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方法文章

一种通过钠-牛磺胆酸共转运多肽研究乙型肝炎病毒进入的高效肝细胞模型作为治疗靶点

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DOI：

10.3791/63761

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2022年5月10日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Mahidol University, 2Program in Translational Medicine, Faculty of Medicine Ramathibodi Hospital, Mahidol University, 3Excellent Center for Drug Discovery, Faculty of Science, Mahidol University, 4Department of Biotechnology, Faculty of Science, Mahidol University, 5Department of Pharmacology, Faculty of Medicine Siriraj Hospital, Mahidol University

本文内容

摘要

我们介绍了一种利用等温滴定量热法检测靶向乙肝病毒（HBV）进入宿主细胞前后生命周期阶段的抗病毒化合物的方案，该方法通过测定化合物与宿主钠-牛磺胆酸共转运多肽结合亲和力（KD）来评估其作用。抗病毒效果则通过检测病毒生命周期标志物（共价闭合环状DNA形成、转录及病毒组装）的抑制情况来确定。

摘要

乙型肝炎病毒（HBV）感染被认为是肝细胞癌的重要风险因素。目前的治疗手段仅能降低病毒载量，但无法实现完全缓解。一个高效的肝细胞感染模型可真实再现病毒生命周期，对于治疗药物的筛选至关重要。现有的大多数抗HBV药物靶向的是病毒进入细胞后的生命周期阶段，而非病毒进入前的阶段。本实验方案详细描述了一种功能完备的肝细胞模型的建立方法，可用于筛选靶向病毒进入前及进入后各生命周期阶段的治疗药物。该模型基于imHC或HepaRG细胞作为宿主细胞，涵盖对钠牛磺胆酸共转运多肽（NTCP）结合、共价闭合环状DNA（cccDNA）形成、转录以及病毒组装等环节的靶向研究。在此，HBV进入抑制实验采用姜黄素通过NTCP抑制HBV的结合与转运功能。利用等温滴定 calorimetry（ITC）——一种基于热力学参数的HBV药物筛选通用工具，评估了抑制剂与NTCP的结合亲和力（KD）。

引言

乙型肝炎病毒（HBV）感染在全球范围内被认为是一种威胁生命的疾病。慢性HBV感染具有发展为肝硬化和肝细胞癌的风险1。目前的抗HBV治疗主要集中在病毒进入后的阶段，使用核苷（酸）类似物（NAs）和干扰素-α（IFN-α）2,3。HBV进入抑制剂Myrcludex B的发现，为抗HBV药物提供了新的作用靶点4。在慢性HBV感染中，进入抑制剂与NAs联合使用相比仅靶向病毒复制的治疗方案，显著降低了病毒载量5,6。然而，传统的用于筛选HBV进入抑制剂的肝细胞模型受限于病毒受体水平较低（即钠-牛磺胆酸共转运多肽，NTCP）。在肝癌细胞（如HepG2和Huh7）中过表达hNTCP可提高HBV感染性7,8。然而，这些细胞系表达的I相和II相药物代谢酶水平较低，并表现出遗传不稳定性9。能够靶向候选抗HBV化合物不同作用机制（如病毒进入前、NTCP结合及病毒进入阶段）的肝细胞模型，将有助于加快高效联合治疗方案的识别与开发。对姜黄素抗HBV活性的研究揭示了其除了干扰病毒进入后阶段外，还可通过抑制病毒进入发挥新的作用机制。本实验方案详细描述了一种用于筛选抗HBV进入分子的宿主模型10。

本方法旨在筛选可抑制乙型肝炎病毒（HBV）进入细胞的候选化合物，特别是阻断NTCP的结合与转运功能。由于NTCP的表达是HBV进入和感染的关键因素，我们优化了肝细胞成熟方案以最大程度提升NTCP的表达水平11。此外，该方案还可区分候选化合物对HBV进入过程的抑制机制，即抑制HBV附着于细胞表面与抑制病毒内化之间的差异。牛磺胆酸（TCA）摄取实验也进行了改进，采用基于ELISA的方法替代放射性同位素标记法来评估NTCP的转运活性12,13。受体与配体之间的相互作用通过其三维结构得以验证14,15。通过检测TCA的摄取活性，可评估NTCP功能是否受到抑制16。然而，该技术无法提供候选抑制剂与NTCP直接结合的直接证据。因此，可采用多种技术手段研究其结合情况，例如表面等离子共振17、ELISA、基于荧光的热迁移实验（FTSA）18、FRET19、AlphaScreen及其他多种方法20。在这些技术中，等温滴定量热法（ITC）是结合分析的金标准，因其几乎可在所有反应中检测到热量的吸收或释放21。NTCP与候选化合物之间的结合亲和力（KD）可通过ITC直接测定，所得亲和力数值比使用in silico预测模型获得的结果更为精确22。

本方案涵盖了肝细胞成熟、乙型肝炎病毒（HBV）感染以及HBV进入抑制剂筛选的相关技术。简而言之，基于imHC和HepaRG细胞系建立了一种肝细胞模型。培养的细胞在两周内分化为成熟肝细胞。通过实时PCR、蛋白质印迹（western blot）和流式细胞术检测NTCP水平的上调11。乙型肝炎病毒颗粒（HBVcc）由HepG2.2.15细胞系产生并收集。在接种HBV病毒颗粒前2小时，对已分化的imHC或HepaRG细胞（d-imHC、d-HepaRG）进行预防性处理，加入候选抗HBV化合物。本实验的预期结果是鉴定出能够降低细胞内HBV水平及其感染性的化合物。通过TCA摄取实验评估抗NTCP活性。能够特异性结合NTCP的化合物可抑制NTCP的活性。采用等温滴定量热法（ITC）技术研究分子间相互作用结合的可行性，以预测抑制剂及其靶标蛋白，并通过生物分子复合物的非共价相互作用测定配体与受体之间的结合亲和力（KD）23,24。例如，KD ≥ 1 × 103 mM 表示弱结合，KD ≥ 1 × 106 µM 表示中等强度结合，而KD ≤ 1 × 109 nM 表示强结合。ΔG值与结合相互作用直接相关。特别地，ΔG为负值的反应属于放能反应，表明结合过程是自发进行的。ΔH为负值的反应表明结合过程依赖于氢键和范德华力。TCA摄取实验和ITC数据均可用于筛选抗HBV进入的候选化合物。这些方案的结果不仅可为抗HBV进入抑制剂的筛选提供基础，还可用于评估化合物与NTCP之间的结合亲和力及转运功能。本文详细描述了宿主细胞的制备与表征、实验设计，以及抗HBV进入活性与NTCP结合亲和力的评估方法。

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方案

注意：以下操作必须在II级生物安全柜或层流柜中进行。乙型肝炎病毒（HBV）的操作已获得伦理审查委员会（IRB，编号MURA2020/1545）的批准。有关本实验方案中使用的所有溶液、试剂、设备和细胞系的详细信息，请参见材料表。

1. 准备宿主细胞（成熟肝细胞）

  1. 将肝细胞（3.75 × 105 个 HepaRG 或 imHC 细胞）接种并维持在含有 10 mL DMEM/F12 培养基的 75 cm2 培养瓶中，培养基中添加 10% 胎牛血清（FBS）、1% L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素。等待细胞生长至 80%–90% 汇合度（1 周内）。
  2. 弃去培养瓶中的旧培养基，用 4 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。
  3. 吸除 PBS，加入 4 mL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液。
  4. 将培养瓶置于 37 °C 培养箱中孵育 2–3 分钟，使用倒置显微镜和 10 倍物镜观察贴壁细胞，确保单层细胞已从培养表面脱落。
  5. 向培养瓶中加入 4 mL 含 10% FBS 的培养基以终止胰蛋白酶作用，并轻轻重悬收集的细胞。将细胞悬液转移至 15 mL 圆底离心管中，在 300 × g、25 °C 条件下离心 3 分钟。
  6. 吸除上清液，用 1–2 mL 预热的含 10% FBS 和抗生素的培养基重悬细胞沉淀。
  7. 取 10 µL 细胞悬液与 10 µL 台盼蓝混合，使用血细胞计数板进行细胞计数。确保细胞活力高于 90% 后再进行下一步操作。
  8. 每孔加入 1 × 106 个细胞（溶于 2 mL 培养基）接种于 6 孔板中，使用 DME/F12 完全培养基培养，直至细胞达到 100% 汇合度。
  9. 为诱导肝细胞成熟，配制肝细胞成熟培养基（Williams' E 培养基，添加 10% FBS、100 U/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素、5 µg/mL 胰岛素、50 µM 氢化可的松、2 mM L-谷氨酰胺和 2% DMSO）。
  10. 每周更换培养基两次。
  11. 将肝细胞在成熟培养基中维持培养 2 周，以获得可用于 HBV 感染的成熟肝细胞。

2. 细胞NTCP的定量分析

  1. 使用实时 PCR 检测 NTCP 表达水平
    1. 通过胰蛋白酶消化收集成熟肝细胞的沉淀（参见步骤 1.2–1.5）。
    2. 使用含DNase I处理的RNA提取试剂盒从细胞沉淀中提取总RNA。
    3. 使用寡聚-dT引物和逆转录系统，按照制造商说明书，从200 ng总RNA中合成cDNA。
    4. 将cDNA稀释至50 ng/µL，作为PCR反应的模板。取2 µL稀释后的cDNA与含SYBR Green qRT-PCR试剂盒溶液（5 µM）的PCR预混液混合 NTCP特异性引物（5'-GGACATGAACCTCAGCATTGTG-3' 和 5'-ATCATAGATCCCCCTGGAGTAGAT-3'）。
    5. 用于归一化 GAPDH 作为内参基因，使用特异性引物（5'-GAAATCCCATCACCATCTTCC-3' 和 5'-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3'）。
    6. 使用热循环仪在以下温度条件下扩增cDNA样品：95 °C预变性3 min（1个循环）；95 °C变性30 s，60 °C至65 °C退火30 s，72 °C延伸30 s（40个循环）；72 °C最终延伸5 min（1个循环）。
    7. 计算 NTC成熟肝细胞相对于未分化细胞的P倍变化使用 GAPDH 作为基于2的校准基因-ΔΔCT 方法
  2. 使用蛋白质印迹分析法量化 NTCP
    1. 使用细胞刮刀收集肝细胞，并在300 x g条件下离心 g，25 °C 下离心 5 分钟以收集细胞沉淀。
    2. 按照RIPA裂解液生产商的说明，使用含有1×蛋白酶抑制剂的100 µL RIPA裂解液提取细胞蛋白。
    3. 使用二辛可宁酸（BCA）法测定总蛋白浓度。
    4. 将12.5 µL蛋白质与2倍上样缓冲液按体积比1:1混合。
    5. 将蛋白质混合物和标准蛋白ladder在95 °C下煮沸5分钟。
    6. 向电泳槽中加入1×运行缓冲液。
    7. 在10%（w/v）聚丙烯酰胺凝胶中上样5 µL蛋白标准品ladder或20 µL煮沸后的蛋白混合物。
    8. 进行凝胶电泳：室温下先以50 V电泳30分钟，随后以90 V电泳1小时。
    9. 将PVDF膜浸入甲醇中30秒，用双蒸水洗涤1-2分钟，然后与两张滤纸一同浸泡于转移缓冲液中，10分钟或直至使用。
    10. 将滤纸置于半干转印槽的阳极板上，然后依次将PVDF膜、凝胶和滤纸放置其上。
    11. 在室温下以10 V电压将蛋白质从凝胶转移至PVDF膜上，持续25分钟。
    12. 室温下用WB封闭液封闭膜1小时。
    13. 在4 °C下用抗牛磺胆酸钠共转运多肽抗体（anti-NTCP，1:100稀释）孵育膜过夜。
    14. 用 TBST 洗涤膜 3 次，每次 10 分钟。
    15. 室温下用辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔抗体（1:10,000 稀释）孵育膜 1 小时。
    16. 用TBST洗涤膜3次，每次10分钟，然后用TBS洗涤1次，每次5分钟。
    17. 使用 HRP 底物检测 NTCP（参见 材料表).
    18. 每平方厘米加入至少 0.1 mL HRP 底物溶液2 膜的避光孵育3-5分钟。
    19. 使用凝胶成像系统在化学发光模式下观察 NTCP 标记物 膜的选择，调节 曝光时间 与 累积模式 每个 1 分钟，并以不同曝光时间拍摄5分钟的照片。
    20. 使用小鼠抗GAPDH抗体（1:200,000稀释）和HRP标记的山羊抗小鼠二抗（1:10,000稀释）对膜进行 stripping 和探针杂交。
  3. 使用流式细胞术检测NTCP水平
    1. 通过将成熟肝细胞与8 mM EDTA孵育15分钟，收集细胞沉淀。
      注意：避免使用胰蛋白酶或其他可能破坏细胞表面受体的蛋白酶。由于NTCP是一种细胞表面受体蛋白，胰蛋白酶消化造成的损伤可能导致阴性结果。
    2. 用 300 µL 含 3.7% 多聚甲醛的 1× PBS 固定肝细胞 15 分钟。将细胞悬液转移至 1.5 mL 微量离心管中，在 300 × g 条件下离心 10 分钟。 g，25 °C。
    3. 用 700 µL 含 1% FBS (v/v) 的 1x PBS 洗涤细胞 2 次，300 × g 离心 10 分钟 g，25 °C下，向细胞沉淀中加入300 µL含0.05% Triton X-100的PBS，室温孵育20 min以透化细胞。
    4. 300 × g 离心 10 分钟 g，25 °C，用含1% FBS（v/v）的PBS 700 µL洗涤细胞沉淀，每次1分钟，共洗3次。加入针对NTCP的一抗（1:100稀释），4 °C孵育30分钟。用Perm/Wash缓冲液洗涤细胞3次，每次1分钟，随后在300 × g下离心10分钟 g，25 °C。
    5. 用与 Alexa Fluor 488 偶联的二抗在 4 °C 下染色细胞 30 分钟。用 Perm/Wash 缓冲液洗涤细胞 3 次，每次 1 分钟，随后在 300 × g 下离心 10 分钟 g，25 °C。用200 µL含1% FBS（v/v）的PBS重悬细胞沉淀。
    6. 打开流式细胞仪，预热激光器15分钟，并执行常规清洗。
    7. 选择测量参数，包括前向散射（FSC），侧向散射（SSC）和异硫氰酸荧光素（FITC）或藻红蛋白（PE），并设置 自动补偿调节 由软件完成。包括补偿对照样本：未染色对照、FITC染色对照和PE染色对照。
      注意： FSC 和 SSC 参数用于确定单个细胞的大小和颗粒度，以选择用于设门分析的细胞群体。荧光通道检测器具有 FITC 和 PE 通道。在此方案中，选择 FITC 用于检测 Alexa Fluor 488 的通道。
    8. 以中等流速（60 µL/min）运行未染色样本，调整FSC和SSC的阈值，使其覆盖目标细胞群，标记该区域的设门范围，并将此设门应用于所有补偿对照。
    9. 使用未染色对照设置荧光光电倍增管（PMT），并在阴性象限中调节FITC或PE的PMT电压。运行阳性染色样本，并在阳性象限范围内调节FITC或PE的显示尺度。运行未染色、FITC染色或PE染色对照，计算补偿值，并将其应用于样本设置。运行肝细胞样本以检测NTCP水平。
    10. 使用流式细胞仪软件分析染色的肝细胞（参见 材料表).
      1. 下 BD FACSuite 窗口，点击 对照管 在 数据来源 按 Tab 键并等待原始数据出现。
      2. 在 工作表 右侧的标签，点击 椭圆门控 按钮，选择 SSC 中的细胞群体 以及 FSC 点图 使用鼠标光标，并等待圆圈 P1 出现。
      3. 点击 时间间隔门 按钮，并在FITC直方图中从最右侧的最高荧光强度值开始标记区域，观察出现的P2线。
      4. 点击 实验管 并观察数据中的 工作表 选项卡更改。单击 统计学 单击按钮，然后单击工作表中的空白区域。观察出现的NTCP群体的统计值。

3. 细胞培养来源的乙型肝炎病毒颗粒（HBVcc）的制备

  1. 在10 cm培养皿中，使用完全培养基（DMEM添加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素）培养HepG2.2.15细胞24小时。
  2. 当HepG2.2.15细胞融合度达到60%–70%时，更换为含380 µg/mL遗传霉素（G418）的完全培养基。每2天收集一次条件培养基；将含有HBV的培养基储存于4 °C。
  3. 通过在4 °C下以5,000 × g离心20分钟去除细胞碎片。使用20 mL注射器收集条件培养基，并通过0.45 µm低蛋白结合滤膜过滤，以进一步去除细胞碎片。
  4. 为浓缩HBV，取1体积浓缩剂与3体积步骤3.3中获得的滤过上清液，在锥形离心管中混合，轻轻倒置管子使溶液充分混匀。将混合液置于4 °C环境中1小时。在4 °C下以1,500 × g离心1小时，确保可见淡白色沉淀。
    注意：每30 mL步骤3.3中的滤过上清液，加入10 mL浓缩剂，使总体积达到40 mL。
  5. 采用绝对定量实时PCR方法，以HBV 1.3-mer WT复制子作为标准曲线（范围为1 × 102至1 × 1010），测定HBV滴度（基因组当量），具体操作如前所述11。
  6. 用胎牛血清轻柔重悬沉淀，并分装成单次使用量，于−80 °C保存，可保存长达1年。

4. 抗HBV进入实验

  1. 在6孔板中，将imHC或HepaRG细胞维持在成熟培养基（含2% DMSO的Williams' E培养基，10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 µg/mL链霉素，5 µg/mL胰岛素，50 µM氢化可的松和2 mM L-谷氨酰胺）中，培养2周，每周换液2次，保持细胞100%汇合。
  2. 吸除培养基，加入用Williams' E培养基稀释的姜黄素（10–30 µM）或4 µM环孢素A（CsA），孵育2小时。吸除候选HBV进入抑制剂，更换为1 mL含4%聚乙二醇的Williams' E培养基。
  3. 将HBV病毒颗粒以每孔感染复数（MOI）为100的浓度加入培养基中，于37 °C孵育18小时。弃去上清液，加入2 mL冷PBS，轻轻摇晃以洗去未结合的HBV及旧培养基。
  4. 加入2 mL完全Williams' E培养基，继续培养7天。吸除培养基，用1×PBS洗涤细胞，随后用PBS中含3.7%多聚甲醛的溶液在室温下固定15分钟。使用免疫荧光封闭液（含0.2% Triton X-100和3%牛血清白蛋白的PBS溶液）对感染细胞进行通透和封闭处理，在室温下孵育60分钟。
  5. 将一抗（抗HBV核心抗原抗体）按1:200比例溶于封闭液中，加入后于4 °C孵育过夜。用洗涤液（含0.5% Tween 20的PBS）洗涤细胞3次，每次1分钟。
  6. 将二抗按1:500比例加入免疫荧光封闭液中，室温孵育1小时，再用洗涤液洗涤细胞3次，每次1分钟。
  7. 使用含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的抗荧光淬灭封片剂封片，并加盖盖玻片。采用配备DAPI滤光片（激发波长352–402 nM，发射波长417–477）和PE滤光片（激发波长542–582，发射波长604–644）以及20倍物镜的荧光显微镜检测荧光信号，评估候选化合物的抗HBV进入活性。

5. HBV-细胞结合实验

  1. 在6孔板中，将imHC或HepaRG细胞维持在成熟培养基（含2% DMSO的Williams' E培养基，10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 µg/mL链霉素，5 µg/mL胰岛素，50 µM氢化可的松，以及2 mM L-谷氨酰胺）中，培养2周，每周换液两次，保持细胞100%汇合。
  2. 吸除培养基，然后加入用Williams' E培养基稀释的姜黄素（10–30 µM）或环孢素A（4 µM），作用2小时。吸除HBV进入抑制剂，替换为1 mL含4%聚乙二醇的Williams' E培养基。
  3. 在每孔培养体系中加入HBV颗粒，感染复数（MOI）为100，于4 °C孵育2小时，使HBV与肝细胞结合。弃去未结合的HBV培养基，加入2 mL冷PBS，轻轻摇动以去除残留培养基。
  4. 使用细胞刮收集感染细胞，并用裂解缓冲液裂解细胞。将裂解液转移至收集管中，提取总DNA，采用针对HBV的特异性引物（上游引物：5´- GTT GCC CGT TTG TCC TCT AATTC-3´，下游引物：5´- GGA GGG ATA CAT AGA GGT TCC TTG A-3´）进行实时PCR检测HBV DNA，以内源对照基因PRNP（上游引物：5´- GACCAATTTATGCCTACAGC-3´，下游引物：5´- TTTATGCCTACAGCCTCCTA-3´）作为对照。
  5. 使用Step 2.1中所述的温度条件，在热循环仪中扩增PCR产物。
  6. 以PRNP为校准基因，采用2-ΔΔCT法计算处理组与对照组中每1 × 106个细胞的相对HBV DNA水平。

6. 牛磺胆酸（TCA）摄取实验

  1. 将imHC和HepaRG细胞在成熟培养基中维持至100%汇合状态，持续培养14天。
  2. 吸除培养基，用1× PBS洗涤肝细胞。加入用William's E培养基稀释的姜黄素或环孢素A（10–50 µM），孵育2小时。随后更换为牛磺胆酸钠溶液（0.5 M牛磺胆酸钠水合物溶于1× HEPES缓冲液），室温孵育15分钟。
  3. 吸除牛磺胆酸钠溶液，用预冷的1× HEPES缓冲液洗涤3次。加入300–500 µL预冷的1× HEPES缓冲液，于冰上用细胞刮棒收集细胞。
  4. 在冰上以20 kHz频率超声处理细胞20秒进行匀浆，随后冰上孵育5分钟。将裂解物在10,000 × g 离心20分钟，以沉淀细胞碎片。收集上清液，使用TCA ELISA检测试剂盒（见材料表）测定细胞内牛磺胆酸浓度。

7. 使用等温滴定 calorimetry 测定蛋白质-配体相互作用

注意：该检测系统基于 MicroCal PEAQ-ITC（ITC 软件）开发。

  1. 配制缓冲液（50 mM Tris-HCl 缓冲液，pH 7.0）。
  2. 在缓冲液中制备15 µM的NTCP。
  3. 在缓冲液中配制150 µM的候选HBV进入抑制剂溶液。
  4. 使用缓冲液清洗ITC仪器中的样品池、参比池和注射器（步骤7.1）。
    1. 双击 Windows 系统中的 ITC 软件图标以启动软件。在 运行实验亮点 标签，选择 microCal 19次注射方法.itcm，然后点击 开放当新窗口打开时，点击 清洁 标签页中，以及在 清洁方法 窗口，选择 洗涤 按钮用于 细胞清洗方法 以及 冲洗 按钮用于 注射器清洗方法. 点击 下一步 并按照屏幕上的说明进行操作。
      注意：洗涤步骤可能需要1.4小时才能完成。
  5. 将样品加入等温滴定量热仪（ITC）中；在 运行实验 标签，点击 加载 按钮，并阅读屏幕上的说明。点击 下一步 并按照视频说明操作，直至完成此上样步骤。
    1. 使用注射器将参比池注入溶液缓冲液。使用注射器将15 µM NTCP缓冲液注入样品池，并除去样品池上方多余的NTCP溶液。用注射器吸取150 µM姜黄素（配体）溶液，注意避免注射器中产生气泡。
  6. 运行样品，并在以下条件下 运行实验 标签，点击 运行 按钮。观察左侧窗口显示的实验信息和实验设置。输入配体和蛋白质浓度 150 µM（[Syr]），15 µM（[Cell]），以及 25 °C 在 温度.
  7. 在软件中，单击 开始 进行注射操作，并等待1.4小时，以完成蛋白质-配体相互作用。
    注意：褪色的 分析 软件窗口下方出现按钮。
  8. 观察到 分析 注射完成后按钮会变亮。点击该按钮 分析 单击控制软件中的按钮，使用分析软件分析原始数据。单击 概述 以显示原始数据并选择拟合模型 一个结合位点.
  9. 确保结合状态显示实验数据（结合、无结合、对照或检测数据），且实验值（KDΔG、ΔH、TΔS 和 N 在软件面板上显示。
  10. 导出可预测相互作用结合的热力学参数，包括氢键、范德华力和疏水相互作用，保存为 tif 或 jpeg 格式。
  11. 实验结束后，按照步骤 7.4 清洗样品池。

8. 统计分析

  1. 所有实验均需进行三次独立重复（n = 3）。
  2. 实验数据以均值 ± 标准差表示，并使用适当的统计分析软件进行统计分析。
  3. 采用双尾非配对 Student t 检验比较两个均值，或采用单因素方差分析（ANOVA）结合 Dunnett 法进行多个数值与对照值之间的多重比较。显著性水平设定为 p ≤ 0.05。

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结果

观察到肝脏成熟特征，包括双核细胞和多边形形态（图1），尤其是在imHC的分化阶段（图1A）。在d-HepaRG和d-imHC中，NTCP表达量分别增加了7倍和40倍（图1B）。与d-HepaRG相比，d-imHC中检测到更高水平的NTCP高度糖基化形式，该形式被认为可赋予HBV进入的易感性（图1C）。分化的imHC中NTCP水平比未分化细胞高65.9%（图1D）。

图2A展示了预防性治疗的概要。图2B显示了在感染后第7天进行的HBV免疫荧光染色，用于评估抗HBV进入活性，而图2C概述了HBV结合实验方案。通过实...

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讨论

乙型肝炎病毒（HBV）感染始于其与肝细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPGs）的低亲和力结合25，随后与NTCP结合，并通过内吞作用内化26由于NTCP是HBV进入的关键受体，靶向HBV进入在临床上可转化为减少HBV感染的策略 从头合成 感染、母婴传播（MTCT）以及肝移植后复发。阻断病毒进入将是慢性HBV感染的一种可行替代疗法。

以下总结了上述方案中的一些关键步骤。在准备宿主细胞时，需确保肝细胞在添加含2% DMSO的成熟培养基前达到100%汇合度。将未完全汇合的肝细胞培养于含2% DMSO的培养基中会导致细胞死亡和脱落。成熟培养时间可延长至4周以最大化NTCP的表达27,28，但建议采用2周的成熟培养期。

已有三种技术被提出用于定量细胞中NTCP的表达水平。建议使用者选择其最熟悉的技术；本文中我...

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披露

作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

致谢

本研究项目分别由玛希隆大学和泰国科学、研究与创新部（TSRI）资助，资助对象为 A. Wongkajornsilp 和 K. Sa-ngiamsuntorn。本工作还获得了泰国国家高等教育、科学、研究与创新政策办公室通过竞争力项目管理单位提供的资金支持（资助编号：C10F630093）。A. Wongkajornsilp 获得了玛希隆大学诗里拉吉医学院查勒姆帕基亚特基金的资助。作者谨此感谢玛希隆大学理学院优秀药物发现中心的 Sawinee Seemakhan 女士在等温滴定量热（ITC）技术方面提供的协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
细胞系
HepaRG 冻存细胞赛默飞世尔科技HPRGC10
Hep-G2/2.2.15 人肝母细胞瘤细胞系默克SCC249
试剂
4% 多聚甲醛磷酸盐缓冲液FUJIFILM 和光化学163-20145
BD Perm/Wash 缓冲液BD 生物科学554723Perm/Wash 缓冲液
环孢素 AAbcam59865-13-3
EDTA英杰15575-0388 mM
G418 硫酸双盐默克108321-42-2
Halt 蛋白酶抑制剂混合液 无 EDTA (100x)赛默飞科技78425
HEPES默克7365-45-9
illustraTM RNAspin Mini RNA 提取试剂盒通用电气医疗集团25-0500-71
illustra RNAspin Mini RNA 提取试剂盒通用电气医疗集团25-0500-71
ImProm-II 逆转录系统普洛麦格A3800
KAPA SYBR FAST qPCR 试剂盒Kapa 生物系统KK4600
Lenti-X 浓缩剂宝隆生物PT4421-2浓缩剂
Luminata crescendo Western HRP 底物默克WBLUR0100
通用 Master Mix (2x)Kapa 生物系统KK4600
Nucleospin DNA 提取试剂盒玛凯耐格尔1806/003
磷酸盐缓冲液默克P3813
聚乙二醇 8000默克25322-68-3
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂赛默飞科技P36930
重组 NTCPCloud-CloneRPE421Hu02
RIPA 裂解缓冲液 (10x)默克20-188
三氯乙酸 (TCA)西格玛345909-26-4
TCA ELISA 试剂盒MybiosourceMB2033685
吐温 X-100默克9036-19-5
胰蛋白酶-EDTA吉布科25200072稀释至 0.125%
抗体
    抗 NTCP1 抗体Abcamab1310841:100 稀释
    抗 GAPDH 抗体赛默飞世尔科技AM43001:200,000 稀释
   HRP 标记山羊抗兔 IgG 抗体Abcamab2057181:10,000 稀释
   HRP 标记山羊抗小鼠二抗Abcamab970231:10,000 稀释
   山羊抗兔 IgG 二抗，Alexa Fluor 488 标记英杰A-110081:500 稀释
试剂配制
一抗稀释缓冲液°
     1x TBST
     3% BSA西格玛A7906-100G工作浓度：3%
     叠氮化钠西格玛199931工作浓度：0.05%
肝细胞生长培养基
      DME/F12吉布科12400-024
      10% FBS西格玛奥德里奇F7524
      1% 青霉素-链霉素HyCloneSV30010
      1% GlutaMAX吉布科35050-061
肝细胞成熟培养基
      Williams’ E 培养基西格玛奥德里奇W4125-1L
      10% FBS西格玛奥德里奇F7524
      1% 青霉素-链霉素HyCloneSV30010
      1% GlutaMAX吉布科35050-061
      5 µg/mL  胰岛素西格玛奥德里奇91077C-100MG
      50 µM 氢化可的松西格玛奥德里奇H0888-1g
     2% DMSOPanReac AppliChemA3672-250ml
免疫荧光封闭液
     1x PBS吉布科21300-058
     3% BSA西格玛A7906-100G工作浓度：3%
     0.2% Triton X-100西格玛T8787工作浓度：0.2%
RIPA 裂解缓冲液溶液默克20-188终浓度：1X
     蛋白酶抑制剂混合液赛默飞科技78425终浓度：1X
       Na3VO4终浓度：1 mM
       PMSF终浓度：1 mM
       NaF终浓度：10 mM
Western blot 试剂
     10x Tris 缓冲盐水 (TBS)伯乐170-6435终浓度：1X
     Tween 20默克9005-64-5
     1x TBST0.1% Tween 20
     1x PBS吉布科21300-058
     Pierce BCA 蛋白检测试剂盒赛默飞世尔科技A53225
     聚丙烯酰胺凝胶伯乐161-0183
     过硫酸铵 (APS)伯乐161-0700终浓度：0.05%
    TEMED伯乐161-0800浓缩胶：0.1%，分离胶：0.05%
    2x Laemmli 上样缓冲液伯乐161-0737终浓度：1X
    Precision Plus Protein 双色标准品伯乐161-0374
WB 封闭液 / 二抗稀释缓冲液°
     1x TBST
     5% 脱脂奶粉（无脂干奶粉）伯乐170-6404工作浓度：5%
1x 电泳缓冲液 1 L
      10x Tris 缓冲盐水 (TBS)伯乐170-6435终浓度：1X
     甘氨酸西格玛G889814.4 g
     SDS默克7910工作浓度：0.1%
转膜缓冲液 500 mL
      10x Tris 缓冲盐水 (TBS)伯乐170-6435终浓度：1X
     甘氨酸西格玛G88987.2 g
     甲醇默克106009100 mL
温和洗脱液 1 L调节 pH 至 2.2
    甘氨酸西格玛G889815 g
     SDS默克79101 g
     Tween 20默克9005-64-510 mL
设备
15 mL 离心管康宁430052
50 mL 离心管康宁430291
Airstream II 级生物安全柜艺思高2010621生物安全柜
CelCulture CO2 培养箱艺思高2170002加湿组织培养箱
CFX96 Touch 实时荧光定量 PCR 检测仪伯乐1855196
FACSVerse 流式细胞仪BD 生物科学651154
刻度移液管 (10 mL)捷伯菲尔GSP010010
刻度移液管 (5 mL)捷伯菲尔GSP010005
MicroCal PEAQ-ITC马尔文等温滴定微量热仪
Mini PROTEAN Tetra 电泳槽伯乐1658004电泳室
Mini Trans-blot 转膜滤纸伯乐1703932
Omega Lum G 成像系统Aplegen8418-10-0005
移液控制器艾本德4430000.018Easypet 3
PowerPac HC 电源伯乐1645052电源
PVDF 膜默克IPVH00010
T-75 细胞培养瓶康宁431464U
Trans-Blot SD 半干转印系统伯乐1703940半干转印仪
超声波处理器 (Vibra-Cell VCX 130)Sonics & Materials
Versati 台式制冷离心机艺思高T1000R带摆动转子的离心机

参考文献

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NTCP 结合病毒进入抑制流式细胞术等温滴定微量热法牛磺胆酸摄取免疫荧光染色HepaRG 细胞聚合酶链式反应
一种通过钠-牛磺胆酸共转运多肽研究乙型肝炎病毒进入的高效肝细胞模型作为治疗靶点
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