用于治疗眼表疾病的富血小板血浆裂解物

摘要

血小板裂解物是治疗眼表疾病的一种新兴工具。本文提出一种从血小板捐献者采集的血小板裂解物的制备、分装、储存及表征方法。

摘要

多种眼表疾病采用血液来源的眼药水进行治疗。由于此类眼药水中含有促进眼表再生的代谢物和生长因子，其已在临床实践中得到应用。血液来源的眼药水可从不同来源（例如全血或血小板单采捐献）制备，并可通过不同方案（例如不同的稀释比例和冻融循环次数）进行生产。这种多样性阻碍了临床方案的标准化，从而影响对其临床疗效的评估。详细描述并共享方法学流程有助于制定通用指南。近年来，异体来源产品逐渐推广，作为自体治疗的替代方案，因其可提供更高的疗效标准；其中，富血小板血浆裂解物（PRP-L）眼药水的制备工艺较为简便。在意大利雷焦艾米利亚AUSL-IRCCS输血医学科，PRP-L来源于血小板单采捐献。该产品最初用0.9% NaCl将血小板浓度稀释至0.3 × 10⁹ 血小板/mL（起始平均浓度为1 × 10⁹ 血小板/mL）。稀释后的血小板经过冷冻-解冻处理，随后离心以去除碎片。最终产物分装为每份1.45 mL，于−80 °C保存。在发放给患者前，需对眼药水进行无菌检测。患者可将血小板裂解物在−15 °C保存最多1个月。此外，还对随机选取的分装样品进行生长因子成分分析，其平均值在本文中予以报告。

引言

血液来源的产品被广泛应用于伤口护理¹、颌面外科和骨科手术，以及多种眼表疾病²（如干眼症（DED）³）的治疗。在 DED 中，由于参与泪液生成和维持眼表完整性的多种因素功能异常，导致泪膜稳态受到破坏^4,5。

干眼症（DED）的病因和严重程度具有异质性^6,7,8，可能由多种因素引起，如衰老、性别⁹、佩戴隐形眼镜、局部或全身用药¹⁰，以及干燥综合征等原有疾病¹⁰。尽管症状较轻，干眼症仍影响全球数百万人，对其生活质量及医疗系统均造成影响⁶。

针对该病理已报道多种治疗方法，但目前对于最有效的治疗方案仍无共识¹²....

方案

用于生长因子定量评估的PRP-L是在一项更广泛的PRP产品表征研究中采集的，该研究旨在用于再生医学目的，由雷焦艾米利亚AUSL-IRCCS开展，并于2019年1月10日获得艾米利亚诺尔德广大地区伦理委员会批准（协议编号2019/0003319）。捐献者均根据《赫尔辛基宣言》签署了知情同意书。收集用于评估眼表疾病指数（OSDI）问卷的汇总性匿名数据无需伦理审批，该问卷为临床医生常规用于监测干眼综合征症状的工具。图1A展示了所遵循的实验流程示意图，而图1B中的图片则展示了该操作的主要步骤。

1. 富血小板血浆（PRP）的采集

1. PRP 单采
   1. 根据意大利法律选择本方案的血小板供者：供者年龄应在 18 至 65 岁之间，血压和血常规参数正常，血小板计数不低于 180 × 10⁹ 血小板/L²³。合格供者在献血前 1 周内不得服用抗血小板药物或抗凝药物。
   2. 使用自动化血液采集系统，按照制造商说明和国家法规²³ 进行血浆-血小板单采，以获得 1 个单位的单供者富血小板血浆（PRP）。使用腺嘌呤枸橼酸葡萄糖溶液 A（ACD-A）抗凝剂收集 PRP。

结果

使用血清来源的眼药水（这是治疗眼表疾病最常用的血液制品）的理论依据在于其含有生长因子（GFs），这些生长因子几乎完全来源于循环中的血小板。与外周血清相比，富血小板血浆（PRP）含有显著更高数量的血小板（因此也含有更高浓度的血小板来源生长因子），其血小板浓度范围为 0.15 x 10⁹-0.45 x 10⁹ PLTs/mL。根据意大利法规，PRP 制品中的血小板计数应至少达到 0.9 x 10⁹-1 x 10⁹ PLTs/mL。因此，为了获得能够模拟血清眼药水疗效的产品，在制备裂解物之前，应将 PRP 稀释至生理水平的血小板含量。

然而，由于组织修复主要由血小板来源的生长因子（GFs）驱动，仅凭血小板计数可能对眼表疾病的治疗效果产生误导。在干眼病（DED）中，泪液分泌和泪膜稳态功能受损，而DED是目前最常使用血液来源滴眼液治疗的眼病。因此，用于治疗DED的血小板制剂还应模拟泪液的生理成分。

为了确定最适合治疗眼表疾病的PRP-L（如本方案步骤.......

讨论

近年来，基于血小板的产品在眼表疾病治疗中的临床应用日益增多，但其推广受到科学依据不足的限制。这主要是由于供体来源和制备方案存在较大异质性，且这些信息常常未被充分披露，或未针对具体临床用途进行专门设计。特别是通过单采法收集的血小板制品的相关信息仍较为缺乏。因此，本研究旨在详细描述通过单采法获取富血小板血浆裂解物（PRP-L）并用于干眼症（DED）治疗的逐步制备流程。

PRP-L 是制备滴眼液的理想来源，因其生长因子含量高于其他血液制品²², ，且与血清或 PRP 相比，其制备和储存成本更低、操作更简便。制备 PRP-L 时，需对血小板进行裂解（通常通过一次或多次冻融循环），以释放其内含物。该过程可确保获得富含活性分子的溶液，从而促进组织再生^22,26。目前已有越来越多的疾病采用 PRP-L 进行治疗²²，但在眼科领域的应用指征仍较弱，主要原因是血小板采集和 PRP.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
仪器设备
CompoSeal Mobilea II	Fresenius Kabi, Germany		血袋封口机
HeraSafe 通风柜	Heraeus Instruments, Germany		II级生物安全柜
MCS+ 9000 移动式血小板采集系统	Haemonetics, Italy		用于捐献血小板、红细胞、血浆或组合血液成分的自动化血浆及多组分采集设备
血小板振荡器，PF396i	Helmer, USA		血小板振荡器
Raycell X射线血液辐照仪	MDS Nordion, Canada		X射线血液辐照仪
ROTIXA 50RS	Hettich Zentrifugen, Germany		高速离心机
Sysmex XS-1000i	Sysmex Europe GMBH, Germany		用于血小板计数的血细胞分析仪
恒温水浴箱，WB-M15	Falc Instruments, Italy		恒温水浴箱
材料
ACD-A 抗凝剂溶液 A	Fenwal Inc., USA	DIN 00788139	用于血小板分离的抗凝剂溶液（1000 ml）
BD BACTEC Peds Plus/F 培养瓶	BD Biosciences, USA	BD 442020	无菌检测
BD BACTEC Peds Plus/F 培养瓶	BD Biosciences, USA	442020	至少2个培养瓶用于无菌检测
BD Luer Lok 注射器	BD Plastipack, USA	300865	至少4个无菌注射器（50 ml）
Bio-Plex 人癌症检测面板1	BioRad Laboratories, USA	171AC500M	用于PDGF亚型评估的标准面板
Bio-Plex 人癌症检测面板2	BioRad Laboratories, USA	171AC600M	用于EGF评估的标准面板
Bio-Plex MAGPIX 多重检测仪	BioRad Laboratories, USA	Magpix	该仪器利用功能化磁珠实现多种免疫检测
Bio-Plex Pro TGF-b 检测试剂盒	BioRad Laboratories, USA	10024984	用于TGFb亚型评估的试剂盒及标准品
BioRet	ARIES s.r.l., Italy	A2DH0020	至少4个用于血袋穿刺的穿刺针
血液采集管	BD Vacutainer, USA	367835	1支，用于进行血小板计数
滴眼液套件。COL 医疗器械，用于从血液成分中制备和保存滴眼液	Biomed Device s.r.l., Italy	COLC50	滴眼液套件。每采集一份富血小板血浆（PRP）至少需要2套
人癌症PDGF-AB/BB 检测试剂盒 1x96孔	BioRad Laboratories, USA	171BC511	用于PDGF亚型评估的试剂盒
人癌症2 EGF 检测试剂盒 1x96孔	BioRad Laboratories, USA	171BC603M	用于EGF评估的试剂盒
0.9% 氯化钠无菌溶液	Baxter S.p.A., Italy	B05BB01	1000 ml
OSDI 问卷	Allergan Inc., USA	OSDI	眼表疾病指数问卷
穿刺针	BioRet ARIES s.r.l., Italy	BS051004	穿刺针
血小板添加剂溶液 A+ T-PAS+	TERUMO BCT Inc., Italy	40842	血小板浓缩物的保存溶液（1000 ml）
Excel 软件	Microsoft, USA	Excel	数据分析软件
Teruflex 转移袋 1000 ml	TERUMO BCT Inc., Italy	BB*T100BM	用于PRP稀释，1个
Teruflex 转移袋 300 ml	TERUMO BCT Inc., Italy	BB*030CM	每采集一份PRP至少需要6个