我们介绍了一种利用等温滴定量热法检测靶向乙肝病毒（HBV）进入宿主细胞前后生命周期阶段的抗病毒化合物的方案，该方法通过测定化合物与宿主钠-牛磺胆酸共转运多肽结合亲和力（KD）来评估其作用。抗病毒效果则通过检测病毒生命周期标志物（共价闭合环状DNA形成、转录及病毒组装）的抑制情况来确定。
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摘要
摘要
乙型肝炎病毒（HBV）感染被认为是肝细胞癌的重要风险因素。目前的治疗手段仅能降低病毒载量，但无法实现完全缓解。一个高效的肝细胞感染模型可真实再现病毒生命周期，对于治疗药物的筛选至关重要。现有的大多数抗HBV药物靶向的是病毒进入细胞后的生命周期阶段，而非病毒进入前的阶段。本实验方案详细描述了一种功能完备的肝细胞模型的建立方法，可用于筛选靶向病毒进入前及进入后各生命周期阶段的治疗药物。该模型基于imHC或HepaRG细胞作为宿主细胞，涵盖对钠牛磺胆酸共转运多肽（NTCP）结合、共价闭合环状DNA（cccDNA）形成、转录以及病毒组装等环节的靶向研究。在此，HBV进入抑制实验采用姜黄素通过NTCP抑制HBV的结合与转运功能。利用等温滴定 calorimetry（ITC）——一种基于热力学参数的HBV药物筛选通用工具，评估了抑制剂与NTCP的结合亲和力（KD）。
引言
乙型肝炎病毒（HBV）感染在全球范围内被认为是一种威胁生命的疾病。慢性HBV感染具有发展为肝硬化和肝细胞癌的风险1。目前的抗HBV治疗主要集中在病毒进入后的阶段，使用核苷（酸）类似物（NAs）和干扰素-α（IFN-α）2,3。HBV进入抑制剂Myrcludex B的发现，为抗HBV药物提供了新的作用靶点4。在慢性HBV感染中，进入抑制剂与NAs联合使用相比仅靶向病毒复制的治疗方案，显著降低了病毒载量5,6。然而，传统的用于筛选HBV进入抑制剂的肝细胞模型受限于病毒受体水平较低（即钠-牛磺胆酸共转运多肽，NTCP）。在肝癌细胞（如HepG2和Huh7）中过表达hNTCP可提高HBV感染性7,8。然而，这些细胞系表达的I相和II相药物代谢酶水平较低，并表现出遗传不稳定性9。能够靶向候选抗HBV化合物不同作用机制（如病毒进入前、NTCP结合及病毒进入阶段）的肝细胞模型，将有助于加快高效联合治疗方案的识别与开发。对姜黄素抗HBV活性的研究揭示了其除了....
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方案
注意：以下操作必须在II级生物安全柜或层流柜中进行。乙型肝炎病毒（HBV）的操作已获得伦理审查委员会（IRB，编号MURA2020/1545）的批准。有关本实验方案中使用的所有溶液、试剂、设备和细胞系的详细信息，请参见材料表。
1. 准备宿主细胞（成熟肝细胞）
- 将肝细胞（3.75 × 105 个 HepaRG 或 imHC 细胞）接种并维持在含有 10 mL DMEM/F12 培养基的 75 cm2 培养瓶中，培养基中添加 10% 胎牛血清（FBS）、1% L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素。等待细胞生长至 80%–90% 汇合度（1 周内）。
- 弃去培养瓶中的旧培养基，用 4 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。
- 吸除 PBS，加入 4 mL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液。
- 将培养瓶置于 37 °C 培养箱中孵育 2–3 分钟，使用倒置显微镜和 10 倍物镜观察贴壁细胞，确保单层细胞已从培养表面脱落。
- 向培养瓶中加入 4 mL 含 10% FBS 的培养基以终止胰蛋白酶作用，并轻轻重悬收集的细胞。将细胞悬液转移至 15 mL 圆底离心管中，在 300 × g、25 °C 条件下离心 3 分钟。 ....
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结果
观察到肝脏成熟特征，包括双核细胞和多边形形态（图1），尤其是在imHC的分化阶段（图1A）。在d-HepaRG和d-imHC中，NTCP表达量分别增加了7倍和40倍（图1B）。与d-HepaRG相比，d-imHC中检测到更高水平的NTCP高度糖基化形式，该形式被认为可赋予HBV进入的易感性（图1C）。分化的imHC中NTCP水平比未分化细胞高65.9%（图1D）。
图2A展示了预防性治疗的概要。图2B显示了在感染后第7天进行的HBV免疫荧光染色，用于评估抗HBV进入活性，而图2C概述了HBV结合实验方案。通过实.......
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讨论
乙型肝炎病毒（HBV）感染始于其与肝细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPGs）的低亲和力结合25，随后与NTCP结合，并通过内吞作用内化26由于NTCP是HBV进入的关键受体，靶向HBV进入在临床上可转化为减少HBV感染的策略 从头合成 感染、母婴传播（MTCT）以及肝移植后复发。阻断病毒进入将是慢性HBV感染的一种可行替代疗法。
以下总结了上述方案中的一些关键步骤。在准备宿主细胞时，需确保肝细胞在添加含2% DMSO的成熟培养基前达到100%汇合度。将未完全汇合的肝细胞培养于含2% DMSO的培养基中会导致细胞死亡和脱落。成熟培养时间可延长至4周以最大化NTCP的表达27,28，但建议采用2周的成熟培养期。
已有三种技术被提出用于定量细胞中NTCP的表达水平。建议使用者选择其最熟悉的技术；本文中我.......
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披露
作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。
致谢
本研究项目分别由玛希隆大学和泰国科学、研究与创新部（TSRI）资助，资助对象为 A. Wongkajornsilp 和 K. Sa-ngiamsuntorn。本工作还获得了泰国国家高等教育、科学、研究与创新政策办公室通过竞争力项目管理单位提供的资金支持（资助编号：C10F630093）。A. Wongkajornsilp 获得了玛希隆大学诗里拉吉医学院查勒姆帕基亚特基金的资助。作者谨此感谢玛希隆大学理学院优秀药物发现中心的 Sawinee Seemakhan 女士在等温滴定量热（ITC）技术方面提供的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细胞系 | |||
| HepaRG 冻存细胞 | 赛默飞世尔科技 | HPRGC10 | |
| Hep-G2/2.2.15 人肝母细胞瘤细胞系 | 默克 | SCC249 | |
| 试剂 | |||
| 4% 多聚甲醛磷酸盐缓冲液 | FUJIFILM 和光化学 | 163-20145 | |
| BD Perm/Wash 缓冲液 | BD 生物科学 | 554723 | Perm/Wash 缓冲液 |
| 环孢素 A | Abcam | 59865-13-3 | |
| EDTA | 英杰 | 15575-038 | 8 mM |
| G418 硫酸双盐 | 默克 | 108321-42-2 | |
| Halt 蛋白酶抑制剂混合液 无 EDTA (100x) | 赛默飞科技 | 78425 | |
| HEPES | 默克 | 7365-45-9 | |
| illustraTM RNAspin Mini RNA 提取试剂盒 | 通用电气医疗集团 | 25-0500-71 | |
| illustra RNAspin Mini RNA 提取试剂盒 | 通用电气医疗集团 | 25-0500-71 | |
| ImProm-II 逆转录系统 | 普洛麦格 | A3800 | |
| KAPA SYBR FAST qPCR 试剂盒 | Kapa 生物系统 | KK4600 | |
| Lenti-X 浓缩剂 | 宝隆生物 | PT4421-2 | 浓缩剂 |
| Luminata crescendo Western HRP 底物 | 默克 | WBLUR0100 | |
| 通用 Master Mix (2x) | Kapa 生物系统 | KK4600 | |
| Nucleospin DNA 提取试剂盒 | 玛凯耐格尔 | 1806/003 | |
| 磷酸盐缓冲液 | 默克 | P3813 | |
| 聚乙二醇 8000 | 默克 | 25322-68-3 | |
| ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂 | 赛默飞科技 | P36930 | |
| 重组 NTCP | Cloud-Clone | RPE421Hu02 | |
| RIPA 裂解缓冲液 (10x) | 默克 | 20-188 | |
| 三氯乙酸 (TCA) | 西格玛 | 345909-26-4 | |
| TCA ELISA 试剂盒 | Mybiosource | MB2033685 | |
| 吐温 X-100 | 默克 | 9036-19-5 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | 吉布科 | 25200072 | 稀释至 0.125% |
| 抗体 | |||
| 抗 NTCP1 抗体 | Abcam | ab131084 | 1:100 稀释 |
| 抗 GAPDH 抗体 | 赛默飞世尔科技 | AM4300 | 1:200,000 稀释 |
| HRP 标记山羊抗兔 IgG 抗体 | Abcam | ab205718 | 1:10,000 稀释 |
| HRP 标记山羊抗小鼠二抗 | Abcam | ab97023 | 1:10,000 稀释 |
| 山羊抗兔 IgG 二抗，Alexa Fluor 488 标记 | 英杰 | A-11008 | 1:500 稀释 |
| 试剂配制 | |||
| 一抗稀释缓冲液° | |||
| 1x TBST | |||
| 3% BSA | 西格玛 | A7906-100G | 工作浓度：3% |
| 叠氮化钠 | 西格玛 | 199931 | 工作浓度：0.05% |
| 肝细胞生长培养基 | |||
| DME/F12 | 吉布科 | 12400-024 | |
| 10% FBS | 西格玛奥德里奇 | F7524 | |
| 1% 青霉素-链霉素 | HyClone | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | 吉布科 | 35050-061 | |
| 肝细胞成熟培养基 | |||
| Williams’ E 培养基 | 西格玛奥德里奇 | W4125-1L | |
| 10% FBS | 西格玛奥德里奇 | F7524 | |
| 1% 青霉素-链霉素 | HyClone | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | 吉布科 | 35050-061 | |
| 5 µg/mL 胰岛素 | 西格玛奥德里奇 | 91077C-100MG | |
| 50 µM 氢化可的松 | 西格玛奥德里奇 | H0888-1g | |
| 2% DMSO | PanReac AppliChem | A3672-250ml | |
| 免疫荧光封闭液 | |||
| 1x PBS | 吉布科 | 21300-058 | |
| 3% BSA | 西格玛 | A7906-100G | 工作浓度：3% |
| 0.2% Triton X-100 | 西格玛 | T8787 | 工作浓度：0.2% |
| RIPA 裂解缓冲液溶液 | 默克 | 20-188 | 终浓度：1X |
| 蛋白酶抑制剂混合液 | 赛默飞科技 | 78425 | 终浓度：1X |
| Na3VO4 | 终浓度：1 mM | ||
| PMSF | 终浓度：1 mM | ||
| NaF | 终浓度：10 mM | ||
| Western blot 试剂 | |||
| 10x Tris 缓冲盐水 (TBS) | 伯乐 | 170-6435 | 终浓度：1X |
| Tween 20 | 默克 | 9005-64-5 | |
| 1x TBST | 0.1% Tween 20 | ||
| 1x PBS | 吉布科 | 21300-058 | |
| Pierce BCA 蛋白检测试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | A53225 | |
| 聚丙烯酰胺凝胶 | 伯乐 | 161-0183 | |
| 过硫酸铵 (APS) | 伯乐 | 161-0700 | 终浓度：0.05% |
| TEMED | 伯乐 | 161-0800 | 浓缩胶：0.1%，分离胶：0.05% |
| 2x Laemmli 上样缓冲液 | 伯乐 | 161-0737 | 终浓度：1X |
| Precision Plus Protein 双色标准品 | 伯乐 | 161-0374 | |
| WB 封闭液 / 二抗稀释缓冲液° | |||
| 1x TBST | |||
| 5% 脱脂奶粉（无脂干奶粉） | 伯乐 | 170-6404 | 工作浓度：5% |
| 1x 电泳缓冲液 1 L | |||
| 10x Tris 缓冲盐水 (TBS) | 伯乐 | 170-6435 | 终浓度：1X |
| 甘氨酸 | 西格玛 | G8898 | 14.4 g |
| SDS | 默克 | 7910 | 工作浓度：0.1% |
| 转膜缓冲液 500 mL | |||
| 10x Tris 缓冲盐水 (TBS) | 伯乐 | 170-6435 | 终浓度：1X |
| 甘氨酸 | 西格玛 | G8898 | 7.2 g |
| 甲醇 | 默克 | 106009 | 100 mL |
| 温和洗脱液 1 L | 调节 pH 至 2.2 | ||
| 甘氨酸 | 西格玛 | G8898 | 15 g |
| SDS | 默克 | 7910 | 1 g |
| Tween 20 | 默克 | 9005-64-5 | 10 mL |
| 设备 | |||
| 15 mL 离心管 | 康宁 | 430052 | |
| 50 mL 离心管 | 康宁 | 430291 | |
| Airstream II 级生物安全柜 | 艺思高 | 2010621 | 生物安全柜 |
| CelCulture CO2 培养箱 | 艺思高 | 2170002 | 加湿组织培养箱 |
| CFX96 Touch 实时荧光定量 PCR 检测仪 | 伯乐 | 1855196 | |
| FACSVerse 流式细胞仪 | BD 生物科学 | 651154 | |
| 刻度移液管 (10 mL) | 捷伯菲尔 | GSP010010 | |
| 刻度移液管 (5 mL) | 捷伯菲尔 | GSP010005 | |
| MicroCal PEAQ-ITC | 马尔文 | 等温滴定微量热仪 | |
| Mini PROTEAN Tetra 电泳槽 | 伯乐 | 1658004 | 电泳室 |
| Mini Trans-blot 转膜滤纸 | 伯乐 | 1703932 | |
| Omega Lum G 成像系统 | Aplegen | 8418-10-0005 | |
| 移液控制器 | 艾本德 | 4430000.018 | Easypet 3 |
| PowerPac HC 电源 | 伯乐 | 1645052 | 电源 |
| PVDF 膜 | 默克 | IPVH00010 | |
| T-75 细胞培养瓶 | 康宁 | 431464U | |
| Trans-Blot SD 半干转印系统 | 伯乐 | 1703940 | 半干转印仪 |
| 超声波处理器 (Vibra-Cell VCX 130) | Sonics & Materials | ||
| Versati 台式制冷离心机 | 艺思高 | T1000R | 带摆动转子的离心机 |
参考文献
- Levrero, M., Zucman-Rossi, J. Mechanisms of HBV-induced hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 64 (1), 84-101 (2016).
- Kim, K. -H., Kim, N. D., Seong, B. -L. Discovery and development of anti-HBV agents and their resistance. Molecules. 15 (9), 5878-5908 (20....
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