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方法文章

共聚焦与超分辨率成像技术揭示基底膜蛋白极化性细胞内运输及分泌过程 黑腹果蝇 卵子发生

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DOI：

10.3791/63778

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2022年5月19日

 , 
1Department of Biological Sciences, Northern Illinois University

本文内容

摘要

基底膜在发育过程中对组织和器官的形态发生至关重要。为了更好地理解导致该结构正确定位的机制，本文介绍了一种利用共聚焦显微镜和超分辨率显微镜观察和表征上皮细胞中基底膜蛋白的细胞内转运与分泌的方法。

摘要

基底膜（BM）是一种位于上皮细胞基底侧的特化细胞外基质结构，在上皮组织形态的建立与维持以及器官形态发生过程中起着关键作用。此外，基底膜对于组织建模至关重要，它不仅作为信号传导平台，还能提供外部作用力以塑造组织和器官。尽管基底膜在正常发育和病理条件下具有多种重要功能，但调控含基底膜蛋白囊泡的细胞内运输的生物学通路，以及基底分泌如何导致基底膜蛋白的极性沉积，目前仍知之甚少。Drosophila 卵巢的滤泡上皮是研究基底膜蛋白基底侧沉积的优良模型系统，因为它能够合成并分泌基底膜的所有主要组分。通过对固定组织进行共聚焦和超分辨率成像，并结合图像处理技术，可以鉴定和表征特异性参与基底膜蛋白细胞内运输与沉积的细胞因子。本文提供了一套详细的实验方案，用于在Drosophila 卵巢滤泡上皮中利用内源性标记蛋白对含基底膜的囊泡及已沉积的基底膜进行染色与成像。该方案适用于回答定性和定量问题，并专为高通量筛选而设计，可快速高效地鉴定在上皮组织发育过程中参与囊泡极性细胞内运输与分泌的相关因子。

引言

基底膜（BM）是一种薄层、分层的细胞黏附性细胞外基质（ECM），对上皮结构和形态发生至关重要1。它由约50种蛋白质组成，普遍存在于上皮细胞和内皮细胞下方，并包裹骨骼肌细胞、平滑肌细胞、心肌细胞以及脂肪细胞1,2,3。上皮细胞基底侧的基底膜三大主要成分是IV型胶原蛋白（Collagen IV）、Perlecan和层粘连蛋白（Laminins）。基底膜位于上皮细胞下方，在多种功能中发挥关键作用，包括组织分隔与屏障功能、生长支持以及细胞极性建立2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12。作为信号传导平台，基底膜在发育过程中调控上皮细胞及组织的形态和分化3,13,14。此外，基底膜的异常调控和/或其完整性的破坏是多种病理状态的主要原因，包括肿瘤转移2,15,16。尽管基底膜在组织和器官形态发生过程中具有重要功能，但专门负责基底膜蛋白极性胞内运输和分泌的生物学通路组分仍知之甚少。

为了研究含有基底膜（BM）的囊泡在细胞内的运输过程以及上皮细胞对基底膜蛋白的分泌，Drosophila 卵巢的滤泡上皮（FE）是一个强大的模型系统（图1）。一个 Drosophila 卵巢包含16–20个细长的管状结构，称为卵管（图1A、B）17,18,19。每个卵管可被视为一条卵子装配线，其中卵室（每个卵室发育为一个卵子）按年龄从前向后依次排列，并逐渐向后移动，直至成熟卵子经输卵管排出。每个卵室均由滤泡上皮（FE）包裹，FE是由单层体细胞滤泡细胞（FCs）构成的上皮层，包围着中央的生殖系细胞（GCs）。FE具有高度极性，表现出明显的顶-基底极性，其顶面朝向生殖系，而基底膜蛋白则从基底侧分泌18,19。滤泡细胞（FCs）主动分泌基底膜的所有主要组分，包括IV型胶原（Collagen IV）、Perlecan 和层粘连蛋白（Laminins）20,21。在滤泡细胞等上皮细胞中，基底膜组分在细胞内合成，并需要一种特化的极性分泌途径，以实现其在细胞外的正确定位沉积。例如，尽管已有大量研究聚焦于基底膜中最丰富的组分——IV型胶原（Collagen IV，简称 Coll IV）的合成与沉积，但其细胞内极性运输和分泌的具体机制仍不明确。Coll IV 在内质网（ER）中翻译合成，同时在此处由三条多肽链（两条α1链和一条α2链）组装成三股螺旋结构22。Coll IV 的正确折叠和功能依赖于内质网中的分子伴侣和酶，包括赖氨酰羟化酶和脯氨酰羟化酶，如 Plod 和 PH4αEFB20,22,23,24,25,26。这些翻译后修饰酶调控 Coll IV 在内质网中的分选过程，任一酶的缺失均会导致 Coll IV 滞留在基底侧的内质网中20,23,24,25,26。随后，新合成的 Coll IV 通过 COPII 包被囊泡从内质网转运至高尔基体。货物受体 Tango1 有助于将胶原蛋白包装成足够大的、靶向高尔基体的囊泡，以容纳大型多聚体蛋白20,27。一旦 Coll IV 被包装进细胞内的胞吐囊泡，它便特异性地从上皮细胞的基底侧分泌出去。为了引导基底膜在基底侧的沉积，上皮细胞还需要另一组专门负责极性分泌基底膜蛋白的因子。利用 Drosophila 卵巢的滤泡上皮系统，研究人员已鉴定出这一新型细胞过程中的若干关键组分，包括核苷酸交换因子（GEFs）Crag 和 Stratum、GTP 酶 Rab8 和 Rab10、磷脂酰肌醇 PI(4,5)P2 的水平，以及驱动蛋白 Kinesin 1 和 Kinesin 320,28,29,30,31。这些组分对于确保基底膜蛋白的极性分布至关重要。

为了监测基底膜蛋白在卵泡上皮（FE）中的细胞内定位，可以使用内源性标记的基底膜蛋白（蛋白捕获系），例如Viking-GFP（Vkg-GFP或α2 Coll IV-GFP）和Perlecan-GFP（Pcan-GFP）32,33。这些蛋白捕获品系已被证明能够准确反映基底膜蛋白的内源性分布，并可更灵敏地检测囊泡运输过程28,30。最初正是利用Vkg-GFP和Pcan-GFP的蛋白捕获品系，鉴定出参与卵泡上皮中基底膜极性沉积的相关组分20,28,29,30。蛋白捕获品系可用于不同的遗传背景中，包括突变体和Gal4品系34。此外，蛋白捕获品系还可与荧光染料和/或荧光免疫染色联合使用，从而在比较野生型与突变体条件时，精确表征基底膜蛋白的定位情况35。

为了准确且高效地评估含BM蛋白囊泡的分布与定位，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和超分辨率成像技术相较于其他成像方法具有显著优势。这些方法兼具高分辨率成像与操作相对简便的特点。CLSM是一种显微技术，通过使用振镜以光栅扫描方式用激光照射样品，从而提高光学分辨率。针孔光阑是共聚焦显微镜的核心组件。通过阻挡来自焦平面上方或下方的离焦信号，针孔光阑可在z轴方向实现极佳的分辨率36。这也使得获取一系列沿z轴方向的图像（称为z层叠，z-stack）成为可能，每幅图像对应一个光学切片。借助成像软件进行三维重建，z层叠可进一步生成样品的三维图像。via 相比之下，传统的落射荧光（宽场）显微镜允许离焦光线参与成像，从而降低图像的分辨率和对比度36,37。因此，在研究蛋白质定位或共定位时，落射荧光显微镜的适用性较低。

尽管共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）适用于多种应用，包括成像和表征基底膜蛋白的细胞内转运过程，但在对低于光的阿贝衍射极限（200–250 nm）的样本进行成像时仍存在局限性。在对这类样本成像时，共聚焦显微镜特别是使用油镜时可实现较高的分辨率。然而，超分辨率技术能够突破共聚焦显微镜的分辨率极限。目前有多种实现超分辨率显微成像的方法，每种方法具有特定的分辨率极限，并适用于不同的分析需求。这些方法包括光激活定位显微镜（PALM）或随机光学重建显微镜（STORM）、受激发射损耗显微镜（STED）、结构照明显微镜（SIM）以及艾里斑（Airyscan，超分辨率）显微镜38,39,40,41,42,43,44,45,46。尽管Airyscan的分辨率低于PALM/STORM、STED和SIM，但仍可达到约120 nm的分辨率（约为CLSM分辨率的两倍）。此外，研究表明，在对较厚样本或信噪比较低的样本进行成像时，这种超分辨率显微技术相较于SIM及其他超分辨率技术具有优势47,48。

Airyscan 是一种相对较新的超分辨率共聚焦显微技术46与传统的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）不同，后者利用针孔和单点探测器来消除离焦光线，这种超分辨率成像方法采用了一个32通道的砷化镓磷化物（GaAsP）光电倍增管面阵探测器，可在每个扫描位置收集全部光线。45每个32个探测器均作为一个小型针孔，将针孔尺寸从传统的1.0艾里单位（A.U.）减小至增强的0.2 A.U.，从而在保持1.25 A.U.直径效率的同时，实现更高的分辨率和信噪比45此外，Airyscan 所采用的线性去卷积可使分辨率提高多达2倍45因此，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM），尤其是超分辨率显微镜，是 非常适合研究基底膜蛋白以及调控基底膜蛋白沉积的蛋白质，因其能够提供高分辨率图像，用于定位和共定位分析，从而揭示调控这些过程的空间、时间和分子事件的新见解。

一种可用于定位实验的共聚焦显微镜替代方法是图像去卷积。由于宽场显微镜允许离焦光线到达探测器，因此可应用数学和计算去卷积算法，去除或重新分配宽场显微镜所获图像中的离焦光线，从而提高图像的分辨率和对比度49。去卷积算法也可应用于共聚焦图像，以进一步提升分辨率和对比度，所得最终图像几乎可与超分辨率显微镜相媲美50。Airyscan 技术结合了基于维纳滤波器的去卷积与 Sheppard 的像素重分配方法，显著提高了空间分辨率和信噪比。与共聚焦显微镜相比，采用该超分辨率显微技术可在三个空间维度上实现约 2 倍的分辨率提升（x 和 y 方向为 120 nm，z 方向为 350 nm）45,51。

本文提供了详细的优化方案，用于通过FE对细胞内BM蛋白的运输和沉积进行染色、采集和可视化 黑腹果蝇 以卵巢为模型系统，结合共聚焦显微镜和超分辨率显微镜技术。 果蝇 表达内源性标记基底膜蛋白的品系，例如 Vkg-GFP 和 Pcan-GFP，是可视化基底膜蛋白转运与分泌的高效且精确的工具。此外，这些品系可轻松应用于不同的遗传背景，包括突变体和 Gal4/UAS 线条34尽管建议使用内源性标记的基底膜蛋白，但针对特定基底膜蛋白的抗体也可与所述方案兼容。这些方案对于希望利用共聚焦和超分辨率成像技术在完整上皮组织中研究基底膜蛋白的细胞内运输和分泌过程的科研人员尤为有用。此外，该方法能够将上皮组织分析与广泛可用的 果蝇 遗传学使这一方法尤为强大。最后，这些方案可轻松地被调整用于研究其他目标蛋白的囊泡运输与分选。

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方案

1. 卵巢解剖用果蝇的制备

  1. 放入10-15 黑腹果蝇 所需基因型的雌性果蝇（1-2日龄）置于含有约8 mL培养基的窄口小瓶中 黑腹果蝇 在25 °C条件下，于解剖前2-3天在果蝇培养基中加入少量颗粒状干酵母。在培养瓶中加入几只雄蝇可提高卵室产量。但需确保果蝇总数不超过20只，以免对卵巢发育产生不利影响。
    ​注意：描述 果蝇 雄性和雌性，以及针对无相关经验科学家的实用技巧与建议 黑腹果蝇 相关经验可在引用的文章中找到34,52加入酵母可刺激卵子产生，并获得包含不同发育阶段的卵巢。此外，酵母还能使卵巢增肥，更易于解剖取出。也可使用湿酵母代替颗粒状酵母，但对于较弱的果蝇品系，果蝇可能被困住而死亡。

2. 卵巢解剖与固定

注意：有关卵巢解剖和染色的额外资源，读者可参考所引用的方案53,54,55。

  1. 解剖当天，用1×磷酸盐缓冲液（PBS）稀释PFA储备液，配制终浓度为4%的新型固定液。
  2. 使用CO2麻醉果蝇，并将其置于果蝇操作垫上。在解剖完成前保持果蝇处于麻醉状态。当果蝇停止活动时即视为麻醉成功，通常需要10–20秒。
    注意：尽管推荐使用CO2作为更安全且快速的麻醉方式，也可使用冰进行麻醉。
  3. 将带有浅凹孔的玻璃凹面载片或染色皿置于体视显微镜下，并在孔中加入1×PBS。
  4. 用一对镊子夹住雌性果蝇的胸部下部。通过观察腹部末端无雄性外生殖器结构，并且前足无性梳（作为次要特征）来确认果蝇性别52。在体视显微镜下（建议使用20倍放大），将果蝇浸入含1×PBS的孔中，用另一对镊子逐个进行解剖（见步骤2.5）。
  5. 在体视显微镜下观察，用另一对镊子牵拉果蝇腹部后端，使内部器官（如卵巢、肠道）暴露可见。
  6. 轻轻挤压果蝇腹部前端（类似挤牙膏的方式），使卵巢从体内挤出。此方法应能保持卵巢完整。随后分离并小心移除其他组织及果蝇残余物。
  7. 使用镊子或解剖针将卵巢中的卵管分离，同时保持整体卵巢结构完整。该步骤的目的是破坏覆盖卵巢的肌鞘，以实现更高效且均匀的染色。
  8. 迅速将卵巢转移至含有1×PBS的1.5 mL微量离心管中，并将管子置于冰上，直至所有果蝇完成解剖。若需观察微管或微丝（或由这些细胞骨架组分运输的囊泡），则不应将管子置于冰上，以免引起去聚合。
  9. 当所有卵巢均完成解剖并转移至微量离心管后，让其自然沉降至管底，吸除PBS至仅剩约50 µL。加入1 mL 4% PFA固定液，置于摇床平台上以15分钟进行振荡固定。重要的是，需观察卵巢是否在固定液中来回移动，以确保充分固定；固定不完全可能导致染色和成像问题。
    注意：摇床转速并非关键因素。部分摇床具备速度调节功能，而另一些则为预设转速。预设转速已足够，若可调节，建议设置为40–50 rpm。
  10. 去除固定液（同步骤2.9），随后用含0.1% Triton-X 100的1×PBST各1 mL进行两次快速洗涤，每次轻柔翻转离心管5–6次。接着用1 mL 1×PBST进行四次10–15分钟的长时间洗涤（总计40–60分钟）。
    注意：建议使用含0.1% Triton-X 100的1×PBS进行洗涤，因增加去垢剂浓度可能导致GFP变性，从而降低荧光信号，影响GFP标记的基底膜蛋白的检测。
  11. 如需进行染料染色（例如DNA和F-actin染色），请进入步骤3；如需进行免疫染色，请进入步骤4。卵巢可在4 °C条件下保存于1×PBST中，最长不超过24小时后再继续后续操作。

3. 标准DNA/F-肌动蛋白染色

  1. 固定并洗涤后，移除 PBST。加入 500 µL DNA 和 F-肌动蛋白染色液。配制 DNA/F-肌动蛋白染色液时，将 Hoechst（DNA 染料；1 mg/mL 储备液按 1:1000 稀释）和荧光标记的鬼笔环肽（F-肌动蛋白染料；Alexa Fluor 546 按 1:500 稀释，或 Alexa Fluor 647 按 1:100 稀释，两种储备液浓度均为 66 µM）溶于 500 µL PBST 中混合均匀。
  2. 用铝箔包裹管子，避免卵巢和染料暴露于光线下，以保持荧光稳定性，利于高效成像，并在摇床平台上于室温孵育 15 分钟。
  3. 孵育结束后，移除 DNA/F-肌动蛋白染色液（操作同步骤 2.9）。按照步骤 2.10 所述，用 1× PBST 进行两次快速洗涤和三次长时间（10–15 分钟）洗涤。随后按步骤 5 所述进行封片处理。

4. 荧光免疫染色

注意：这是用于荧光成像的标准免疫染色方案，适用于大多数一抗。

  1. 封闭与一抗免疫染色（第1天）
    1. 固定和洗涤后，按步骤2.9所述去除PBST。加入1 mL封闭液（PBS + 5% BSA），在旋转摇床上室温封闭卵巢至少1小时。
      注意：除BSA外，封闭液中也可添加胎牛血清（FBS）或正常山羊血清（NGS）。或者，可在4 °C下于旋转摇床上封闭过夜。
    2. 按步骤2.9去除封闭液，加入300 µL含一抗的抗体溶液，一抗需用封闭液按适当浓度稀释（具体浓度依所用抗体而定）。在4 °C下于旋转摇床上孵育过夜。次日，去除一抗溶液，进入二抗免疫染色步骤。
      注意：某些一抗可保存并重复使用。在某些情况下，重复使用的一抗可降低背景染色，从而获得更佳成像效果。但每种抗体的重复使用均需预先测试，以确保其有效性。
  2. 二抗免疫染色（第2天）
    1. 去除一抗溶液后，参照步骤2.10进行两次快速洗涤和四次长时间（10–15分钟）洗涤。使用新鲜的1× PBST小心重复洗涤，可减少非特异性背景，获得最佳成像效果。
    2. 按步骤2.9去除PBST，加入500 µL含荧光标记二抗的溶液，用于识别所使用的一抗。从此时起，用铝箔包裹管子以避光，以最大程度保护荧光信号，这对图像采集与分析至关重要。
      注意：二抗溶液中所用的荧光染料应避免与内源性标记蛋白的发射光谱重叠。例如，若使用GFP标记蛋白，建议选用红色或远红波长的Alexa Fluor二抗（如546、568或647 nm）。可将Hoechst染料以及Alexa Fluor 546或647标记的鬼笔环肽等荧光染料加入二抗溶液中，这些染料有助于标记整体细胞结构（如细胞核和F-肌动蛋白）。具体浓度请参见步骤3.1。
    3. 将卵巢置于二抗溶液中，在室温下于旋转摇床上孵育2小时。参照步骤2.10，在1× PBST中进行两次快速洗涤和四次长时间（10–15分钟）洗涤。随后按步骤5进行封片。

5. 染色后卵巢的封片

注意：如果卵巢发育良好且数量充足，该方法效果极佳。将卵巢在载玻片上小心制片对于获得最佳成像至关重要。

  1. 最后一次洗涤后，使用 p1000 移液器在管中轻轻吹打卵巢，使卵室分离。将管子保持直立状态 5–10 分钟，使卵室自然沉降至管底。仔细分离单个卵室对于获得最佳成像效果至关重要。
  2. 用巴斯德移液管吸除 PBST，留下约 50 µL。再用 p200 移液器尽可能吸除残留的 PBST。加入两滴封片剂，用量足以在 22 mm × 22 mm 盖玻片上均匀铺展。卵巢可在封片剂中保存于微量离心管内，置于 4 °C 条件下最多一个月，之后再进行封片。
    注意：市面上有多种不同的封片剂可供选择；推荐使用固化型封片剂（如 Aqua-Poly/Mount 或 ProLong Glass Antifade Mountant），以获得最佳成像条件。不建议使用甘油作为封片剂，因其可能导致成像效果不佳（例如荧光染料不稳定）。对于不发生聚合的封片剂，应使用盖玻片封固剂或指甲油密封盖玻片边缘，以固定其位置。
  3. 标记一张载玻片，并用柔软无尘纸擦拭，去除灰尘和指纹。剪去 p200 移液器吸头的末端，以便将黏稠的封片剂从微量离心管中顺利转移至载玻片。随后，缓慢地将封片剂中的所有卵室转移至载玻片上，注意避免产生气泡。
  4. 在解剖显微镜下，使用新的 p200 吸头或镊子轻轻展开封片剂及已分离的卵室，使其覆盖面积大致与盖玻片相当。
  5. 用镊子小心地将盖玻片（已用无尘纸清洁）以一定角度盖在卵室上，以避免产生气泡。
  6. 将载玻片平放在室温避光处静置 2 天，使其充分聚合。待封片剂完全固化后，可将载玻片置于 4 °C 避光条件下保存数周，以备后续成像。
    注意：在成像前，确保固化型封片剂已完成聚合。若封片剂尚未完全固化，卵巢会在盖玻片下漂浮，影响图像采集。此外，封片剂仅在完全固化后才能达到最佳折射率（详见产品说明书）。
  7. 替代封片方法：当卵巢样本稀少时，推荐使用此方法以减少组织损失。该方法（如下所述）在载玻片上进行封片的同时分离卵巢管和卵室，而非如步骤 5.1 所述在微量离心管中通过吹打完成分离。
    1. 最后一次洗涤后，吸除大部分洗涤液，仅保留约 100 µL。使用巴斯德移液管或 p1000 移液器，将完整的卵巢转移至 PBS 中的载玻片上。使用 p200 移液器小心吸除载玻片上尽可能多的 PBST。如有需要，可用无尘纸轻轻擦拭去除残留 PBST，但切勿触碰卵巢组织。
    2. 加入两滴封片剂。使用镊子或解剖针小心分离卵巢管和卵室。去除并弃去多余组织，然后在封片剂中将卵室和卵巢管铺展开。随后进行步骤 5.5–5.6。

6. 共聚焦图像采集

注意：本节提供使用任何共聚焦显微镜实现最佳图像采集的关键参数（图2）。

  1. 设置显微镜并按以下说明定位样品。
    1. 成像前，必须使用荧光显微镜的目镜定位感兴趣区域（ROI）。选用低倍物镜（20×）或用于图像采集的物镜（如40×或63×），并选择待成像的卵室。
      注意：建议使用高倍物镜（如40x或63x）进行图像采集（参见6.2.1）。
    2. 选定感兴趣区域（ROI）后，进行图像采集；共聚焦成像请进入步骤6.2，超分辨率成像请进入步骤7。
  2. 根据下文所述选择最佳图像采集的关键参数（代表性图像的关键参数示例如下所示） 表1).
    1. 选择物镜：为获取足细胞内BM蛋白的胞内运输和分泌过程的共聚焦图像，应使用40倍或63倍物镜。
      注意：为了获得最佳分辨率，强烈建议使用具有高数值孔径（NA）的平场复消色差物镜，此类物镜可提供最高的消色差校正效果。
    2. 为各通道/轨道选择激光器：对于GFP，使用488 nm激光器；对于DAPI或Hoechst，使用405 nm激光器；对于Alexa Fluor 546或568，使用561 nm激光器；对于Alexa Fluor 647，使用640 nm激光器。
      注意：每种激光选择将导致形成不同的通道/轨迹。此处，“通道”指在特定波长下，对选定感兴趣区域（ROI）中被激发的荧光分子所记录的强度分布所形成的图像。
    3. 针孔设置：为减少图像采集过程中的离焦光，将每个通道的针孔设置为1 AU。
    4. 激光强度与检测器增益设置：为优化图像灵敏度，需同时调节检测器总增益和激光功率。为准确设定图像灵敏度，建议使用范围指示器。调节总增益和激光功率，使目标结构（如含基底膜的囊泡）清晰可见，同时避免检测器饱和。
      注意：为避免荧光淬灭，应使用必要的最低激光功率。建议首先在尽可能低的激光功率下提高检测器增益。如果仅增加检测器增益无法达到理想的信号强度，则再逐步提高激光功率。推荐的激光功率强度范围为0.5%–1.2%。
    5. 帧尺寸：建议使用采集软件确定的最佳图像尺寸。对于大多数应用，应采用最大分辨率为1024 × 1024。更高的分辨率将显著延长采集时间。
    6. 扫描速度：使用6-9之间的扫描速度，这对大多数样品是安全的。如果样品噪声较大，可使用较慢的扫描速度以提高信噪比。然而，较低的扫描速度会增加光漂白和采集时间。
    7. 平均强度均值：为提高图像质量，采用平均强度均值法 通过 使用相同设置进行连续扫描。大多数情况下，采用两次平均扫描以提高信噪比，同时避免样品发生光漂白。
    8. 缩放：使用缩放功能调整扫描区域。对于40倍和63倍物镜，建议采用2倍至4倍的缩放倍数，以最有效地清晰观察前缘（FE）中含基底膜（BM）的囊泡。仔细选择最小的兴趣区域（ROI），以缩短采集时间。
  3. 使用 Zeiss Zen 软件获取 z-层叠图像时，请采用以下 z-轴切片参数，并按如下所述进行设置。
    注意：含有基底膜（BM）蛋白的囊泡及其他细胞内结构均为三维（3D）结构。通过对表皮（FE）进行z轴层扫成像可显著提高图像质量和分辨率。通常，扫描范围覆盖组织的厚度或深度即可有效观察细胞内定位。为获得最佳三维重建效果，建议使用软件确定的最佳层间间隔。对于40倍和63倍物镜，为实现理想的三维重建，应避免每层z轴间距超过0.5 µm。
    1. 点击 z轴扫描 主区域下方的复选框 采集 标签。选择 每切片所有轨迹 z-堆栈的扫描模式。这将导致每个z位置切片的通道轨道发生变化。
    2. 选择要观察样本的通道，然后单击 活体 开始实时扫描。建议使用检测GFP标记的BM蛋白所需的通道。
    3. 按照所述设置z轴堆叠的范围。使用显微镜上的微调旋钮，找到样本一端的z轴位置，然后单击 设置初始值同样，找到样本另一端的 z 位置并单击 设置最后.
    4. 对于z轴堆叠中的每个位置，选择范围指示器后分别点击每个通道，并根据需要调整激光强度和主增益，具体操作如步骤6.2.4所述。
    5. 将z轴堆叠的间隔设置为步骤6.3下方注释中推荐的步长大小。点击 开始实验 开始Z轴层扫采集。

7. 超分辨率图像采集

  1. 选择适用于 Airyscan 的物镜。为观察 BM 蛋白的细胞内定位，使用 63 倍油镜最为理想（图 3）。将物镜设为 63 倍，并在其镜头上轻轻滴加一滴浸油。将载玻片放置于物镜上，确保盖玻片朝向物镜，以便定位样本。
  2. 根据以下说明，选择适合所用荧光染料的配置参数。
    1. 在 采集 选项卡中点击 智能设置 按钮以配置新实验。选择 Airyscan （超分辨率）；选择后，需进一步在分辨率（Airyscan SR）、信噪比/灵敏度（Airyscan Confocal）和速度（Multiplex SR-2Y）之间进行选择。对于固定组织，建议选择 分辨率 ，以获得最佳成像效果。
    2. 在 配置您的实验 框中点击 + 以添加轨道/通道。从染料数据库中选择特定染料对应的轨道。对于多通道实验，根据需要逐个添加相应染料的轨道。
    3. 添加完所有轨道后，选择软件提供的实验方案之一。本实验建议使用 最佳信号 方案，尽管其速度略慢于“最智能（逐线）”方案，但能为每种染料生成最优的硬件设置，从而实现最大信号增益和最小发射串扰。实验设置并加载完成后，将在采集选项卡的成像设置窗口中显示。
    4. 选择智能设置后，探测器 GaAsP-PMT 的波长范围将自动选定。通过移动底部的滚动条来调整范围，可扩大或缩小范围，或整体移动至其他区域。请利用此功能确保两个不同通道的波长范围不重叠，以避免串扰。保存该配置以便将来重复使用。
  3. 配置完成后，继续按照步骤 6.2.8 调整缩放倍数和扫描区域。优化扫描区域以聚焦于感兴趣区域，从而减少扫描时间和存储空间。随后开始采集图像。
  4. 对每个单独通道，在 通道 下选择一个轨道并点击 实时 。使用范围指示工具调节主增益和激光功率（如步骤 6.2.4 所述），并遵循所有相关指南以避免像素饱和。通过点击 Airyscan 探测器视图 按钮，确认六边形探测器视图居中且对齐。大多数情况下，六边形探测器视图会自动居中并对齐。对其他通道重复此操作。
  5. 在采集模式切换窗口的 图像尺寸 下，点击 SR （超分辨率限制像素数），以充分发挥探测器的性能。系统将自动调整帧尺寸。
  6. 将平均次数保持为 无 ，通常无需平均，这有助于缩短扫描时间。在某些情况下，2 倍平均可改善信噪比。
  7. 以 8 位数据深度采集原始数据。点击 快照 以获取图像。如需采集 z 层切片堆栈，请参见步骤 6.3。
  8. 按以下说明进行图像处理。此过程将生成 16 位图像。
    1. 获取图像或 z 层切片堆栈后，点击 处理 > 方法 ，并选择 Airyscan 图像处理 。
    2. 首先执行自动滤波，并通过调整 SR 值进行进一步的手动处理，以获得样本的最佳成像效果。确定最优 SR 值后，点击 应用 生成处理后的图像。对于 z 层切片堆栈图像，可选择处理单个 z 切片（当前图像 [2D]）或点击 3D 处理 框处理整个 z 层切片堆栈。

8. 图像处理与数据分析（正交投影、三维重建与强度轮廓）

注意：本方法中用于生成正交投影、3D 重建 和强度分布图的步骤以 Zen 软件为例进行说明（参见材料表）。类似的数据分析也可使用 ImageJ 软件完成56。

  1. 按如下所述进行正交投影（图4).
    1. 在使用共聚焦或超分辨率显微镜获取z轴层扫图像（z-stack）后，生成正交投影，以在二维视图中观察细胞z轴方向上的囊泡（相较于三维重建）。为此，请单击 处理 > 方法 并选择 正交投影.
    2. 在参数中，选择所需的投影平面。对于 z 轴（z-stack）的投影，请选择 冠状面（XY） 平面。在 方法，选择 最大值 以获得最高质量的投影。
    3. 接下来，通过选择起始位置（起始 z 层）来确定投影的厚度，并确定投影的厚度（z 层总数）。理想情况下，应选择与细胞在 z 轴方向上的厚度相等的层数。
    4. 参数设置完成后，点击 应用 以XY平面方式生成z轴堆栈的投影。
      注意：在创建多个z轴层叠图像的正交投影以比较特定目标对象的数量时，为确保数据准确性，必须保持投影厚度相同（或尽可能接近）。
  2. 按照下述方法进行三维重建（图5).
    1. 创建z轴堆栈的三维重建以观察结构的定位和形态。对使用共聚焦和超分辨率成像方法获得的z轴堆栈均进行此操作。对于超分辨率z轴堆栈，需先按照步骤7.8中的三维处理方法进行处理，再进行三维重建。
    2. 要生成三维图像，请单击 3D 预览窗口中的图标。单击后，屏幕下半部分的显示控制区域将出现一个 3D 选项卡。此时可看到透明度、体积、最大值、表面和混合等 3D 视图选项。观察囊泡结构时，建议使用表面或混合视图。
    3. 为获得最高质量的图像，请选择 精确 设置时应避免使用最快档位，因为最快档位的精度较低，会导致三维渲染效果不佳。
    4. 图像生成后，通过旋转和缩放操作调整图像，以聚焦于目标区域，便于观察感兴趣的物体。在三维图像下进行操作 外观 表。
    5. 获得满意视野后，在“3D”选项卡下选择 显示分辨率，然后点击 生成图像这将创建一个与所查看方向相同的图像快照，并可保存和导出为多种文件格式。
  3. 按照以下所述生成强度分布图（图7).
    注意：可通过叠加图像观察与不同荧光信号相关的像素分布及强度轮廓，以确定其共定位情况。
    1. 一旦获得最佳图像 通过 共聚焦或超分辨率 成像，在 查看 面板的 预览 窗口，单击 简介在预览窗口中，将显示一个直方图，呈现强度随距离变化的分布情况，同时还会显示一个包含距离和强度值的表格。
    2. 在屏幕底部的显示控制区域，单击 箭头工具 在 轮廓定义 沿需要评估不同像素强度分布的物体长度方向绘制箭头。绘制箭头时，请先放大图像。
    3. 强度分布曲线将显示在图像预览的左侧，其中会显示沿箭头路径的距离及相应的峰值。要移除图像本身上显示的直方图，请取消勾选 在图表中显示轮廓 盒子
    4. 在 尺寸 在显示控制区域的选项卡中，取消选择不包含在强度轮廓中的任何通道。
    5. 在 图形 标签，双击 个人资料 在下方显示 注释/测量 打开盒子 格式化图形元素 弹出窗口。使用此窗口可更改箭头的颜色、样式及线条粗细。选择所需设置后，关闭该窗口。
    6. 点击 轮廓视图 在新图像部分，单击 tab。 当前视图 然后在 另存为 保存文件。建议将文件保存为 .tif 格式，以避免数据压缩和丢失。

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结果

本文所述方法可用于高效、准确地成像和表征极化上皮细胞（如卵泡上皮细胞）中基底膜蛋白的细胞内运输与分泌过程 果蝇 卵巢。接下来，我们提供使用所述方法获得的预期结果，以及相关建议和可能遇到的问题。为此，我们使用内源性标记的Vkg蛋白Vkg-GFP，果蝇 Col IV）时使用。然而，使用其他内源性标记的基底膜蛋白（如 Pcan-GFP）也可获得相同的结果。

设置最佳采集参数（图 2）
为准确表征上皮细胞中骨形态发生蛋白（如 Vkg 和 Pcan）的细胞内转运与分泌过程，必须按照所提供的方法正确设置共聚焦显微镜的采集参数。

利用共聚焦显微镜，可在Vkg-GFP被分泌并沉积于上皮基底膜（FE）之前，检测其在细胞内的定位（图2A）。已有研究表明，IV型胶原（Coll IV）在内质网（ER）中翻译后，会被转运至高...

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讨论

基底膜（BM）对胚胎发育、器官形态发生以及成体生理功能至关重要。此外，基底膜还作为信号传导平台，参与上皮细胞极性的建立与维持，并为组织提供结构支持2。然而，调控基底膜蛋白正确定位的机制仍不清楚。要更深入理解负责基底膜蛋白细胞内运输和极性分泌的生物学通路，就需要对这些通路的组分及其在基底膜加工过程中的作用进行细致分析。实现这一目标的一种方法是使用共聚焦显微镜和超分辨率成像技术。本文中，我们描述了黑腹果蝇（Drosophila）卵巢的制备及染色或免疫染色方法，以便利用共聚焦显微镜和超分辨率显微镜高效地观察滤泡上皮（FE）中基底膜蛋白的细胞内运输与分泌过程。

利用蛋白质捕获技术及内源性标记的蛋白质在野生型和突变条件下观察基底膜蛋白质细胞内运输与分泌的优势
本方案充分利用蛋白质捕获技术以及内源性标记的基底膜（BM）蛋白质（例如 Vkg-GFP 和 Pcan-GFP），对野生型（对照）和突变条件下滋养层（FE）中 BM 蛋白质的定位与分布进行成像和评估。相较于使用针对 BM 蛋白质...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢朱莉·默克尔对本文手稿提出的宝贵意见。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R15GM137236（资助对象：O.D.）支持。共聚焦和超分辨率图像使用配备Airyscan 2的蔡司LSM 900显微镜获取，该设备由美国国家科学基金会（NSF）MRI项目资助（项目号：2018748）购置。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Alexa Fluor 546 phalloidinInvitrogenA22283F-肌动蛋白染色（66µM 的 1/500）
Alexa Fluor 647 phalloidinInvitrogenA22287F-肌动蛋白染色（66µM 的 1/100）
Anti-GM130 抗体abcamab30637用于高尔基体染色（共定位）；使用浓度为 7µg/μL
Aqua-PolymountPolysciences, Inc.1860620封片介质
酵母（活性干酵母）Genesee Scientific62-103用于喂养果蝇以增大卵巢便于解剖
牛血清白蛋白（30% 溶液）Sigma-AldrichA7284用于封闭液
凹孔载玻片Electron Microscopy Sciences7156101用于解剖（可用玻璃凹面载玻片替代）
解剖针Fisher scientific13-820-024
果蝇培养箱Genesee Scientific/Invictus
果蝇品系：Perlecan-GFP Drosophila 品系（ZCL1700）Morin 等，2001
果蝇品系：UAS-Crag RNAi 品系（TRIP 品系 HMS00241）Bloomington 果蝇品系中心33594靶向 Crag 的 RNA 干扰
果蝇品系：Viking-GFP Drosophila 品系（CC00791）Buszczak 等，2007
果蝇品系：Vkg-GFP, tj-Gal4Devergne 等，2017。在滤泡上皮中驱动 Crag RNAi 的表达
镊子（Dumont 5 型）Fine Science Tools11251-30用于解剖
玻璃凹面载玻片Electron Microscopy Sciences7187804用于解剖（可用凹孔载玻片替代）
山羊抗兔 IgG，Alexa Fluor 568InvitrogenA11036二抗（用于 GM130 抗体）（5 µg/mL）
Hoechst（Hoechst 33342）InvitrogenH3570DNA 染色（1 μg/mL）
KimwipesKimtechFisher Scientific: 06-666精密擦拭纸
Leica 荧光体视显微镜  M165 FCLeica用于卵巢成像
显微镜载玻片Corning294875X25显微镜载玻片
旋转摇床Corning Life Sciences6720用于卵巢固定和染色
Nutri-Fly BFGenesee Scientific66-121果蝇饲料
20% 多聚甲醛溶液Electron Microscopy SciencesFisher Scientific: 15713用于配制 4% PFA
磷酸盐缓冲液片剂（PBS Tablets）Fisher scientificBP2944100用于配制 PBS 溶液
ProLong Glass 抗荧光淬灭封片剂InvitrogenP36980封片介质
方形盖玻片Corning285022用于显微镜载玻片的盖玻片
Triton x-100Sigma-Aldrich9036-19-5用于 PBST 溶液
Zeiss LSM 900 配备 Airyscan 2Zeiss共聚焦与超分辨率显微镜
Zeiss Stemi 305 体视显微镜Zeiss解剖显微镜
Zeiss Zen 软件 3.3 版（蓝色版）Zeiss图像采集与处理

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