用于治疗眼表疾病的富血小板血浆裂解物

摘要

血小板裂解物是治疗眼表疾病的一种新兴工具。本文提出一种从血小板捐献者采集的血小板裂解物的制备、分装、储存及表征方法。

摘要

多种眼表疾病采用血液来源的眼药水进行治疗。由于此类眼药水中含有促进眼表再生的代谢物和生长因子，其已在临床实践中得到应用。血液来源的眼药水可从不同来源（例如全血或血小板单采捐献）制备，并可通过不同方案（例如不同的稀释比例和冻融循环次数）进行生产。这种多样性阻碍了临床方案的标准化，从而影响对其临床疗效的评估。详细描述并共享方法学流程有助于制定通用指南。近年来，异体来源产品逐渐推广，作为自体治疗的替代方案，因其可提供更高的疗效标准；其中，富血小板血浆裂解物（PRP-L）眼药水的制备工艺较为简便。在意大利雷焦艾米利亚AUSL-IRCCS输血医学科，PRP-L来源于血小板单采捐献。该产品最初用0.9% NaCl将血小板浓度稀释至0.3 × 10⁹ 血小板/mL（起始平均浓度为1 × 10⁹ 血小板/mL）。稀释后的血小板经过冷冻-解冻处理，随后离心以去除碎片。最终产物分装为每份1.45 mL，于−80 °C保存。在发放给患者前，需对眼药水进行无菌检测。患者可将血小板裂解物在−15 °C保存最多1个月。此外，还对随机选取的分装样品进行生长因子成分分析，其平均值在本文中予以报告。

引言

血液来源的产品被广泛应用于伤口护理¹、颌面外科和骨科手术，以及多种眼表疾病²（如干眼症（DED）³）的治疗。在 DED 中，由于参与泪液生成和维持眼表完整性的多种因素功能异常，导致泪膜稳态受到破坏^4,5。

干眼症（DED）的病因和严重程度具有异质性^6,7,8，可能由多种因素引起，如衰老、性别⁹、佩戴隐形眼镜、局部或全身用药¹⁰，以及干燥综合征等原有疾病¹⁰。尽管症状较轻，干眼症仍影响全球数百万人，对其生活质量及医疗系统均造成影响⁶。

针对该病理已报道多种治疗方法，但目前对于最有效的治疗方案仍无共识¹²。迄今为止，人工泪液作为一线治疗手段，旨在恢复泪膜的水相成分，但这些替代品并不含有天然泪液中的主要生物活性溶质^6,11。基于血小板的产品被视为人工泪液的一种有效替代方案^12,13，然而其临床疗效、使用建议以及制备方法仍存在争议³。

血液制品与泪液在代谢物¹⁴、蛋白质、脂质、维生素、离子、生长因子（GFs）、抗氧化化合物¹¹以及渗透压（300 mOsm/L）¹¹方面的组成相似。通过其组分的协同作用，血液制品可促进角膜上皮再生，抑制炎性细胞因子的释放，并增加结膜中杯状细胞的数量及黏蛋白的表达^2,3。

迄今为止，文献中已记录了眼科血液来源产品的异质性；这些产品可根据血液供体的来源进行分类，即自体来源或同种异体来源，以及根据血液来源进行分类，即外周血、脐带血、血清或血小板。

尽管自体产品曾是最广泛使用的类型³，但同种异体产品现正逐渐成为首选，因其能提供更高的疗效和安全性标准¹⁵，同时显著降低使用成本^16,17。事实上，既往研究已证实，从患有自身免疫性和/或系统性疾病患者体内获取的血液制品，其质量和功能可能存在异常^6,16,17。尽管基于血清的眼药水目前应用最为广泛，但基于血小板的产品近年来正被确立为一种有效的替代方案，因其制备简便且能维持显著的治疗效果^3,11。目前可用的血小板来源产品主要包括富血小板血浆（PRP）、富血小板血浆裂解物（PRP-L）以及富含生长因子的血浆（PRGF）³。

其中，PRP-L 的优势在于其为一种可长期冷冻保存的产品。PRP-L 可通过单采法、白膜层制备，甚至可利用即将过期的血小板（PLTs）制备^18,19，从而有效减少资源浪费。分装后的 PRP-L 可在血站于 −80 °C 下保存数月，或在患者家中于 −15 °C 下短期保存。

PRP-L 富含生长因子（GFs），已被证实可促进眼表再生^12,20,21。然而，该领域报道的临床研究较少，且所有研究均采用自体来源^3,22。由于目前尚无标准化的制备、分装和储存指南，PRP-L 在常规用于治疗眼表疾病之前仍需进一步验证和表征³。

本文分享了意大利雷焦艾米利亚AUSL-IRCCS输血医学科制备用于治疗干眼症（DED）患者PRP-L的详细操作方案。我们旨在帮助科学界建立标准化的制备方法，以提高全球范围内相关研究和临床实践的一致性与可比性。

方案

用于生长因子定量评估的PRP-L是在一项更广泛的PRP产品表征研究中采集的，该研究旨在用于再生医学目的，由雷焦艾米利亚AUSL-IRCCS开展，并于2019年1月10日获得艾米利亚诺尔德广大地区伦理委员会批准（协议编号2019/0003319）。捐献者均根据《赫尔辛基宣言》签署了知情同意书。收集用于评估眼表疾病指数（OSDI）问卷的汇总性匿名数据无需伦理审批，该问卷为临床医生常规用于监测干眼综合征症状的工具。图1A展示了所遵循的实验流程示意图，而图1B中的图片则展示了该操作的主要步骤。

1. 富血小板血浆（PRP）的采集

1. PRP 单采
   1. 根据意大利法律选择本方案的血小板供者：供者年龄应在 18 至 65 岁之间，血压和血常规参数正常，血小板计数不低于 180 × 10⁹ 血小板/L²³。合格供者在献血前 1 周内不得服用抗血小板药物或抗凝药物。
   2. 使用自动化血液采集系统，按照制造商说明和国家法规²³ 进行血浆-血小板单采，以获得 1 个单位的单供者富血小板血浆（PRP）。使用腺嘌呤枸橼酸葡萄糖溶液 A（ACD-A）抗凝剂收集 PRP。
      注：血小板单采为连续性操作过程，采集时间通常在 40 至 90 分钟之间。供者所接受的 ACD 用量及操作时间取决于供者个体特征，例如红细胞压积和针头规格。
2. PRP 单位的特性
   注：以下步骤通常由自动化血液采集系统在血浆-血小板单采过程中自动完成。请查阅制造商的操作手册。
   1. 将单采收集的 PRP 单位用适量保存液重悬，残留血浆量应尽可能少，以确保在整个保存期间 pH 值维持在 > 6.4 以上，最终净体积平均为 180 mL（不含约 40 mL 抗凝剂溶液）。
      注：根据意大利法律，质量控制需确认血小板（PLTs）计数至少为 2.0 × 10¹¹ PLTs/单位，残余白细胞数应低于 1 × 10⁶ 个细胞/单位。
   2. 将去白细胞并经辐照处理的 PRP 在 22 °C ± 2 °C 条件下，置于血小板震荡器上保存，最长不超过 5 天，之后再进行进一步操作²³。
3. PRP 稀释
   1. 开始稀释 PRP 前，立即通过穿刺采血袋主袋获取样本，并使用血细胞计数器进行血小板计数。
      注：后续操作应在 II 级生物安全柜内无菌条件下进行。操作过程中需穿戴个人防护装备（实验服、手套和护目镜）。
   2. 用适量无菌 0.9% NaCl 溶液稀释 PRP，使最终浓度达到 0.32 × 10⁹ ± 0.03 × 10⁹ PLTs/mL，以模拟外周血中平均血小板浓度。
   3. 利用血袋专用穿刺针，将稀释后的 PRP 分装至 300 mL 空收集袋中，每袋净体积达到 190 mL。
   4. 取少量剩余稀释 PRP（通常为 1 mL）进行质量控制，检测可能的微生物污染。在微生物学实验室按照制造商说明进行无菌检测（见 材料表）。
      注：应使用专用于需氧血培养的培养瓶，能够从小体积血液样本中定性培养并回收需氧微生物（主要是细菌和酵母菌）。
   5. 将稀释后的 PRP 分装袋在 −80 °C 条件下保存，解冻前最长保存时间为 2 个月。

2. 富血小板血浆裂解物（PRP-L）的制备

1. 解冻
   1. 开始解冻程序前，确保已将水浴锅预热至 37 °C。将富血小板血浆（PRP）袋放入水浴中，等待其完全解冻。
2. PRP-L 收集
   1. 在室温下以 3000 x g 离心 PRP 袋 30 分钟。
      ​注意：后续步骤应在 II 级生物安全柜内无菌条件下进行。
   2. 利用转移袋的穿刺针，将离心后的 PRP 袋与一个空的无菌 300 mL 转移袋连接。小心地将 PRP-L 上清液转移至新袋中，避免转移沉淀物。如有可能，使用血袋压挤器辅助转移。
   3. 使用血袋封口机密封 PRP-L 单元的连接管。
3. PRP-L 分装
   注意：一个起始单元含 190 mL PRP（见步骤 1.3.3.）足以填充两套滴眼液套装（有关用于血液成分制备和保存滴眼液的具体医疗器械的详细信息，请参见材料表）。应在 II 级生物安全柜内打开滴眼液套装，将整条串联小瓶置于预连接注射器上方，并将三通阀中央箭头指向左侧，以避开细菌过滤器。
   1. 使用无菌注射器收集 30–60 mL PRP-L，并将注射器连接至灌装管路上的鲁尔锁接头。
   2. 根据制造商说明，将三通阀旋转半圈，打开 PRP-L 注射器与预连接注射器之间的通路。用 PRP-L 填充预连接注射器。
   3. 断开 PRP-L 注射器，关闭鲁尔锁接头的管帽，并将三通阀旋转回原始位置。使用滴眼液套装的注射器将 PRP-L 分装至各小瓶中。
   4. 重复步骤 2.3.1.–2.3.3.，直至所有给药小瓶均被填满。确保每个给药器均正确填充后，使用血袋封口机单独密封。
   5. 使用新的滴眼液套装重复上述分装程序。
   6. 取少量残留的稀释 PRP-L 样本，检测可能的微生物污染（见步骤 1.3.4.）。
      注意：若液体意外到达串联末端的细菌过滤器，吸液注射器可能会遇到阻力，从而阻碍填充过程。为继续分装，可将串联末端部分抬高约 5–6 个分装量，远离末端的疏水性细菌过滤器。在此位置，使用一个已装满空气的新的 30 mL 无菌注射器，连接至细菌过滤器的雌性鲁尔锁接口，用力并反复推动注射器活塞，以清除所有血液成分残留，使细菌过滤膜脱离液体。移除注射器后，继续填充剩余小瓶。
4. PRP-L 储存
   1. 正确标记每个给药器，并将其放入塑料袋中。同时标记塑料袋，注意标明供体的血型。
   2. 根据意大利法律²³和指南²⁴，在 −80 °C 下储存，最长可保存 24 个月，直至分配给患者。

3. PRP-L 的配制

1. 建议根据PRP-L血型进行患者分配。使用冷藏箱运送PRP-L给药瓶，并确保每瓶含有1.45 mL PRP-L，约相当于45滴。指导患者，给药瓶可在家中于−15 °C条件下保存最长1个月。

结果

使用血清来源的眼药水（这是治疗眼表疾病最常用的血液制品）的理论依据在于其含有生长因子（GFs），这些生长因子几乎完全来源于循环中的血小板。与外周血清相比，富血小板血浆（PRP）含有显著更高数量的血小板（因此也含有更高浓度的血小板来源生长因子），其血小板浓度范围为 0.15 x 10⁹-0.45 x 10⁹ PLTs/mL。根据意大利法规，PRP 制品中的血小板计数应至少达到 0.9 x 10⁹-1 x 10⁹ PLTs/mL。因此，为了获得能够模拟血清眼药水疗效的产品，在制备裂解物之前，应将 PRP 稀释至生理水平的血小板含量。

然而，由于组织修复主要由血小板来源的生长因子（GFs）驱动，仅凭血小板计数可能对眼表疾病的治疗效果产生误导。在干眼病（DED）中，泪液分泌和泪膜稳态功能受损，而DED是目前最常使用血液来源滴眼液治疗的眼病。因此，用于治疗DED的血小板制剂还应模拟泪液的生理成分。

为了确定最适合治疗眼表疾病的PRP-L（如本方案步骤...

讨论

近年来，基于血小板的产品在眼表疾病治疗中的临床应用日益增多，但其推广受到科学依据不足的限制。这主要是由于供体来源和制备方案存在较大异质性，且这些信息常常未被充分披露，或未针对具体临床用途进行专门设计。特别是通过单采法收集的血小板制品的相关信息仍较为缺乏。因此，本研究旨在详细描述通过单采法获取富血小板血浆裂解物（PRP-L）并用于干眼症（DED）治疗的逐步制备流程。

PRP-L 是制备滴眼液的理想来源，因其生长因子含量高于其他血液制品²², ，且与血清或 PRP 相比，其制备和储存成本更低、操作更简便。制备 PRP-L 时，需对血小板进行裂解（通常通过一次或多次冻融循环），以释放其内含物。该过程可确保获得富含活性分子的溶液，从而促进组织再生^22,26。目前已有越来越多的疾病采用 PRP-L 进行治疗²²，但在眼科领域的应用指征仍较弱，主要原因是血小板采集和 PRP...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
仪器设备
CompoSeal Mobilea II	Fresenius Kabi, Germany		血袋封口机
HeraSafe 通风柜	Heraeus Instruments, Germany		II级生物安全柜
MCS+ 9000 移动式血小板采集系统	Haemonetics, Italy		用于捐献血小板、红细胞、血浆或组合血液成分的自动化血浆及多组分采集设备
血小板振荡器，PF396i	Helmer, USA		血小板振荡器
Raycell X射线血液辐照仪	MDS Nordion, Canada		X射线血液辐照仪
ROTIXA 50RS	Hettich Zentrifugen, Germany		高速离心机
Sysmex XS-1000i	Sysmex Europe GMBH, Germany		用于血小板计数的血细胞分析仪
恒温水浴箱，WB-M15	Falc Instruments, Italy		恒温水浴箱
材料
ACD-A 抗凝剂溶液 A	Fenwal Inc., USA	DIN 00788139	用于血小板分离的抗凝剂溶液（1000 ml）
BD BACTEC Peds Plus/F 培养瓶	BD Biosciences, USA	BD 442020	无菌检测
BD BACTEC Peds Plus/F 培养瓶	BD Biosciences, USA	442020	至少2个培养瓶用于无菌检测
BD Luer Lok 注射器	BD Plastipack, USA	300865	至少4个无菌注射器（50 ml）
Bio-Plex 人癌症检测面板1	BioRad Laboratories, USA	171AC500M	用于PDGF亚型评估的标准面板
Bio-Plex 人癌症检测面板2	BioRad Laboratories, USA	171AC600M	用于EGF评估的标准面板
Bio-Plex MAGPIX 多重检测仪	BioRad Laboratories, USA	Magpix	该仪器利用功能化磁珠实现多种免疫检测
Bio-Plex Pro TGF-b 检测试剂盒	BioRad Laboratories, USA	10024984	用于TGFb亚型评估的试剂盒及标准品
BioRet	ARIES s.r.l., Italy	A2DH0020	至少4个用于血袋穿刺的穿刺针
血液采集管	BD Vacutainer, USA	367835	1支，用于进行血小板计数
滴眼液套件。COL 医疗器械，用于从血液成分中制备和保存滴眼液	Biomed Device s.r.l., Italy	COLC50	滴眼液套件。每采集一份富血小板血浆（PRP）至少需要2套
人癌症PDGF-AB/BB 检测试剂盒 1x96孔	BioRad Laboratories, USA	171BC511	用于PDGF亚型评估的试剂盒
人癌症2 EGF 检测试剂盒 1x96孔	BioRad Laboratories, USA	171BC603M	用于EGF评估的试剂盒
0.9% 氯化钠无菌溶液	Baxter S.p.A., Italy	B05BB01	1000 ml
OSDI 问卷	Allergan Inc., USA	OSDI	眼表疾病指数问卷
穿刺针	BioRet ARIES s.r.l., Italy	BS051004	穿刺针
血小板添加剂溶液 A+ T-PAS+	TERUMO BCT Inc., Italy	40842	血小板浓缩物的保存溶液（1000 ml）
Excel 软件	Microsoft, USA	Excel	数据分析软件
Teruflex 转移袋 1000 ml	TERUMO BCT Inc., Italy	BB*T100BM	用于PRP稀释，1个
Teruflex 转移袋 300 ml	TERUMO BCT Inc., Italy	BB*030CM	每采集一份PRP至少需要6个