 赛默飞世尔科技 | 12634-020 | |
| 牛血清白蛋白溶液 | Millipore Sigma | A9576-50ML | |
| G-5 补充剂（100 倍浓缩） | 赛默飞世尔科技 | 17503-012 | |
| 遗传霉素选择性抗生素（G418硫酸盐）（50 mg/mL） | 赛默飞世尔科技 | 10131-035 | |
| 胰岛素，重组人源 | 默克生命科学 | 91077C-100MG | |
| 基质胶 | 康宁 | 354277 | |
| mTeSR Plus | 干细胞技术 | 100-0276 | |
| MyoTonic 生长培养基试剂盒 | Cook Myosite | MK-4444 | |
| N-2 补充剂 | 赛默飞世尔科技 | 17502-048 | |
| NbActiv4 500 mL | BrainBits LLC | Nb4-500 | |
| Neurobasal 培养基 | 赛默飞世尔科技 | 21103-049 | |
| Neurobasal-A 培养基 | 赛默飞世尔科技 | A13710-01 | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| ReLeSR | 干细胞技术 | 5872 | |
| <强>塑料器皿 | |||
| 30 mm 笼式立方体系统 | ThorLabs | CM1-DCH, CP33, ER1-P4 和 ER2-P4 | |
| 37 µm 可逆过滤器，大型 | 干细胞技术 | 27250 | |
| 546 nm短通激发滤光片 | Semrock | FF01-546/SP-25 | |
| 573 nm 二向色镜 | Semrock | FF573-Di01–25x36 | |
| 594 nm 长通发射滤光片 | Semrock | BLP01-594R-25 | |
| 594 nm 长通激发滤光片 | Semrock | BLP01-594R-25 | |
| 蓝色（470 nm）Rebel LED，安装于 SinkPAD-II 10 mm 方形基座 - 700 mA 时 65 流明 | LuxeonStarLEDs | SP-05-B4 | |
| Carclo 29.8° 带集成支腿的霜面10毫米圆形光束光学件 | LuxeonStarLEDs | 10413 | |
| Corning 60 mm 超低吸附培养皿 | 康宁 | 3261 | |
| 散热器 | LuxeonStarLEDs | LPD-19-10B | |
| <强>光学 | |||
| pluriStrainer 400 µm，25 个装，无菌 | PluriSelect | 43-50400-03 | |
| pluriStrainer 500 µm，25 个装，无菌 | PluriSelect | 43-50500-03 | |
| 红光（627 nm）Rebel LED，安装于 SinkPAD-II 10 mm 方形基座 - 700 mA 下光通量为 65 流明 | LuxeonStarLEDs | SP-05-R5 | |
| 环形驱动虹膜光圈 | ThorLabs | SM1D12D | |
| T-Cube LED 驱动器 | ThorLabs | LEDD1B, KPS101 | |
| <强>霉菌 | |||
| 带内螺纹六角间隔柱， 3 1/2" 10-32，半螺纹 1/2" | 麦克马斯特 | 91920A046 | |
| 低剖面 C型夹 | 麦克马斯特 | 1705A12 | |
| <强>生长因子 | |||
| 腺苷3′,5′-环一磷酸 | Millipore Sigma | A9501-1G | |
| CHIR 99021，10 mg | Tocris | 4423/10 | |
| DAPT 10 mg | R&D Systems | 2634/10 | |
| 人源CNTF，研究级，5 µg | Miltenyl Biotec | 130-096-336 | |
| 人玻璃连接蛋白蛋白，CF | R&D Systems | 2349-VN-100 | |
| 人玻璃连接蛋白蛋白，CF | R&D Systems | 2349-VN-100 | |
| IGF1 重组人蛋白 | 赛默飞世尔科技 | PHG0078 | |
| 小鼠层粘连蛋白，天然 | 赛默飞世尔科技 | 23017015 | |
| 重组人Agrin蛋白 | R&D Systems | 6624-AG-050 | |
| 重组人GDNF蛋白，CF 50μg | R&D Systems | 212-GD-050/CF | |
| 重组人神经营养因子3 100 μg | 细胞科学 | CRN500D | |
| 重组人神经营养素-4 | 细胞科学 | CRN501B | |
| 重组人音猬因子/Shh（C24II）N端 | R&D Systems | 1845-SH-100 | |
| 重组人/小鼠/大鼠 BDNF 50 μg | Peprotech | 450-02 | |
| 视黄酸，50 mg | Millipore Sigma | R2625-50 | |
| SAG 激活剂 | Millipore Sigma | 566660 | |
| SB431542 10 mg | 干细胞技术 | 72234 | |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-103-925 | |
| 人血浆来源的玻璃粘连蛋白 | Millipore Sigma | V8379-50UG | |
| Y-27632 二盐酸盐 | Tocris | 1254 | |
| <强>抗体 | |||
| α-肌动蛋白结合蛋白单克隆抗体（小鼠 IgG1） | Abcam | ab9465 | |
| 胆碱乙酰转移酶 (ChAT) (山羊) | Millipore | AB144P | |
| 结蛋白单克隆抗体（小鼠 IgG1） | Dako | M076029-2 | |
| 肌球蛋白重链（MHC）（小鼠 IgG2b） | DSHB | MF20 | |
| <强>仪器设备 | |||
| Arduino Uno R3 | Arduino | A000066 | |
| 自动载物台 | 应用科学仪器 | MS-2000 XYZ | |
| 扩展型等离子清洗机 | Harrick Plasma | PDC-001 (115V) | |
| Invitrogen Countess 自动细胞计数仪 | Marshal Scientific | I-CACC | |
| IX-81 倒置荧光显微镜 | Olympus | IX-ILL100LH | |
| 系列阶段顶部培养箱系统 | Tokai Hit STX | TOKAI-HIT-STXG | |
| Zyla 4.2 sCOMS 相机 | Andor Technology | ZYLA-4.2P-CL10 | |
| <强>软件 | |||
| Arduino 软件（IDE） | Arduino | IDE 1.8.19 | |
| Mastercam | Mastercam | Solidworks 的 Mastercam | |
| Matlab | Matlab | R2021b | |
| NIS元素 | 尼康 | 基础研究 | |
| Solidworks 3D CAD | Solidworks | Solidworks 标准版 |
参考文献
- Al-bassam, W., et al. Characteristics, incidence, and outcome of patients admitted to the intensive care unit with myasthenia gravis. Journal of Critical Care. 45, 90-94 (2018).
- Vila, O. F., Qu, Y., Vunjak-Novakovic, G.
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重印与许可
