共聚焦与超分辨率成像技术揭示基底膜蛋白极化性细胞内运输及分泌过程 黑腹果蝇 卵子发生

摘要

基底膜在发育过程中对组织和器官的形态发生至关重要。为了更好地理解导致该结构正确定位的机制，本文介绍了一种利用共聚焦显微镜和超分辨率显微镜观察和表征上皮细胞中基底膜蛋白的细胞内转运与分泌的方法。

摘要

基底膜（BM）是一种位于上皮细胞基底侧的特化细胞外基质结构，在上皮组织形态的建立与维持以及器官形态发生过程中起着关键作用。此外，基底膜对于组织建模至关重要，它不仅作为信号传导平台，还能提供外部作用力以塑造组织和器官。尽管基底膜在正常发育和病理条件下具有多种重要功能，但调控含基底膜蛋白囊泡的细胞内运输的生物学通路，以及基底分泌如何导致基底膜蛋白的极性沉积，目前仍知之甚少。Drosophila 卵巢的滤泡上皮是研究基底膜蛋白基底侧沉积的优良模型系统，因为它能够合成并分泌基底膜的所有主要组分。通过对固定组织进行共聚焦和超分辨率成像，并结合图像处理技术，可以鉴定和表征特异性参与基底膜蛋白细胞内运输与沉积的细胞因子。本文提供了一套详细的实验方案，用于在Drosophila 卵巢滤泡上皮中利用内源性标记蛋白对含基底膜的囊泡及已沉积的基底膜进行染色与成像。该方案适用于回答定性和定量问题，并专为高通量筛选而设计，可快速高效地鉴定在上皮组织发育过程中参与囊泡极性细胞内运输与分泌的相关因子。

引言

基底膜（BM）是一种薄层、分层的细胞黏附性细胞外基质（ECM），对上皮结构和形态发生至关重要¹。它由约50种蛋白质组成，普遍存在于上皮细胞和内皮细胞下方，并包裹骨骼肌细胞、平滑肌细胞、心肌细胞以及脂肪细胞^1,2,3。上皮细胞基底侧的基底膜三大主要成分是IV型胶原蛋白（Collagen IV）、Perlecan和层粘连蛋白（Laminins）。基底膜位于上皮细胞下方，在多种功能中发挥关键作用，包括组织分隔与屏障功能、生长支持以及细胞极性建立^{2,3,4,5,6,7,8,9,10,}

方案

1. 卵巢解剖用果蝇的制备

1. 放入10-15 黑腹果蝇 所需基因型的雌性果蝇（1-2日龄）置于含有约8 mL培养基的窄口小瓶中 黑腹果蝇 在25 °C条件下，于解剖前2-3天在果蝇培养基中加入少量颗粒状干酵母。在培养瓶中加入几只雄蝇可提高卵室产量。但需确保果蝇总数不超过20只，以免对卵巢发育产生不利影响。
   ​注意：描述 果蝇 雄性和雌性，以及针对无相关经验科学家的实用技巧与建议 黑腹果蝇 相关经验可在引用的文章中找到^34,52加入酵母可刺激卵子产生，并获得包含不同发育阶段的卵巢。此外，酵母还能使卵巢增肥，更易于解剖取出。也可使用湿酵母代替颗粒状酵母，但对于较弱的果蝇品系，果蝇可能被困住而死亡。

2. 卵巢解剖与固定

注意：有关卵巢解剖和染色的额外资源，读者可参考所引用的方案^53,54,55。

结果

本文所述方法可用于高效、准确地成像和表征极化上皮细胞（如卵泡上皮细胞）中基底膜蛋白的细胞内运输与分泌过程 果蝇 卵巢。接下来，我们提供使用所述方法获得的预期结果，以及相关建议和可能遇到的问题。为此，我们使用内源性标记的Vkg蛋白Vkg-GFP，果蝇 Col IV）时使用。然而，使用其他内源性标记的基底膜蛋白（如 Pcan-GFP）也可获得相同的结果。

设置最佳采集参数（图 2）
为准确表征上皮细胞中骨形态发生蛋白（如 Vkg 和 Pcan）的细胞内转运与分泌过程，必须按照所提供的方法正确设置共聚焦显微镜的采集参数。

利用共聚焦显微镜，可在Vkg-GFP被分泌并沉积于上皮基底膜（FE）之前，检测其在细胞内的定位（图2A）。已有研究表明，IV型胶原（Coll IV）在内质网（ER）中翻译后，会被转运至高.......

讨论

基底膜（BM）对胚胎发育、器官形态发生以及成体生理功能至关重要。此外，基底膜还作为信号传导平台，参与上皮细胞极性的建立与维持，并为组织提供结构支持²。然而，调控基底膜蛋白正确定位的机制仍不清楚。要更深入理解负责基底膜蛋白细胞内运输和极性分泌的生物学通路，就需要对这些通路的组分及其在基底膜加工过程中的作用进行细致分析。实现这一目标的一种方法是使用共聚焦显微镜和超分辨率成像技术。本文中，我们描述了黑腹果蝇（Drosophila）卵巢的制备及染色或免疫染色方法，以便利用共聚焦显微镜和超分辨率显微镜高效地观察滤泡上皮（FE）中基底膜蛋白的细胞内运输与分泌过程。

利用蛋白质捕获技术及内源性标记的蛋白质在野生型和突变条件下观察基底膜蛋白质细胞内运输与分泌的优势
本方案充分利用蛋白质捕获技术以及内源性标记的基底膜（BM）蛋白质（例如 Vkg-GFP 和 Pcan-GFP），对野生型（对照）和突变条件下滋养层（FE）中 BM 蛋白质的定位与分布进行成像和评估。相较于使用针对 BM 蛋白质.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 546 phalloidin	Invitrogen	A22283	F-肌动蛋白染色（66µM 的 1/500）
Alexa Fluor 647 phalloidin	Invitrogen	A22287	F-肌动蛋白染色（66µM 的 1/100）
Anti-GM130 抗体	abcam	ab30637	用于高尔基体染色（共定位）；使用浓度为 7µg/μL
Aqua-Polymount	Polysciences, Inc.	1860620	封片介质
酵母（活性干酵母）	Genesee Scientific	62-103	用于喂养果蝇以增大卵巢便于解剖
牛血清白蛋白（30% 溶液）	Sigma-Aldrich	A7284	用于封闭液
凹孔载玻片	Electron Microscopy Sciences	7156101	用于解剖（可用玻璃凹面载玻片替代）
解剖针	Fisher scientific	13-820-024
果蝇培养箱	Genesee Scientific/Invictus
果蝇品系：Perlecan-GFP Drosophila 品系（ZCL1700）			Morin 等，2001
果蝇品系：UAS-Crag RNAi 品系（TRIP 品系 HMS00241）	Bloomington 果蝇品系中心	33594	靶向 Crag 的 RNA 干扰
果蝇品系：Viking-GFP Drosophila 品系（CC00791）			Buszczak 等，2007
果蝇品系：Vkg-GFP, tj-Gal4			Devergne 等，2017。在滤泡上皮中驱动 Crag RNAi 的表达
镊子（Dumont 5 型）	Fine Science Tools	11251-30	用于解剖
玻璃凹面载玻片	Electron Microscopy Sciences	7187804	用于解剖（可用凹孔载玻片替代）
山羊抗兔 IgG，Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11036	二抗（用于 GM130 抗体）（5 µg/mL）
Hoechst（Hoechst 33342）	Invitrogen	H3570	DNA 染色（1 μg/mL）
Kimwipes	Kimtech	Fisher Scientific: 06-666	精密擦拭纸
Leica 荧光体视显微镜  M165 FC	Leica		用于卵巢成像
显微镜载玻片	Corning	294875X25	显微镜载玻片
旋转摇床	Corning Life Sciences	6720	用于卵巢固定和染色
Nutri-Fly BF	Genesee Scientific	66-121	果蝇饲料
20% 多聚甲醛溶液	Electron Microscopy Sciences	Fisher Scientific: 15713	用于配制 4% PFA
磷酸盐缓冲液片剂（PBS Tablets）	Fisher scientific	BP2944100	用于配制 PBS 溶液
ProLong Glass 抗荧光淬灭封片剂	Invitrogen	P36980	封片介质
方形盖玻片	Corning	285022	用于显微镜载玻片的盖玻片
Triton x-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5	用于 PBST 溶液
Zeiss LSM 900 配备 Airyscan 2	Zeiss		共聚焦与超分辨率显微镜
Zeiss Stemi 305 体视显微镜	Zeiss		解剖显微镜
Zeiss Zen 软件 3.3 版（蓝色版）	Zeiss		图像采集与处理