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猪骨髓间充质干细胞及其衍生的细胞外囊泡的分离与鉴定

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DOI：

10.3791/63785

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2022年4月22日

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1State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Fuwai Hospital, National Center for Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College, 2State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Center for Cardiovascular Experimental Study and Evaluation, National Center for Cardiovascular Diseases, Beijing Key Laboratory of Pre-clinical Research and Evaluation for Cardiovascular Implant Materials, Animal Experimental Center, Fuwai Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 3State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Department of Cardiology, Fuwai Hospital, National Center for Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College

本文内容

摘要

本文详细阐述了一种分离和鉴定猪骨髓间充质干细胞（pBM-MSCs）及其来源的细胞外囊泡（EVs）的方法，为骨髓间充质干细胞及其来源的细胞外囊泡移植疗效的临床前评价提供了方法学基础。

摘要

随着干细胞治疗在转化研究和再生医学中的发展，骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）作为一种多能干细胞，因其可即时获取且安全性已获证实而备受青睐。已有报道表明，BM-MSCs移植在多种疾病中对损伤组织的修复具有显著益处，这可能与其调节免疫和炎症反应的能力有关。 通过 旁分泌机制。具有双层脂质膜结构的细胞外囊泡（EVs）被认为是干细胞旁分泌效应的主要介导者。由于在细胞间通讯和表观遗传调控中具有关键作用，EVs 已被应用于 体内 用于免疫治疗。然而，与母体细胞类似，关于EVs移植疗效的大多数研究仍停留在小动物水平，尚不足以提供临床转化所需的充分证据。本文中，我们首先采用密度梯度离心法从猪骨髓中分离骨髓细胞（BMC），随后通过细胞培养获得猪骨髓间充质干细胞（pBM-MSCs），并经显微镜观察、诱导分化实验及流式细胞术鉴定其特性。此外，我们通过超速离心法从pBM-MSCs的细胞上清液中分离出其来源的EVs，并利用透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒追踪分析（NTA）和蛋白质印迹法（western blotting）成功验证了EVs的特征。总体而言，通过以下实验方案可有效分离并鉴定pBM-MSCs及其来源的EVs，该方法有望广泛应用于BM-MSCs及其来源EVs移植疗效的临床前研究。

引言

在过去10年中，干细胞疗法为患有多种疾病和损伤（如创伤、呼吸系统疾病和心血管疾病）的患者带来了巨大希望。随着该领域的进展，骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）因其易于获取且伦理争议较少而逐渐受到青睐1，尽管存在其他细胞类型，但一直被视为临床研究的金标准2基于骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）的疗法因其独特调节免疫和炎症反应以及修复受损组织的能力，正受到越来越多研究人员的关注。 通过 分化或旁分泌机制3.

细胞外囊泡（EVs），根据国际细胞外囊泡学会（ISEV）的定义4，指具有脂质双层结构并从细胞自然释放的总颗粒。随着近年来对不同细胞来源的细胞外囊泡（EVs）中多种内容物（如蛋白质、脂质和遗传物质，包括miRNA、mRNA、DNA分子以及长链非编码RNA）的不断发现5，它们在细胞通讯和表观遗传调控中的关键作用已得到公认6作为母体细胞的一种新型替代物，细胞外囊泡（EVs）已应用于免疫治疗和再生医学的相关研究中 体内，这些是正在进行的临床前研究和后续临床试验的基础7.

然而，目前关于骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）及其衍生的细胞外囊泡（EVs）移植疗效的研究大多仍停留在小型动物层面，尚不足以提供临床转化所需的充分证据。因此，迫切需要在猪等大型动物层面开展BM-MSCs及其衍生EVs移植的临床前研究。

据报道，骨髓间充质干细胞（MSCs）的数量极低，仅占骨髓总细胞数的0.01%至0.001%8然而，临床前应用骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）需要大量细胞（≥107 每只动物9；所需EVs的量更大，猪的中位剂量为每千克体重0.25 mg蛋白质10为实现如此庞大的数量，迫切需要一种安全有效的方法，从猪骨髓中分离和培养间充质干细胞（MSCs），以实现其大规模扩增 体外 随后以高蛋白浓度收集其细胞外囊泡（EVs）。

目前，分离骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）及其来源的细胞外囊泡（EVs）的方法有多种。现有的BM-MSCs分离方法包括骨髓细胞（BMCs）直接贴壁培养11、密度梯度离心法、细胞表面分子标记分选以及流式细胞术筛选。据报道，细胞表面分子标记分选和流式细胞术筛选会导致细胞贴壁率下降、24小时死亡率升高以及增殖抑制12，而BMCs直接培养则可能混入大量造血细胞。因此，目前普遍采用密度梯度离心法来获取BM-MSCs。从细胞上清液中分离EVs的现有方法包括超速离心法、超滤法、聚合物沉淀法和尺寸排阻法13。与其他方法相比，超速离心法具有成本低、操作简便、无需复杂预处理即可适用于大体积样本制备的优点，长期以来被视为EV分离的"金标准"14。然而，不同实验室在试剂和操作技术方面存在较大异质性3,15，可能对读者产生误导。本文详细阐述了一系列连续步骤，用于分离猪骨髓间充质干细胞（pBM-MSCs）及其来源的EVs，后续鉴定结果证明该方法可行，能够获得适用于临床前研究进一步分析的pBM-MSCs及其EVs。我们希望这项系统性工作能为从事pBM-MSCs及其衍生EVs移植临床前评价的研究人员提供方法学基础，从而推动临床试验尽早开展。

方案

根据美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）发布的《实验动物护理和使用指南》，所有实验程序均由中国医学科学院阜外医院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

1. 实验动物的术前准备

  1. 从中国科学院动物研究所获取约12月龄的成年雄性中国小型猪（体重30 ± 5 kg），并提前至少2周安置于阜外医院动物实验中心的设施中。进行术前检查，如血常规检测，以确保动物健康。
  2. 手术前一天清洁并剃除小型猪大腿区域的皮肤。为避免误吸，骨髓提取前需禁食12小时。

2. 细胞分离与培养的准备工作

  1. 使用 Percoll（1.130 g/mL）从骨髓中分离间充质干细胞。将储存液与10倍浓缩的PBS按9:1的比例混合，得到等渗液。再将等渗液与PBS按3:2的比例混合，配制成60% Percoll溶液（1.077 g/mL），该溶液可作为最终的分离液用于分离外周血骨髓间充质干细胞（pBM-MSCs）。
  2. 配制含10%胎牛血清和1.0%青霉素-链霉素的Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM），得到完全培养基。将完全培养基和PBS预先在37 °C水浴中预热，用于后续细胞培养。

3. 动物麻醉

  1. 以肌肉注射方式给予氯胺酮（10 mg/kg）和赛拉嗪（2 mg/kg）实施全身麻醉。当小型猪呼吸减慢、四肢活动减少时，迅速进行气管插管，并维持自主呼吸，以防止插管失败。
  2. 通过吸入2%异氟烷维持麻醉，以氧气（1.5 L/min）作为载气。在麻醉期间，实时监测小型猪的心率、呼吸频率和血氧饱和度。

4. 从迷你猪中提取骨髓

  1. 将小型猪置于侧卧位。为确保后续细胞培养所需的足够骨髓量，选择小型猪股骨近端作为骨髓穿刺部位（图1）。操作前对穿刺区域皮肤进行消毒并铺巾。
  2. 用非优势手绷紧穿刺点周围皮肤，用优势手将骨髓活检针垂直刺入穿刺点。当感觉到针尖接触皮质骨时，轻轻左右旋转针柄以推进穿刺针。当针进入骨髓腔时，通常会有一种阻力突然消失的感觉。
  3. 穿刺到位后，拔出针芯。然后将一次性无菌50 mL注射器连接至外针末端，并预先用肝素冲洗注射器内壁。
  4. 缓慢抽取20 mL骨髓，并小心转移至无菌50 mL离心管中。
  5. 操作完成后，拔出穿刺针并撤去铺巾。对穿刺部位进行消毒，并压迫20分钟以止血。
  6. 待小型猪恢复自主呼吸后拔管 。当其完全清醒且四肢可自由活动时，将小型猪放回笼中继续饲养。

5. 从骨髓中分离间充质干细胞

  1. 加入等体积预热的 PBS 至骨髓中，并充分混匀。然后用无菌移液管小心地将 20 mL 稀释后的骨髓液以 1:1 的体积比缓慢加至无菌 50 mL 离心管中密度梯度液（60%）的液面之上。
  2. 在室温（RT）下以 600 × g（加速度（ACC）= 5，减速度（DEC）= 5）离心 20 分钟。
    注：离心后离心管内形成四层，自上而下分别为血清层、单个核细胞层、密度梯度介质层和沉淀层。单个核细胞层为位于血清层与密度梯度介质层之间的一层薄薄的絮状层。来源于骨髓的间充质干细胞位于此层中。
  3. 将单个核细胞层转移至无菌 15 mL 离心管中，用 PBS 以 800 × g 离心 5 分钟，洗涤两次。
  4. 将洗涤后的细胞重悬于 2 mL 完全培养基中，并以 3–5 × 105/mL 的密度将重悬细胞接种至 175 cm2 的细胞培养瓶中。
    ​注：上述分离间充质干细胞的全部操作步骤如 图 2 所示。

6. 间充质干细胞的培养 体外

  1. 将培养瓶置于37 °C、5% CO2的饱和湿度环境中孵育。每24小时轻轻摇动培养瓶一次，以防止沉淀的造血干细胞贴壁生长，并在显微镜下观察细胞生长情况、形态及污染状况。
  2. 首次换液在培养3天后进行，之后每2–3天更换一次培养基。当细胞集落达到80%–90%融合度时，按1:2比例进行传代培养。

7. pBM-MSCs 的脂肪向、成骨向和软骨向分化

  1. 成脂分化实验
    1. 根据试剂盒说明书配制骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）的成脂分化诱导液A（液A）和诱导液B（液B）。有关该试剂盒的具体信息，请参见材料表。
    2. 向6孔板中每孔加入1 mL 0.1%明胶溶液，轻轻摇晃使液体均匀覆盖各孔底部。随后将6孔板置于洁净台或CO2培养箱中，静置至少30分钟。
    3. 30分钟后，吸除明胶溶液，每孔加入2 mL普通完全培养基。然后以2 × 104 个细胞/cm2的密度将pBM-MSCs接种至6孔板中。之后将培养板置于37 °C、5% CO2、饱和湿度条件下培养。
    4. 当细胞融合度达到100%时，小心吸除完全培养基，每孔加入2 mL液A。3天后，吸除液A，每孔加入2 mL液B。
    5. 维持1天后，吸除液B并更换为液A进行诱导。按照"液A诱导3天，液B维持1天"的方式，交替使用液A和液B进行连续诱导。
    6. 诱导期间每日观察细胞状态。若在液A诱导过程中细胞出现收缩或死亡现象，应及时更换为液B，直至细胞状态恢复。
    7. 重复上述诱导与维持过程，当显微镜下观察到足够数量且大小适宜的脂滴时，准备进行染色。
    8. 吸除6孔板中的成脂分化培养基，用1× PBS轻柔洗涤一次。每孔加入2 mL 4%多聚甲醛溶液，在室温下固定30分钟。
    9. 吸除多聚甲醛固定液，用1× PBS洗涤2至3次，确保彻底去除残留固定液。每孔加入2 mL油红O染液，室温染色30分钟。
    10. 吸除油红O染液，用1× PBS洗涤2至3次。每孔加入2 mL 1× PBS，随后在显微镜下观察成脂分化效果。
  2. 成骨分化实验
    1. 根据试剂盒说明书配制成骨分化完全培养基。
    2. 参照步骤7.1.2–7.1.3的方法接种并培养pBM-MSCs。
    3. 当细胞融合度达到70%时，小心吸除普通完全培养基，每孔加入2 mL成骨分化培养基。
    4. 每3天更换一次新鲜的成骨分化培养基。持续诱导2–4周，当成骨过程中出现明显钙结节时，准备使用茜素红染液进行染色。
    5. 吸除6孔板中的成骨分化培养基，用1× PBS轻柔洗涤一次。每孔加入2 mL 4%多聚甲醛溶液，在室温下固定30分钟。
    6. 吸除多聚甲醛固定液，用1× PBS洗涤2至3次，确保彻底清除固定液残留。每孔加入2 mL茜素红染液，室温染色10分钟。
    7. 吸除茜素红染液，用1× PBS洗涤2至3次。每孔加入2 mL 1× PBS，随后在显微镜下观察成骨分化效果。
  3. 成软骨分化实验
    1. 根据试剂盒说明书配制成软骨分化预混液。
    2. 将3–4 × 105个pBM-MSCs转移至无菌15 mL离心管中，在20 °C条件下以250 × g离心4分钟。
    3. 吸除上清液，加入0.5 mL预混液重悬前一步所得沉淀，随后在20 °C条件下以150 × g离心5分钟。重复此步骤一次，以再次洗涤细胞。
    4. 配制成软骨分化完全培养基。
    5. 用0.5 mL完全培养基重悬前一步获得的细胞，在20 °C条件下以150 × g离心5分钟。
    6. 松开离心管盖以利于气体交换，将离心管直立放置于37 °C、5% CO2、饱和湿度的培养箱中。
    7. 当细胞出现聚集现象时（通常在24–48小时后，视实际情况而定），轻弹离心管底部，使软骨球从管底脱落并悬浮于培养基中。
    8. 每2–3天更换一次新鲜的成软骨分化完全培养基。持续诱导至离心管中形成直径为1.5–2 mm的软骨球后，准备切片并进行染色。
    9. 按照病理实验常规步骤制备软骨球石蜡切片。将阿利新蓝染液加入脱蜡后的切片，37 °C染色1小时。
    10. 用流水冲洗切片5分钟，干燥后在显微镜下观察阿利新蓝染色效果。

8. 通过流式细胞术鉴定细胞表型

  1. 当第3-5代细胞集落达到80%-90%融合度时，移除培养基，并用预热的PBS洗涤细胞两次。然后加入3-4 mL 0.25%胰蛋白酶/EDTA消化细胞，在37 °C、5% CO2饱和湿度环境中孵育2-3分钟，显微镜下观察直至细胞从培养瓶底部脱落。
  2. 用10 mL完全培养基收集细胞，将细胞悬液转移至无菌的15 mL离心管中。在室温下以800 x g离心5分钟，弃去上清液，并用4 °C PBS洗涤细胞。
  3. 用4 °C PBS将细胞重悬至10 mL。将细胞悬液分装为九组，每组1 mL，分别置于1.5 mL离心管中，标记为阴性对照、FITC同型对照、PE同型对照、APC同型对照、CD105、CD29、CD90、CD14和CD45组。确保每管中的细胞数量在1 x 105至1 x 106之间。
  4. 在4 °C下以800 x g离心5分钟，弃去上清液后，再次用100 µL 4 °C PBS重悬各管中的细胞。除阴性对照组外，根据步骤8.3的顺序，向各管分别加入5 µL相应的同型对照（FITC、PE和APC小鼠IgG1 kappa同型对照）和用于流式细胞术的抗体（CD105、CD29、CD90、CD14和CD45单克隆抗体）。轻轻混匀后，在4 °C避光孵育1.5小时。
  5. 向每管中加入1 mL 4 °C PBS，在4 °C下以300 x g离心10分钟。弃去上清液，每管加入200 µL 4 °C PBS重悬细胞。
  6. 过滤细胞悬液后，通过流式细胞仪检测至少10,000个细胞，并使用流式细胞仪分析软件进行数据分析16。

9. 分离源自猪骨髓间充质干细胞的细胞外囊泡（EVs）

  1. 当pBM-MSCs融合度达到80%-90%时，弃去上清液，用PBS洗涤细胞2次。然后每瓶培养瓶中加入25 mL无血清IMDM，继续在37 °C、5% CO2的湿化环境中孵育48 h。
  2. 将细胞上清液（条件培养基，CM）收集至50 mL离心管中，在4 °C条件下以300 x g离心10 min，以去除细胞碎片。
  3. 再次将上清液转移至另一50 mL离心管中。收集上清液后应尽快进行EV的分离。如需长期保存，应将上清液于-80 °C冰箱中储存，以防止EV丢失。
  4. 将步骤9.3中的上清液在4 °C条件下以2,000 x g离心20 min。
  5. 将上清液转移至用于高速离心的无菌管中，在4 °C条件下以16,500 x g离心30 min。
  6. 再次将上清液转移至超速离心管中，使用固定角转子在4 °C条件下以120,000 x g离心至少70 min。
  7. 彻底弃去上清液。每根超速离心管中加入1 mL 4 °C的PBS，用微量移液器重悬沉淀。将同组的溶液混合至一根超速离心管中，然后加入4 °C的PBS，使液体体积超过管容量的3/4。
  8. 在4 °C条件下以120,000 x g离心60 min，并尽可能彻底去除上清液。
  9. 再次用无菌PBS重悬沉淀，并将EV储存在-80 °C冰箱中。
    注：重悬时PBS的用量可根据每两个175 cm2培养瓶的沉淀使用100 µL确定。上述EV分离的全部步骤在图3中系统展示。

10. 通过透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）和蛋白质印迹法鉴定细胞外囊泡（EVs）

  1. 将EVs样品在25 °C水浴中解冻后置于冰上，然后用PBS稀释至原浓度的一半，用于NTA检测17。
  2. 取10 µL样品滴加到铜网上，静置1分钟，用滤纸吸去多余液体。然后向铜网中加入10 µL磷钨酸溶液，静置1分钟，吸去多余液体。
  3. 室温干燥数分钟后，在100 kV加速电压条件下进行透射电子显微镜成像18。
  4. 将第9.9步获得的EVs样品用RIPA裂解缓冲液（25 mM Tris·HCl（pH 7.6），150 mM氯化钠（NaCl），1%壬基酚聚氧乙烯醚（NP-40），1%脱氧胆酸钠，0.1%十二烷基硫酸钠（SDS），1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF），1×蛋白酶抑制剂）重悬，通过Western blot检测EVs特异性标志物（如Alix、TSG101、CD81和CD63）的表达水平19。

结果

猪骨髓间充质干细胞的建立
成功分离并培养了源自猪骨髓的间充质干细胞 体外，不同时间点pBM-MSCs的形态学变化可见于 图4在pBM-MSCs的原代培养中，显微镜观察显示，细胞接种后1天出现贴壁现象，贴壁细胞通常呈圆形。原代pBM-MSCs在接种后一般保持静止期约3天，细胞增殖通常从第4天开始th 细胞增殖后，形态由圆形变为梭形、多边形或星形，细胞核居中，部分细胞可见双核仁。细胞培养7-9天后形成细胞克隆，12-14天可达到80%-90%的融合度。显微镜下观察显示，贴壁细胞呈散在的克隆样生长，排列成漩涡状。

传代后细胞增殖显著加快，一周内即可达到80%–90%的融合度。从第二代开始，细胞形态均一，呈纺锤形，类似成纤维细胞，长宽比约为2–3:1。若细胞发生分化，则可能呈现多边形或星形。传代后细胞不再以分散的集落方式生长，而是均匀地呈放射状平行排列。

通过染色鉴定细胞分化潜能
在成脂分化实验中，油红O染色显示细胞核周围出现大小不一的橙红色脂滴（图5A）；在成骨分化实验中，茜素红染色显示细胞表面出现红色结节（图5B），这是由pBM-MSCs分化而来的成骨细胞沉积的钙盐与染料发生颜色反应所致；在成软骨分化实验中，阿利新蓝染色显示整个组织切片呈蓝色（图5C），这是由于染料对软骨球中内源性酸性黏多糖进行染色所致。

通过流式细胞术鉴定细胞表型
通过细胞表面标志物检测对 pBM-MSCs 进行表型分析。流式细胞术结果（图6）显示，CD105、CD29 和 CD90 三种阳性标志物在 pBM-MSCs 表面显著表达，表达率分别为 96.5%、99.8% 和 92%（图6A–C）。然而，CD14 和 CD45 的表达呈阴性（图6D、E）。同时，相应同型对照的结果均为阴性，已在图中叠加显示，排除了抗体非特异性结合的可能性。

通过NTA、TEM和蛋白质印迹法鉴定pBM-MSCs来源的细胞外囊泡（EVs）
NTA结果显示，颗粒的中位粒径为126.9 nm，处于EVs的典型粒径范围内；此外，EVs样本的原始浓度为1.5 × 1010 粒子/mL，粒径的具体数值可参见图7A。粒子运动轨迹图如图7B所示，显示粒子呈现不规则的布朗运动。此外，在50,000倍电子显微镜下可清晰观察到盘状囊泡结构，这是EVs的经典形态特征（图7C）。同时，通过蛋白质印迹法检测到样本中存在EVs特异性标志物Alix、TSG101、CD81和CD63的表达（图7D）。

猪解剖图；标有生物研究穿刺点的骨骼结构。
图1：小型猪骨髓穿刺点。 红色区域显示骨髓抽取的穿刺部位，位于小型猪股骨近端。 请点击此处查看该图的放大版本。

用于从培养瓶中分离单个核细胞的骨髓提取和离心示意图。
图 2：从猪骨髓中分离间充质干细胞。 流程图展示了从猪骨髓中分离间充质干细胞的过程，密度梯度离心后清晰显示出四个液体层。请点击此处查看该图的放大版本。

细胞外囊泡分离示意图；从条件培养基中通过超速离心纯化细胞外囊泡的过程。
图3：分离来源于外周血单核细胞来源的间充质干细胞（pBM-MSCs）的细胞外囊泡（EVs）。 该示意图展示了通过超速离心法从条件培养基中分离细胞外囊泡的具体步骤。请点击此处查看该图的放大版本。

Cell culture growth over time; microscopy images at 3rd, 5th, 7th, and 9th day; research analysis.
图4不同时间点pBM-MSCs的形态学特征 3代pBM-MSCs可观察到相似的形态学特征rd, 5th, 7th，和 9th 接种后第9天，在100倍显微镜视野下可见细胞集落形成th 天 请点击此处以查看此图的放大版本。

不同染色方案下细胞培养的显微镜图像，用于细胞分析。
图 5．通过染色鉴定pBM-MSCs的分化潜能。（A）成脂分化，（B）成骨分化，以及（C）成软骨分化实验结果。pBM-MSCs的分化潜能可通过这些染色结果进行鉴定。请点击此处查看该图的放大版本。

CD标志物（CD105、CD29、CD90、CD14、CD45）表达分析的流式细胞术直方图。
图6：通过流式细胞术鉴定pBM-MSCs的结果。 CD105、CD29和CD90在pBM-MSCs表面显著表达，表达率分别为96.5%、99.8%和92.0%，而CD14和CD45的表达为阴性。请点击此处查看该图的放大版本。

NTA 粒径分布、NTA 图像、TEM 观察、Western 印迹、囊泡表征。
图 7：通过形态学和分子生物学方法鉴定pBM-MSCs来源的EVs的结果。（A）pBM-MSCs来源EVs的NTA检测结果，包括粒径分布图和（B）粒子运动轨迹图；（C）在50,000倍放大倍数下拍摄的透射电镜（TEM）图像，白色箭头显示盘状囊泡的经典结构；（D）通过Western印迹检测EVs特异性标志物的表达情况。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

小型猪传统的骨髓穿刺点位于髂嵴20尽管骨髓容易定位，但其提取量有限21 （通常仅约5 mL），因此难以满足大量扩增的需求 体外 用于移植 体内该方法中，我们将骨髓穿刺点重新定位至股骨近端，从此部位至少可抽取20 mL骨髓，确保获得足量的pBM-MSCs用于后续细胞培养。

用于通过密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）的两种主要分离溶液是Percoll和Ficoll。Percoll由硅化聚乙烯吡咯烷酮（PVP）组成，是一种新型无毒、无刺激性的密度梯度离心分离剂。Percoll的低扩散系数使其形成相对稳定的密度梯度，因此通常在较低离心力（200–1000 × g）下仅需数十分钟即可实现满意的细胞分离效果。既往已有采用Ficoll分离原代骨髓间充质干细胞（pBM-MSCs）的方法报道21。与Ficoll相比，Percoll因其易于等渗调节、黏度低、无毒且不会引起细胞聚集等优势，正逐渐被广泛应用，可作为现有pBM-MSCs分离方法的有效补充。

在分离和培养猪骨髓间充质干细胞（pBM-MSCs）的过程中，某些关键步骤不容忽视。首先，密度梯度离心后不同液相的成功分层是分离纯化pBM-MSCs的关键。骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）属于骨髓单个核细胞（BM-MNCs）的一种，其比重与淋巴细胞和单核细胞相近，约为1.075 g/mL。Percoll原液的密度为1.130 g/mL，为了在密度梯度离心后成功获得含有BM-MSCs的细胞层，需根据Percoll密度与浓度的关系预先配制60%等渗密度梯度分离液（密度为1.077 g/mL）22。此外，合适的离心条件也有助于实现良好的分层效果。考虑到Percoll的扩散系数较低，我们以相对较低的加减速水平（ACC = 5，DEC = 5）在600 × g 条件下离心提取的骨髓20分钟，从而获得了理想的分层效果。其次，适宜的接种密度对细胞培养同样至关重要。为了获得足够数量的MSCs（通常每只动物需超过107个9）以用于后续移植，我们采用175 cm2的培养瓶进行细胞培养。在以往的研究中20，通常将获得的BM-MNCs以5 × 105/cm2的密度接种于培养瓶中进行培养。已有报道指出，每5 mL猪骨髓经密度梯度离心后可获得2–3 × 107个BM-MNCs23。因此，在本方案中，我们建议将每20 mL猪骨髓分离得到的全部BM-MNCs接种至一个175 cm2的培养瓶中，以达到适宜的细胞密度。第三，在pBM-MSCs的分离与培养过程中应避免杂质污染。吸取单个核细胞层时，移液管不应插入Percoll层，以免混入分离液。此外，在细胞接种24小时后，应轻轻振摇培养瓶，以减少红细胞的黏附。

在超速离心过程中，蛋白质聚集体和脂蛋白污染会不可避免地影响细胞外囊泡（EVs）的定量和功能分析14。为了尽可能减少该过程中的污染，在进行超速离心步骤前每次转移上清液时，应保留底部至少5 mm深度的液体。同时，在第一次超速离心后，将沉淀重悬于无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中，再进行一次超速离心，可有效降低脂蛋白污染。

尽管密度梯度离心法和超速离心法已分别被广泛用于分离骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）及其来源的细胞外囊泡（EVs），但这两种技术各自存在局限性。一方面，Percoll 法耗时较长且操作繁琐，所得骨髓浓缩样本 通过 已报道一种床旁细胞浓缩装置可作为分离间充质干细胞（MSCs）的替代方法24另一方面，超速离心法不仅需要经过高度培训的技术人员，还需要昂贵的设备；因此，联合应用两种或多种技术可能是更高效分离细胞外囊泡（EVs）的合理策略25此外，pBM-MSCs 及其衍生的 EVs 的鉴定也需要改进。例如，根据定义 MSCs 的国际标准26此外，本研究通过流式细胞术对骨髓间充质干细胞表型进行鉴定时，仍缺少部分阳性或阴性标志物（如CD73、CD34和HLA-DR）的表达检测结果。同时，尽管在细胞外囊泡（EVs）分离过程中已采取措施避免污染，但由于实验室条件的限制，尚无法对EVs样本的纯度进行评估，以进一步优化后续实验工作。

本研究依次结合了pBM-MSCs及其衍生细胞外囊泡（EVs）的分离方法，并通过后续系统性的鉴定结果予以验证。特别是，我们强调了该系列步骤中的关键操作，解释了一些特定的实验条件，这些条件在一定程度上可解决不同实验室在该过程中存在的异质性问题。该方法学工作可广泛应用于BM-MSCs及其衍生EVs移植疗效的临床前研究，为临床研究提供充分水平的实验依据。

披露

所有作者均无利益冲突需要声明。

致谢

感谢杨建中和王学民在骨髓提取操作中的贡献。本工作得到中国医学科学院医学与健康科技创新工程基金（CIFMS）[项目编号 2016-I2M-1-009] 和国家自然科学基金（编号：82070307；编号：81874461）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
175 cm2 细胞培养瓶Thermo Fisher159910用于细胞培养
0.25% 胰蛋白酶/EDTAThermo Fisher25200056用于消化细胞
骨髓间充质干细胞成脂分化试剂盒OriCell  GUXMX-90031用于成脂分化检测
Alix 单克隆抗体Thermo FisherMA1-83977用于通过蛋白质印迹法鉴定细胞外囊泡（EVs）
APC 标记小鼠 IgG1 κ 同型对照抗体Thermo Fisher17-4714-42用于消除流式细胞术中非特异性染色的影响
CD105（内皮糖蛋白）单克隆抗体Thermo Fisher17-1057-42用于通过流式细胞术鉴定 pBM-MSCs
CD14 单克隆抗体Thermo FisherMA1-82074用于通过流式细胞术鉴定 pBM-MSCs
CD29/IGTB1 单克隆抗体Thermo FisherMA1-19458用于通过流式细胞术鉴定 pBM-MSCs
CD45 单克隆抗体Thermo FisherMA5-28383用于通过流式细胞术鉴定 pBM-MSCs
CD63 单克隆抗体Thermo Fisher10628D用于通过蛋白质印迹法鉴定细胞外囊泡（EVs）
CD81 单克隆抗体Thermo FisherMA5-13548用于通过蛋白质印迹法鉴定细胞外囊泡（EVs）
CD90 单克隆抗体Thermo FisherA15794用于通过流式细胞术鉴定 pBM-MSCs
骨髓间充质干细胞成软骨分化试剂盒OriCellGUXMX-90041用于成软骨分化检测
胎牛血清Gibco10099141C用于配制完全培养基
FITC 标记小鼠 IgG1 κ 同型对照抗体Thermo Fisher11-4714-42用于消除流式细胞术中非特异性染色的影响
流式细胞仪BDAccuri C6用于细胞表型鉴定
FlowJo 软件BDV10用于分析流式细胞术数据
高速离心管（50 mL）Beckman357003用于高速离心
Iscoves 改良杜尔贝科培养基（IMDM）GibcoC12440500BT用于细胞培养
低温高速落地式离心机AvantiJ-26XPI用于高速离心以获得洁净的条件培养基
壬基酚聚氧乙烯醚（NP-40）Sigma-AldrichNP40S用于配制 RIPA 裂解缓冲液
骨髓间充质干细胞成骨分化试剂盒OriCellGUXMX-90021用于成骨分化检测
PE 标记小鼠 IgG1 κ 同型对照抗体Thermo Fisher12-4714-42用于消除流式细胞术中非特异性染色的影响
PercollCytiva17089102用于分离猪骨髓间充质干细胞（pBM-MSCs）
苯甲基磺酰氟（PMSF）Thermo Scientific36978用于配制 RIPA 裂解缓冲液
磷酸盐缓冲液（10x）BeyotimeST476用于配制等渗 Percoll 溶液
磷酸盐缓冲液（1x）CytivaAF29561133用于稀释 Percoll 及洗涤细胞
蛋白酶抑制剂（1x）Thermo ScientificA32955用于配制 RIPA 裂解缓冲液
氯化钠Sigma-AldrichS9888用于配制 RIPA 裂解缓冲液
脱氧胆酸钠Sigma-AldrichD6750用于配制 RIPA 裂解缓冲液
十二烷基硫酸钠（SDS）Sigma-AldrichL3771用于配制 RIPA 裂解缓冲液
透射电子显微镜HitachiHT7700用于电子显微成像
Tris·HClSigma-Aldrich93363用于配制 RIPA 裂解缓冲液
TSG101 单克隆抗体Thermo FisherMA1-23296用于通过蛋白质印迹法鉴定细胞外囊泡（EVs）
超速离心机（50.2 Ti 转子）Beckmanoptima L-100XP用于超速离心以分离外泌体
超速离心管（26.3 mL）Beckman355654用于超速离心
ZetaVIEWParticle MetrixS/N 17-310用于纳米颗粒追踪分析

参考文献

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