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方法文章

构建与表征人源神经肌肉接头的光遗传学模型

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DOI：

10.3791/63759

⸱

2022年4月14日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 2Department of Medicine, Columbia University, 3Gladstone Institutes, 4College of Dental Medicine, Columbia University

本文内容

摘要

我们描述了一种可重复、自动化且无偏倚的成像系统，该系统利用人源工程化骨骼肌组织和光遗传学运动神经元来表征神经肌肉接头功能。该系统能够随时间对神经肌肉连接的功能进行定量分析，并可检测由神经毒素及重症肌无力患者血清引起的神经肌肉功能下降。

摘要

许多神经肌肉疾病（如重症肌无力，MG）均与神经肌肉接头（NMJ）功能障碍相关，但由于动物与人类之间存在生理差异，该接头在动物模型中难以准确表征。组织工程技术为提供 体外 可用于诊断和研究神经肌肉接头（NMJ）病理并测试潜在治疗手段的功能性人源NMJ模型。通过将光遗传蛋白引入诱导性多能干细胞（iPSCs），我们构建了可被特定波长光刺激的神经元。若NMJ结构健康且功能正常，运动神经元发出的神经化学信号将引发肌肉收缩。结合光遗传学、微加工技术与组织工程学，我们建立了一种基于视频分析的无偏倚、自动化方法，用于表征NMJ功能。本研究制定了标准化操作流程，涵盖NMJ构建、同步进行光学刺激与视频记录，以及组织收缩性的视频分析。利用光刺激光遗传学运动神经元以诱导骨骼肌收缩，可模拟人类NMJ的生理过程，并实现对NMJ功能在不同时间点及不同干预条件下的重复性功能检测。我们展示了该平台能够呈现神经肌肉连接功能随时间改善的能力，并可表征重症肌无力患者抗体或神经毒素对NMJ功能造成的损害效应。

引言

神经肌肉接头（NMJ）是运动神经元（MNs）与骨骼肌细胞（SkM）之间的化学突触，介导肌肉收缩。某些毒素（如神经毒素α-银环蛇毒素（BTX））或神经肌肉疾病（NMD）（如重症肌无力（MG））可导致NMJ退化，进而造成肌肉控制能力下降1。与动物模型相比，生物工程化的人体组织模型能更真实地模拟人类NMJ的功能和生理机制，并具有更高的转化应用潜力。

尽管动物模型推动了对神经肌肉接头（NMJ）形成与功能的理解，但人类与动物突触之间存在显著差异，这限制了研究结果向人类的转化，也使得在体（in vivo）条件下对NMJ的表征变得困难2,3,4。研究表明，小鼠与人类的NMJ在生理特性上存在明显差异。与人类NMJ相比，小鼠的NMJ更大，但活性区密度更低4。此外，在动物模型中开展的药物研究并不总能反映人类临床试验中观察到的效果。工程化的人体组织模型为研究NMJ的正常发育过程、神经肌肉疾病的病理机制以及开展药物筛选提供了可能。人诱导多能干细胞（hiPSCs）5可被分化为多种细胞类型，包括骨骼肌细胞6,7和运动神经元8,9。hiPSCs可便捷地由患者细胞制备，从而通过患者特异性的组织模型实现更优的疾病建模10和药物筛选11,12。

骨骼肌细胞（SkMs）与运动神经元（MNs）的二维（2D）单层共培养体系缺乏生理性神经肌肉接头（NMJs）的形态、表型、结构组织及功能行为。在二维培养中，神经肌肉接头随机形成，这阻碍了运动单位的分离分析，限制了精确的功能测量，并使其无法用于重复性、系统性的实验13。三维（3D）神经肌肉接头组织模型克服了上述诸多局限，能够重现生理性神经肌肉接头的形态学与功能特征7,14,15,16,17。利用该模型，两种组织类型可先分别培养，再通过引导轴突生长实现整合，从而形成比二维培养系统更为有序的神经肌肉接头。

我们之前的研究表明，将光遗传学与组织工程技术相结合，能够实现对神经肌肉接头（NMJ）功能的精确无创刺激和评估18,19。通过基因工程，可将光敏感蛋白整合到人诱导多能干细胞（hiPSCs）的基因组中。将响应蓝光而开启的离子通道——通道视紫红质-2（ChR2）整合到神经元等可兴奋细胞的膜上，可实现对细胞激活的非接触式时空控制20,21,22。携带ChR2的hiPSCs可分化为对蓝光敏感的光遗传学运动神经元，从而无需使用传统侵入性电极来刺激神经元，并避免电极对肌细胞产生不必要的刺激23。该系统利用光遗传学运动神经元刺激非光遗传学的骨骼肌细胞产生收缩。结合视频采集与可控蓝光照射，可同时对共培养的组织进行刺激和记录，以评估神经肌肉接头功能。

重症肌无力（MG）由靶向烟碱型乙酰胆碱受体（AChR）的自身抗体引起，导致神经肌肉接头（NMJ）功能下降和肌肉无力24根据临床症状、电生理诊断以及通过血清学血液检测发现的自身抗体进行诊断。然而，并非所有参与重症肌无力（MG）的自身抗体均已被识别，部分血清阴性患者虽被诊断为MG，但尚未发现明确的抗体。25,26我们的系统可在添加重症肌无力（MG）患者血清前后，对神经肌肉接头（NMJ）进行重复的功能评估，从而深入揭示MG抗体所引起的功能性与生物化学改变。18. 本方案阐述了如何制备3D 体外 可用于诊断和研究神经肌肉接头（NMJ）病理并测试潜在治疗手段的功能性人类NMJ模型。我们展示了该系统在两种平台上的多功能性：一种微流控装置和一种较大的开放式培养皿生物反应器平台。

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方案

本研究中使用的所有细胞系均按照美国纽约哥伦比亚大学的机构指南创建和使用。

1. 生物反应器准备

  1. 制作生物反应器模具
    1. 从补充CAD文件下载生物反应器的CAD文件，或自行设计定制方案。
    2. 使用CAM软件根据3D模型生成数控（CNC）加工路径。
    3. 使用数控铣床加工聚甲醛（acetal）模具。
  2. 生物反应器的制备
    1. 按10:1的基础剂与固化剂比例混合聚二甲基硅氧烷（PDMS，每4个平台/模具使用77 g混合物）。
    2. 将混合物放入真空腔室，关闭所有阀门，开启真空泵，至少脱气30分钟，直至无气泡残留。将混合物倒入模具中，并将模具置于真空腔室内继续脱气1小时。
    3. 用模具的上半部分以正确方向盖合模具。在中心位置放置一根钢制六角棒，并在两侧夹紧。
    4. 用PDMS重新填充顶部空隙。
    5. 在65 °C烘箱中固化至少4小时。
    6. 冷却至室温后，将平台从模具中取出。
    7. 使用超声波清洗机依次以洗洁精、400 mL 100%异丙醇和蒸馏水各清洗1小时，对装置进行清洁。
    8. 在65 °C下干燥过夜。
    9. 将玻璃盖玻片浸泡在1%非离子型聚醇表面活性剂中30分钟，并确保盖玻片不重叠，以保证充分涂层。
    10. 用蒸馏水充分冲洗，并在65 °C下干燥过夜。
    11. 使用等离子清洗机，以6 L/min的氧气流量在高功率下处理1–2分钟，对玻璃盖玻片和PDMS平台进行表面活化。处理后，立即通过将PDMS压在盖玻片上至少30秒，实现两者的键合。
    12. 在接种细胞前，对键合后的装置进行高压灭菌处理。

2. 构建光学刺激装置

  1. 使用 30 mm 笼式立方体系统，将一块 573 nm 二向色镜安装在中心位置。将一个红色 627 nm LED 与一块 594 nm 长通激发滤光片耦合，并将其安装在立方体的顶部侧面，使 LED 朝向二向色镜。然后将一个蓝色 488 nm LED 与一块 546 nm 短通激发滤光片安装在立方体的相邻侧面，使 LED 朝向二向色镜，如 图 3A 示意图所示。
  2. 在笼式立方体底部安装一个环控虹膜光阑，以控制照明区域的大小。
  3. 通过 T-Cube LED 驱动器为每个 LED 供电，并使用 Arduino Uno Rev3 板进行控制。将 LED 驱动器的侧边输入端连接至电源插头，中间输出端连接至 Arduino，侧边输出端直接连接至 LED。
  4. 通过 USB 线缆将 Arduino Uno 连接到计算机。
  5. 从 GitHub 链接（https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis）下载文件。
  6. 打开 GitHub 文件夹中的 "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" 文件。
  7. 设置起始参数：步数 = 30；起始频率 = 0.5；终止频率 = 3；脉冲长度 = 100。
  8. 确保引脚输出 4 分配给蓝色 LED 驱动器，引脚输出 2 分配给红色 LED 驱动器。检查 LED 驱动器的中间导线是否已连接至接地端和相应的引脚输出端。
  9. 编译并加载 "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" 程序至 Arduino。
  10. 将每个 LED 驱动器连接至对应的通道。

3. 细胞培养设置（第 -21 至 0 天）

  1. 原代骨骼肌细胞
    1. 解冻并扩增原代骨骼肌成肌细胞（购自 Cook Myosite），使用肌强直生长培养基（含补充剂）最多传代六次。将细胞维持在 37 °C、5% CO2 的培养箱中。
    2. 每两天更换一次培养基。
    3. 当细胞融合度达到约 60% 时，使用 0.05% 胰蛋白酶-EDTA（1×，37 °C 下作用 5 分钟）进行传代。收集解离的细胞，并加入新鲜培养基以中和胰蛋白酶。
    4. 在 300 x g 条件下离心细胞，吸除细胞沉淀上方的上清液。
    5. 用 MGM 重悬细胞，按 1:3 比例接种，每三联瓶接种 60 mL。
  2. ChR2-hiPSC
    注意：本研究所使用的所有细胞系均按照美国纽约哥伦比亚大学的机构指南创建和使用。在本方案中，表达 ChR2 的 hiPSCs 通过 CRISPR-Cas9 基因组编辑技术生成，方法如先前文献所述18，但任何稳定的光遗传学细胞系（如慢病毒、piggyBac 等）均可采用相同方式使用。选用在 iPSCs 和运动神经元中均能组成型表达的启动子（CAG）。如先前发表的研究所指出18, 19，这些细胞具有正常的核型。
    1. 用 DMEM/F12 按 1:80 稀释的可溶性基底膜基质溶液包被 6 孔板，每孔 1 mL，室温孵育 1 小时。
    2. 在包被好的 6 孔板中接种 iPSCs，每孔加入 2 mL 无饲养层细胞培养基（iPSC 培养基），每隔一天更换 2 mL 新鲜培养基，每 5–7 天传代一次。将细胞维持在 37°C 和 5% CO2 的培养箱中。
    3. 传代
      1. 将干细胞与 1 mL 无酶干细胞释放试剂孵育 4 分钟，并用宽口 P1000 移液器进行机械剪切以实现解离。
      2. 在包被好的 6 孔板中，每孔加入 2 mL iPSC 培养基，按 1:24 或 1:48 的比例接种细胞，同时加入 2 μM 盐酸Y-27632。

4. 骨骼肌组织接种（第 -3 天）

  1. 使用自动细胞计数器分离并计数 30 × 106 个成肌细胞。
  2. 将成肌细胞重悬于 I 型胶原蛋白（3 mg/mL）与溶解的基底膜基质的 4:1 混合液中（800 μL 胶原混合液 + 200 μL 基底膜基质，终体积为 1 mL）。配制胶原成分时，加入配套的中和试剂（胶原与中和试剂按 9:1 混合），并用 1× PBS 稀释至终体积 800 μL。
  3. 向生物反应器的每个肌肉腔室中加入 15 μL 细胞-胶原悬液，使用移液枪头确保悬液均匀覆盖两个支柱（图 2）。
  4. 将细胞-凝胶混合物在 37 °C 下聚合 30 分钟，随后向每个生物反应器孔中加入 450 μL 成肌细胞生长培养基。
  5. 3 天后（待凝胶收缩完成后），开始成肌管分化。

5. 肌管分化（第0-14天）

  1. 通过将组织更换为 450 μL 融合诱导培养基（FS，表 1）开始肌管融合，持续 7 天，每隔一天更换一次培养基。
    注意：建议在人诱导性多能干细胞向运动神经元分化的同一天开始肌管分化，以便在两种细胞类型的分化周期结束时进行运动神经元接种。
  2. 第 7 天，将培养基更换为 450 μL 成熟培养基 Ia（MMIa，表 1）。
  3. 第 9 天，更换为 450 μL 成熟培养基 Ib（MMIb，表 1）。
  4. 第 11 天，将培养基更换为 450 μL NbActiv4。此后每 2 天更换一次培养基，直至接种运动神经元（步骤 7）。

6. 运动神经元分化（第 0-14 天）

注意：我们的运动神经元分化方案改编自 Maury 等人8。

  1. 第0天，将4 × 106个ChR2- hiPSCs转移至含15 mL运动神经元悬浮培养基（MSCM，表1）的超低吸附培养皿中。在MSCM中添加3 μM CHIR99021、0.2 μM LDN193189、40 μM SB431542水合物和5 μM Y-27632二盐酸盐。
  2. 第2天，使用37 μM可逆滤网分离神经球（NS），并将其重悬于含3 μM CHIR99021、0.2 μM LDN193189、40 μM SB431542水合物和0.1 μM视黄酸的15 mL MSCM中。自第2天起，在不使用显微镜的情况下即可在培养皿中观察到神经球。
  3. 第4天，将细胞及培养基转移至50 mL离心管中，静置使神经球沉降至管底（5分钟）。吸除上清液，并将细胞重悬于15 mL MSCM中，该培养基需添加0.5 μM SAG、0.2 μM LDN193189、40 μM SB431541和0.1 μM视黄酸。
  4. 第7天，重复步骤6.3，但将细胞重悬于15 mL含0.5 μM SAG和0.1 μM视黄酸的MSCM中。
  5. 第9天，重复步骤6.3，但将细胞重悬于15 mL含10 μM DAPT的MSCM中。
  6. 第11天，重复步骤6.3，但将细胞重悬于15 mL含20 ng/mL BDNF和10 ng/mL GDNF的MSCM中。
  7. 第14天，将运动神经元接种至实验平台中。

7. 在生物反应器中接种运动神经元聚集体（第14天）

  1. 制备4:1的凝胶混合物，包含2 mg/mL I型胶原蛋白和Matrigel（800 μL胶原蛋白混合物 + 200 μL Matrigel，最终体积为1 mL）。对于胶原蛋白组分，加入配套的中和剂（胶原蛋白与中和剂按9:1比例混合），并用1× PBS稀释至最终体积为800 μL。
  2. 使用400 nm细胞筛筛选较大的神经球，并将其重悬于凝胶混合物中。
  3. 吸除储液池中的培养基，并小心吸除神经球孔道中的培养基（图2）。
  4. 向神经球通道中加入15 μL凝胶混合物。
  5. 用10 μL移液器吸取10 μL凝胶，然后挑取一个神经球。
  6. 将神经球（NS）置入神经球通道中，并确保其位于腔室内。在释放剩余凝胶的同时缓慢提起移液器。若不确定神经球是否已正确放置，可通过显微镜检查其位置。
  7. 在37 °C条件下静置30分钟，使凝胶完成聚合。
  8. 向储液池中加入450 μL NbActiv4培养基，补充20 ng/mL BDNF和10 ng/mL GDNF。
  9. 每隔一天更换一次培养基，以促进神经球向肌肉组织的轴突生长。

8. 神经肌肉接头功能的同步光刺激与视频记录（第24天及以上）

  1. 成像时，使用配备科学互补金属氧化物半导体（sCMOS）相机的倒置荧光显微镜。
  2. 将相机软件的像素合并设置为2x2，曝光时间为20 ms，卷帘快门开启，读出速率为540 MHz，动态范围：12位&增益1，传感器模式：重叠模式。
  3. 使用显微镜上的2倍物镜对微组织进行成像。
  4. 将活细胞培养室（37 °C，5% CO2）安装到显微镜载物台上。
  5. 选择包含神经支配的骨骼组织的感兴趣区域（ROI），以减小文件大小和处理时间。
  6. 在样品与成像物镜之间放置一个594 nm长通发射滤光片，以滤除来自相机的蓝光脉冲。
  7. 将含有4个生物反应器（共24个组织）的矩形4孔板放入活细胞培养室中。
  8. 点击 实时预览。调整图像位置并聚焦至目标感兴趣区域。
  9. 从GitHub文件夹（https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis）上传自定义宏代码，以控制载物台位置、Arduino控制板和视频采集。
  10. 设置输出视频文件名为：日期_组织组_组织名称_实验名称.nd2。
  11. 运行宏代码，设定载物台上的目标X、Y坐标，并以每秒50帧的速度采集包含1700帧的快速时间序列图像。
  12. 成像后更换培养基，并将样品放回培养箱。两次成像之间至少间隔24小时，以避免组织疲劳。

9. 批量处理与分析（第24天及以后）

  1. 视频处理
    1. 使用自定义的 MATLAB 代码对视频进行批量分析。文件可从 GitHub 文件夹下载（https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis）。函数列表及说明见 表2。
      注意：该代码兼容 .nd2 和 .czi 格式。需在 MATLAB 中启用并行处理，并安装 bioformats 软件包。
    2. 运行 recursiveOSAnalysis 脚本，通过并行处理分析视频。将所有采集的视频文件放在同一文件夹中，并在运行代码时选择该文件夹。
    3. 根据需要调整分析后参数。
      1. 如果在记录开始时检测到自发性收缩，应更改 baselineTime （选项 1）。这会导致初始读数远高于 0，需调整帧以进行补偿。
      2. 如果收缩未被记录，应更改 peakThreshold （选项 2）。默认情况下，代码会检测高于最高峰值 25% 的收缩，因此可调整该值。
      3. 更改 minMinProminence 和 minMinWidth 以调节检测每个峰起始点时的灵敏度。
    4. 生成视频和图形输出。
      1. 运行 recursiveOSMovie 为每份组织生成对应的视频文件及其收缩力轨迹图。

10. 神经肌肉接头功能的扰动（第24天及以上）

  1. 通过向补充有 20 ng/mL BDNF 和 10 ng/mL GDNF 的 NbActiv4 基础培养基中添加外源效应物，制备处理用培养基。
    1. 对于重症肌无力（MG）血清实验，使用含 20% MG 患者血清的 NbActiv4 + BDNF + GDNF 培养基。
    2. 对于 BTX 实验，使用含 5 μg/mL BTX 的 NbActiv4 + BDNF + GDNF 培养基。
  2. 使用步骤 3.2 进行刺激/成像，记录基线数据。
  3. 将组织中的培养基更换为处理用培养基（每组织 450 μL）。
  4. 孵育所需时间（患者血清处理为 48 h，BTX 处理为 20 min）。
  5. 再次使用步骤 3.2 进行刺激/成像，记录处理后的功能状态。
  6. 移除处理用培养基，并让组织休息所需时间（血清移除后 48 h）
    注意：刺激与成像之间应至少间隔 24 h，以避免组织疲劳

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结果

通过共培养光遗传学人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的运动神经元与非光遗传学骨骼肌组织，生成了神经肌肉接头。将人原代骨骼肌成肌细胞（SkM）接种至培养平台中，并采用为期2周的方案分化为多核肌管。光遗传学运动神经元在肌管分化的同时单独进行分化，随后接种至平台中（图1）。在运动神经元接种后7–12天，组织开始在蓝光刺激下发生收缩，表明神经肌肉接头已成功形成并趋于成熟。神经肌肉接头在运动神经元接种后可培养、刺激和成像长达40天，但最佳观测时间点为第16天19。分化过程的形态学与生化验证以及光遗传学蛋白的表达情况见于补充图1，并在先前的研究中得到验证18,19。

为了证明该方案可轻松适配于不同的培养系统，本研究采用两种不同的区室化反应器进行了验证：一种微流控装置和一种开放式培养孔生物反应器。这两种系统具有相似的设计，其中一个腔室设有用...

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讨论

该系统是一种经过工程化设计的三维人体组织模型，结合了光遗传学与视频处理技术，可实现对神经肌肉接头（NMJ）功能的自动化且无偏倚的评估。通过采用标准化的实验方案，我们已证明该系统能够测量生理发育过程中NMJ功能的变化，并表征诸如神经毒素暴露以及重症肌无力患者血清等病理条件对NMJ造成的损害效应。

既往研究报道，可通过将重症肌无力（MG）患者血清与光遗传学人多能干细胞（hPSC）来源的运动神经元和骨骼肌肌管共培养，建立MG的体外模型22。然而，该系统为二维培养，且在随机位置记录肌肉收缩，从而限制了实验的可重复性，并降低了模型的定量分析能力。与二维系统相比，本系统最大的优势在于能够模拟三维环境，更真实地促进运动神经元（MNs）与骨骼肌细胞（SkMs）之间的细胞相互作用和形态发育。大量证据表明，三维系统在模拟组织表现出类似其天然生理状态所需的生物力学信号方面具有显著优势13,14,

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们衷心感谢美国国立卫生研究院（NIH）[资助编号 EB025765 和 EB027062]、美国国防部（DOD）[奖项编号 W81XWH-18-1-0095] 以及加州大学旧金山分校健康创新工程中心（HIVE 奖学金）提供的资金支持。我们衷心感谢哥伦比亚大学干细胞中心在细胞重编程方面提供的帮助与指导。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>细胞
SkMDCCook MyositeP01059-14M
<强>培养基与添加剂
高级DMEM/F12赛默飞世尔科技12634-020
牛血清白蛋白溶液Millipore SigmaA9576-50ML
G-5 补充剂（100 倍浓缩）赛默飞世尔科技17503-012
遗传霉素选择性抗生素（G418硫酸盐）（50 mg/mL）赛默飞世尔科技10131-035
胰岛素，重组人源默克生命科学91077C-100MG
基质胶康宁354277
mTeSR Plus干细胞技术100-0276
MyoTonic 生长培养基试剂盒Cook MyositeMK-4444
N-2 补充剂赛默飞世尔科技17502-048
NbActiv4 500 mLBrainBits LLCNb4-500
Neurobasal 培养基赛默飞世尔科技21103-049
Neurobasal-A 培养基赛默飞世尔科技A13710-01
Pluronic F-127Sigma AldrichP2443
ReLeSR干细胞技术5872
<强>塑料器皿
30 mm 笼式立方体系统ThorLabsCM1-DCH, CP33, ER1-P4 和 ER2-P4
37 µm 可逆过滤器，大型干细胞技术27250
546 nm短通激发滤光片SemrockFF01-546/SP-25
573 nm 二向色镜SemrockFF573-Di01–25x36
594 nm 长通发射滤光片SemrockBLP01-594R-25
594 nm 长通激发滤光片SemrockBLP01-594R-25
蓝色（470 nm）Rebel LED，安装于 SinkPAD-II 10 mm 方形基座 - 700 mA 时 65 流明LuxeonStarLEDsSP-05-B4
Carclo 29.8° 带集成支腿的霜面10毫米圆形光束光学件LuxeonStarLEDs10413
Corning 60 mm 超低吸附培养皿康宁3261
散热器LuxeonStarLEDsLPD-19-10B
<强>光学
pluriStrainer 400 µm，25 个装，无菌PluriSelect43-50400-03
pluriStrainer 500 µm，25 个装，无菌PluriSelect43-50500-03
红光（627 nm）Rebel LED，安装于 SinkPAD-II 10 mm 方形基座 - 700 mA 下光通量为 65 流明LuxeonStarLEDsSP-05-R5
环形驱动虹膜光圈ThorLabsSM1D12D
T-Cube LED 驱动器ThorLabsLEDD1B, KPS101
<强>霉菌
带内螺纹六角间隔柱，  3 1/2" 10-32，半螺纹 1/2"麦克马斯特91920A046
低剖面 C型夹麦克马斯特1705A12
<强>生长因子
腺苷3′,5′-环一磷酸Millipore SigmaA9501-1G
CHIR 99021，10 mgTocris4423/10
DAPT 10 mgR&D Systems2634/10
人源CNTF，研究级，5 µgMiltenyl Biotec130-096-336
人玻璃连接蛋白蛋白，CFR&D Systems2349-VN-100
人玻璃连接蛋白蛋白，CFR&D Systems2349-VN-100
IGF1 重组人蛋白赛默飞世尔科技PHG0078
小鼠层粘连蛋白，天然赛默飞世尔科技23017015
重组人Agrin蛋白R&D Systems6624-AG-050
重组人GDNF蛋白，CF 50μgR&D Systems212-GD-050/CF
重组人神经营养因子3 100 μg细胞科学CRN500D
重组人神经营养素-4细胞科学CRN501B
重组人音猬因子/Shh（C24II）N端R&D Systems1845-SH-100
重组人/小鼠/大鼠 BDNF 50 μgPeprotech450-02
视黄酸，50 mgMillipore SigmaR2625-50
SAG 激活剂Millipore Sigma566660
SB431542 10 mg干细胞技术72234
StemMACS LDN-193189Miltenyi Biotec130-103-925
人血浆来源的玻璃粘连蛋白Millipore SigmaV8379-50UG
Y-27632 二盐酸盐Tocris1254
<强>抗体
α-肌动蛋白结合蛋白单克隆抗体（小鼠 IgG1）Abcamab9465
胆碱乙酰转移酶 (ChAT) (山羊)MilliporeAB144P
结蛋白单克隆抗体（小鼠 IgG1）DakoM076029-2
肌球蛋白重链（MHC）（小鼠 IgG2b）DSHBMF20
<强>仪器设备
Arduino Uno R3ArduinoA000066
自动载物台应用科学仪器MS-2000 XYZ
扩展型等离子清洗机Harrick PlasmaPDC-001 (115V)
Invitrogen Countess 自动细胞计数仪Marshal ScientificI-CACC
IX-81 倒置荧光显微镜OlympusIX-ILL100LH
系列阶段顶部培养箱系统Tokai Hit STXTOKAI-HIT-STXG
Zyla 4.2 sCOMS 相机Andor TechnologyZYLA-4.2P-CL10
<强>软件
Arduino 软件（IDE）ArduinoIDE 1.8.19
MastercamMastercamSolidworks 的 Mastercam
MatlabMatlabR2021b
NIS元素尼康基础研究
Solidworks 3D CADSolidworksSolidworks 标准版

参考文献

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