方法文章

一种用于1型糖尿病、乳糜泻和新冠肺炎的高通量多重筛查方法

DOI：

10.3791/63787

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2022年7月5日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Barbara Davis Center for Diabetes, University of Colorado School of Medicine, 2Department of Endocrinology, Guangzhou First People’s Hospital, School of Medicine, South China University of Technology

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

鉴于迫切需要对1型糖尿病、乳糜泻以及2019冠状病毒病进行筛查，我们开发了一种高通量6重电化学发光检测法，可同时检测全部四种胰岛自身抗体、组织转谷氨酰胺酶自身抗体以及针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2的受体结合域抗体。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

一项正在进行的临床试验——儿童自身免疫筛查（Autoimmunity Screening for Kids，ASK）——是美国首次针对普通人群开展的1型糖尿病（T1D）和乳糜泻疾病的大规模筛查研究。随着2019冠状病毒病（COVID-19）大流行的持续，迫切需要了解COVID-19在普通人群中的流行病学特征，以及COVID-19感染与T1D发病之间可能存在的关联。目前标准的放射性结合分析法（RBA）面临两大挑战：单一检测模式导致效率低下，以及在筛查过程中产生大量低亲和力抗体，导致疾病特异性较低。基于我们先前建立的多重电化学发光（ECL）检测平台，开发出一种新型6重ECL检测方法，可在单个孔中同时检测T1D相关的四种胰岛自身抗体（IAbs），即抗胰岛素抗体、抗谷氨酸脱羧酶（GAD65）抗体、抗胰岛瘤抗原2（IA-2）抗体和抗锌转运蛋白8（ZnT8）抗体，以及乳糜泻相关的转谷氨酰胺酶自身抗体（TGA）和用于检测COVID-19的严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）受体结合域（RBD）抗体。该检测方法在盲法条件下使用来自ASK研究的880份样本进行了验证，其中包括325份抗体阳性样本和555份所有抗体均为阴性的样本，并与标准RBA方法及单一ECL检测进行了比较。由于具备高效率、低成本和所需血清量少等优势，该检测方法已被采纳为ASK研究的主要筛查工具。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

全球范围内的大型流行病学研究表明，1型糖尿病（T1D）的发病率正以每年3%-5%的速度迅速上升，过去20年中其患病率已翻倍，尤其在年幼儿童中更为显著1,2。胰岛自身抗体（IAbs）通常在临床症状出现前几年即已产生，目前是预测和诊断T1D最可靠的生物标志物3。对T1D自身抗体进行筛查，可识别出可能进展为临床T1D的高风险人群，提高公众认知，显著降低危及生命的酮症酸中毒并发症的发生率，并有助于预防性治疗的临床试验开展。目前全球正在推进T1D的预防工作，已针对IAbs阳性的个体开展多项干预性临床试验，以延缓其向临床T1D的进展。2016年，巴芭拉·戴维斯糖尿病中心在美国启动了首个面向普通人群的T1D和乳糜泻（CD）筛查临床试验——儿童自身免疫筛查项目（Autoimmunity Screening for the Kids, ASK）4。乳糜泻（CD）是一种与免疫和遗传因素相关的慢性肠道炎症性疾病。在患有T1D的儿童中，CD的患病率可高达24.5%5。超过一半的CD患者在就诊时可能并无典型症状6，因此对乳糜泻进行血清学筛查十分必要。

自2019冠状病毒病（COVID-19）大流行开始以来，全球已报告超过2亿例病例，其中儿童占实验室确诊病例的16%7。许多研究已证实1型糖尿病（T1D）对COVID-19感染严重程度和病死率的影响8，但COVID-19感染对T1D发生发展的影响尚不明确。迫切需要通过检测严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）抗体来调查普通人群中COVID-19感染的总体发生率，并研究COVID-19感染与触发T1D自身免疫或加速T1D进展之间的关联，而正在进行的ASK研究为此提供了极佳的平台。由于传统放射性结合分析法（RBA）采用单一检测模式，且产生大量低亲和力抗体阳性结果，导致其效率低下、疾病特异性差，已面临发展瓶颈9。本文介绍了一种新型6重电化学发光（ECL）检测方法，该方法基于我们先前建立的多重ECL检测平台，使用多孔板在一个反应孔中同时检测六种自身抗体，包括针对胰岛素（IAA）、谷氨酸脱羧酶-65（GADA）、胰岛瘤抗原-2（IA-2A）和锌转运蛋白-8（ZnT8A）的四种主要胰岛自身抗体（IAb），乳糜泻相关的转谷氨酰胺酶自身抗体（TGA），以及SARS-CoV-2受体结合域（RBD）抗体（COVID-19A）。这是首个将四种主要IAb完整组合，并进一步联合TGA和COVID-19A的多重检测方法。该方法已通过验证，并被正式采纳为ASK研究中替代标准RBA的主要筛查工具。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该研究方案已获得科罗拉多州多个机构审查委员会的批准。

1. 缓冲液的配制

  1. 配制标记缓冲液（2x PBS，pH 7.9）：将100 mL的10x PBS加入400 mL去离子水中，并用NaOH调节pH至7.9。
  2. 配制3 mM的生物素和Ru Sulfo-NHS溶液：将1 mg生物素溶解于588 µL标记缓冲液中，将150 nmol Ru Sulfo-NHS溶解于50 µL标记缓冲液中。
  3. 配制抗原缓冲液（1% BSA）：将5 g牛血清白蛋白（BSA）溶解于500 mL的1x PBS中。
  4. 配制包被缓冲液（3% Blocker A）：将15 g Blocker A溶解于500 mL的1x PBS中。
  5. 配制第一种洗涤缓冲液（0.05% Tween 20，PBST）：将2.5 mL Tween 20加入5,000 mL的1x PBS中混匀。
  6. 配制第二种洗涤缓冲液（0.4 M NaCl）：将50 mL的5 M NaCl加入575 mL去离子水中，配制成0.4 M NaCl溶液。
    ​注意：为确保高效的标记效果，务必使用新鲜配制的生物素和Ru Sulfo-NHS溶液，避免使用先前配制并储存的溶液。

2. 分别使用生物素和Ru Sulfo-NHS对抗原蛋白进行标记

注意：为了获得更高的标记效率，建议使用浓度≥0.5 mg/mL的抗原蛋白。

  1. 准备六种靶向抗原蛋白溶液，包括胰岛素原、GAD-65、IA-2、ZnT8、TG 和 SARS-CoV-2 刺突蛋白的受体结合域（RBD）。根据各抗原蛋白的分子量计算其摩尔数，并按照适当摩尔比配制生物素或 Ru Sulfo-NHS。对于小分子抗原（分子量 ≤10 kd），如胰岛素原蛋白，抗原与生物素或 Ru Sulfo-NHS 总量的摩尔比为 1:5；对于中等分子量抗原（分子量 10–50 kd），如 ZnT8，摩尔比调整为 1:10；对于大分子量抗原（分子量 >50 kd），如 GAD，摩尔比为 1:20。
  2. 将抗原蛋白均分为两份，分别按照步骤 2.1 计算出的摩尔比与生物素和 Ru Sulfo-NHS 混合。在室温（RT）下避光孵育 1.5 小时。
    注：抗原蛋白缓冲液中的所有还原性化学物质（如 Tris 或甘氨酸）需通过预先用 2x PBS 缓冲液（pH 7.9）平衡的凝胶过滤离心柱去除。
  3. 用 2x PBS 预平衡离心柱（离心柱规格为 2 mL 或 5 mL，取决于标记抗原蛋白的体积）：向离心柱中加入 1 mL 2x PBS 缓冲液，以 1,000 × g 离心 2 分钟，重复此步骤 2 次。
  4. 将抗原蛋白-生物素或抗原蛋白-Ru Sulfo-NHS 混合物通过预平衡的离心柱纯化一次（以 1,000 × g 离心 2 分钟），以纯化产物并终止标记反应。
  5. 测定从离心柱中洗脱出的标记抗原蛋白的最终体积，计算生物素或 Ru Sulfo-NHS 标记抗原蛋白的浓度。将标记后的抗原蛋白分装成小份（50 µL/管），并于 −80 °C 长期保存。
    ​注：每次通过离心柱后，蛋白的回收率约为 90%–95%。

3. 为6重ECL检测（棋盘式检测）确定生物素和Ru Sulfo-NHS标记抗原的最佳浓度和比例

注意：每种抗原在整合到多重检测之前，必须先进行棋盘滴定实验。

  1. 对每种抗原分别进行棋盘式实验。
    注意：步骤 3.2.-3.7. 以 TGA 为例进行简要说明。TGA 棋盘式实验过程旨在模拟实际检测流程，但仅使用一种抗原。
  2. 对生物素标记的 tTG 和 Ru Sulfo-NHS 标记的 tTG 进行系列稀释。推荐的第一混合溶液工作浓度均为 240 ng/mL。假设原始生物素标记和 Ru Sulfo-NHS 标记的 tTG 浓度均为 1.0 µg/µL。用 5% BSA 将原始 Ru Sulfo-NHS 标记的 tTG 稀释 10 倍，将原始生物素标记的 tTG 稀释 5 倍。
  3. 在一个离心管中加入 4 µL 生物素标记的 tTG 蛋白、156 µL 5% BSA（抗原缓冲液）和 240 µL 链霉亲和素偶联连接子，混匀后于室温孵育 30 分钟。然后加入 160 µL 终止液，再于室温孵育 30 分钟。取 400 µL 该混合液与 2 mL 终止液混合，所得混合液中生物素标记的 tTG 浓度为 240 ng/mL。
  4. 为制备生物素标记的 ZnT8 抗原的系列稀释液，另准备五个新离心管，从步骤 3.3. 的混合液中取 1 mL 与 1 mL 终止液在新管中混合，得到浓度为 120 ng/mL 的混合液。重复此步骤，进行连续 1:1 稀释，依次获得浓度为 60 ng/mL、30 ng/mL、15 ng/mL 和 7.5 ng/mL 的生物素标记 tTG。
  5. 取 4 µL Ru Sulfo-NHS 标记的 tTG 与 1.6 mL 终止液混合，得到浓度为 240 ng/mL 的 Ru Sulfo-NHS 标记 tTG 混合液。按照步骤 3.4. 的相同方法进行连续 1:1 稀释，获得浓度分别为 60 ng/mL、30 ng/mL、15 ng/mL、7.5 ng/mL 和 3.75 ng/mL 的 Ru Sulfo-NHS 标记 ZnT8 抗原。最后一个浓度为 0 ng/mL，仅含终止液，不含 Ru Sulfo-NHS 标记抗原。
  6. 准备 tTG 阳性对照和阴性对照血清样本（已通过单重 ECL tTG 检测预先验证并标准化）以及一块 96 孔 PCR 板。将阳性对照和阴性对照血清样本分别加入板的左半侧和右半侧，每孔 7 µL。向各孔加入 1× PBS，每孔 33 µL。
  7. 在 PCR 板的左半侧，将系列稀释的生物素标记 tTG-连接子溶液各取 24 µL 加入每孔，每列对应一个浓度，按从高到低顺序排列 。以相同方式，将系列稀释的 Ru Sulfo-NHS 标记 tTG 抗原各取 16 µL 加入每孔，每行对应一个浓度，充分混匀。在 PCR 板的右半侧重复该步骤。
  8. 继续执行步骤 5.3.-9.1. 中描述的其余实验步骤，直至获得原始计数数据。
  9. 计算阳性对照信号与相应阴性对照信号的比值。选择比值较高且阴性对照背景较低的条件，确定生物素标记抗原和 Ru Sulfo-NHS 标记抗原的最佳浓度。生物素和 Ru Sulfo-NHS 标记抗原蛋白的最优工作浓度如下：GAD65 为 16.0 ng/mL 和 8.0 ng/mL，SARS-CoV-2 RBD 为 18.8 ng/mL 和 9.4 ng/mL，IA-2 为 42.0 ng/mL 和 42.0 ng/mL，tTG 为 60.0 ng/mL 和 60.0 ng/mL，ZnT8 为 4.2 ng/mL 和 4.2 ng/mL，胰岛素原为 31.3 ng/mL 和 31.3 ng/mL。

4. 制备连接子偶联抗原溶液

  1. 根据步骤3.9，用5% BSA将生物素和Ru Sulfo-NHS标记的抗原稀释至最佳工作浓度。
  2. 将预先选定的连接分子与每种生物素化的抗原蛋白结合。对于一个96孔板检测，分别将4 µL生物素化的GAD65、SARS-CoV-2 RBD、IA-2、tTG、ZnT8和胰岛素原抗原蛋白加入含有156 µL 1% BSA的独立离心管中，并分别与240 µL对应的链霉亲和素偶联连接分子1、2、3、8、9和10混合（图1）。在室温下孵育30分钟。
  3. 向每根离心管中分装160 µL终止液，并在室温下继续孵育30分钟。从每根离心管中取出400 µL混合液，合并所有混合液。
  4. 向上述混合液中加入4 µL Ru Sulfo-NHS标记的GAD65、SARS-CoV-2 RBD、IA-2、tTG、ZnT8和胰岛素原抗原，然后加入1.6 mL终止液和3.2 mL 1x PBS并混匀。此时抗原溶液已准备好用于检测。

5. 将血清样本与标记抗原共同孵育

  1. 将血清按每孔 7 µL 分装至 96 孔 PCR 板中，并用封板膜密封。在 PCR 仪上于 56 °C 预热 30 分钟。将板短暂离心，100 × g 离心 1 分钟。
  2. 每孔加入 63 µL 抗原溶液（按步骤 4.4 制备），并与血清混合。用封板铝箔覆盖 PCR 板以避免光照。
  3. 在室温下以 450 rpm 振荡板 2 小时，随后于 4 °C 孵育 18–24 小时。

6. 准备6重检测板

  1. 从4 °C冰箱中取出一块6重孔板，使其恢复至室温。向6重孔板的每个孔中加入150 µL的3%阻断剂A。
  2. 将孔板放回4 °C冰箱中，用铝箔覆盖以避光，并过夜孵育。
    ​注意：第1天的实验步骤包括第4–6节。

7. 将血清/抗原孵育液转移至6重检测板

  1. 第二天，从冰箱中取出正在孵育的6-Plex板，倒掉板中所有缓冲液，将板轻轻拍在纸巾上以吸干残留液体。
  2. 每次每孔加入150 µL洗涤缓冲液，对6-Plex板进行3次洗涤。每次洗涤后将板放在纸巾上干燥，然后将过夜孵育的PCR板中各孔的血清/抗原孵育液分别转移30 µL至6-Plex板的两个孔中（每孔30 µL，设两个复孔）。
  3. 用铝箔封板后，将板置于板式振荡器上，在室温下以450 rpm的速度振荡孵育1小时。

8. 洗涤6重孔板并加入读板缓冲液

  1. 将溶液倒入6-Plex板中，每次用150 µL的0.4 M NaCl洗涤缓冲液对每孔洗涤一次，共洗涤3次。
  2. 第三次洗涤完成后，将板倒置在纸巾上干燥，并向每孔中加入150 µL读板缓冲液。
    ​注意：孔中的气泡会影响酶标仪读数的准确性，应尽可能避免。

9. 读取酶标板并分析数据

  1. 在电化学发光分析仪上读取平板计数。读数结果将以每秒计数（CPS）值表示。根据读板仪获得的原始CPS值，结合每种特异性抗体的内部阳性和阴性对照的CPS值，计算各样本的相对抗体指数（指数值 = [样本CPS - 阴性标准品CPS] / [阳性标准品CPS - 阴性标准品CPS]）。
  2. 使用已建立的99.5%界值确定抗体检测结果为阴性或阳性th 至 99.8th 来自 ASK 研究的 555 例阴性对照样本（所有抗体阴性且无糖尿病病史或家族史及其他任何类型自身免疫性疾病）的百分位数。
    注意：第2天的实验步骤包括第7至第9节。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

表1、表2 和 表3 展示了代表性结果。表1 列出了读数仪获得的原始 CPS 值。表2 中，原始 CPS 值按六种连接子及其对应的抗体进行排列和分类。表3 显示了根据检测方案中所述方法，以 CPS 计算得出的指数值。所有原始计数值均应进行核查，以避免因重复性差而导致最终指数结果错误。表1 中给出了重复性差的示例，这些数据导致了 表3 中最终指数计算出现误差。

本实验采用盲法，使用来自 ASK 研究的 880 份样本进行验证，其中包括 325 份 IAbs 阳性样本和 555 份所有抗体阴性样本。对这 880 份样本，6-重 ECL 检测所测得的自身抗体水平被逐点与相应单项 ECL 检测（图 2）以及相应的单项标准 RBA 检测结果（图 3）进行比较。每种抗体的临界值、敏感性和特异性列于表 4中。该 ECL-COVID-19A 检测的敏感性和特异性分别为 100% 和 99.9%10。

通过ELISA检测自身抗体的示意图；复杂的蛋白质相互作用、微孔板、标记的抗原。
图1：6重ECL检测法示意图。 血清自身抗体介导了Ru Sulfo-NHS标记的抗原与生物素化抗原之间的连接，后者与特定连接子偶联，形成抗原-抗体-抗原-连接子复合物。这些复合物通过各自的特异性连接子被捕获至6重孔板上的特定位点。针对每种抗原，分别指定了特定的连接子编号：GAD-连接子-1、Covid-19-连接子-2、IA-2-连接子-3、tTG-连接子-8、ZnT8-连接子-9 和 胰岛素原-连接子-10。本图已经He等11许可修改。 请点击此处查看该图的放大版本。

抗体浓度的散点图；检测中ECL信号数据的相关性分析。
图2：ASK研究中880份样本的六种抗体水平在单重ECL检测与6重ECL检测之间的比较。 各子图分别显示GADA、IAA、IA-2A、ZnT8A、TGA和COVID-19A的抗体水平比较（其中COVID-19A的指数以（100 × 计算指数值）表示）。虚线表示每种抗体检测的临界值（cutoff）。本图经He等11许可修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

散点图比较GADA、IA-2A、IAA、ZnT8A、TGA的RBA与6-Plex ECL检测结果；相关性分析。
图3：ASK研究中880份样本的五种抗体水平在RBA与6-Plex ECL检测方法之间的比较。 各子图分别显示GADA、IAA、IA-2A、ZnT8A和TGA抗体水平的比较结果。虚线表示每种抗体检测的临界值（cutoff）。本图经He等11许可修改。 请点击此处查看该图的放大版本。

表1：原始CPS计数（平板左侧）。 从检测板左侧获得的原始CPS计数。每个样本均设置两个重复。同一列（A1、A2、A3等）中的每个CPS计数代表同一孔中10个位点的读数数据（对应的连接子编号已标注）。重复性差的示例在D-连接子3第5列和第6列中以灰色高亮显示。 请点击此处下载该表格。

表2：使用六种连接子对表1数据进行重新排列。 根据表1中的CPS值进行重新整理，计算CPS重复读数的平均值，并删除连接子4-7的未使用数值。每种自身抗体检测中的内标高阳性、低阳性和阴性对照值以深色粗体标出。PC，阳性对照；NC，阴性对照。请点击此处下载该表格。

表3：指数值结果。 针对所有六种抗体，每个样本的指数值均相对于相应的阳性和阴性对照进行计算。指数值高于临界值的结果定义为阳性，以深色粗体标出。表1 中D-linker 3第5和第6列的不良重复CPS值，导致样本11的IA-2A指数值呈阳性（以灰色高亮显示），该结果可能为假阳性。请点击此处下载该表格。

表4：在880份ASK样本中检测GADA、IA-2A、ZnT8A、IAA和TGA的检测临界值、敏感性和特异性，其中包括325份IAb阳性样本和555份所有抗体阴性样本。 GADA、IA-2A、ZnT8A、IAA和TGA检测的最佳临界值指数设定为555份正常对照样本的第99百分位及以上。请点击此处下载该表格。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1型糖尿病（T1D）的干预已进入T1D前期阶段，目前多个国家和国际性的大规模筛查项目正在开展，同时针对T1D 1期的大量临床试验也正在实施，旨在阻止或延缓进展为临床显性T1D12,13。在当前标准放射性结合分析法（RBA）中，使用单一自身抗体检测格式测定四种胰岛自身抗体（IAb）的方法对于大规模人群筛查而言费时且效率低下。鉴于对高通量多重IAb检测技术的迫切需求，多重电化学发光（ECL）检测、3-Screen ICA ELISA以及基于凝集-PCR的抗体检测（ADAP）已成为当前具有竞争力的技术。在德国针对儿童群体开展的Fr1da T1D筛查研究中，3-Screen ICA ELISA联合检测三种IAb（GADA、IA-2A和ZnT8A）被用作主要检测方法14。3-Screen ICA ELISA的主要局限在于未包含胰岛素自身抗体（IAA），而IAA通常是T1D患儿最早出现且在年幼儿童中流行率较高的IAb。此外，该检测无法从阳性信号中明确判断是哪一种IAb呈阳性，因此每个阳性样本均需通过三种单项检测重复验证。ADAP15联合检测GADA、IA-2A和IAA，在国际自身抗体标准化计划（IASP）研讨会中显示出高灵敏度和特异性，但尚缺乏关于其在基于人群的T1D筛查研究中预测效能的数据，而这一点是IASP研讨会本身无法确定的。本研究所采用的多重ECL检测建立在单重ECL检测平台基础之上，该平台已在多项临床试验（如TrailNet9,16、DAISY17,18,19以及ASK4,20,21研究）中被验证，与当前标准RBA具有良好的一致性。本研究中的检测方法已使用来自ASK研究的880份血清样本，与RBA和单重ECL检测进行了验证。如图2和图3所示，6重ECL检测与单重ECL检测或RBA在抗体阳性结果上的抗体水平总体一致。通过RBA与6重ECL检测所得IAb结果的一致率为91.7%–97.8%，而单重ECL与6重ECL检测的一致率为95.3%–99.2%。ECL检测与RBA之间的不一致主要出现在仅有一种IAb阳性的样本中。6重ECL与单重ECL检测的IAb水平之间具有良好的相关性（r = 0.6431–0.9434，所有p < 0.0001），6重ECL与RBA检测之间亦具有良好相关性（r = 0.5775–0.8576，所有p < 0.0001）。6重ECL检测的组织型谷氨酸脱羧酶抗体（TGA）结果与RBA（99.4%）和单重ECL检测（99.4%）高度一致。此外，6重ECL检测的抗SARS-CoV-2抗体（COVID-19A）与单重ECL检测结果的符合率达到99.8%。

因此，6重ECL检测法已被正式采纳为正在进行的ASK研究的主要筛查方法，并取代了标准RBA22。与标准RBA相比，该检测法表现出优异的灵敏度和特异性，且通量更高、成本更低、所需血清体积更小。

已有文献记载，在1型糖尿病（T1D）筛查研究中，通过放射性结合分析法（RBA）检测出的单一胰岛自身抗体（IAb）占所有IAb阳性结果的较大比例，但其亲和力较低，疾病风险较低，总体预测价值也较低19,21,23,24,25,26。此类低风险预测导致随访检查产生巨大额外成本，并给T1D预防性研究带来困难。已建立的电化学发光（ECL）检测平台在多项临床试验中已被证实，能够区分RBA检测出的高亲和力与低亲和力IAb，并显著提高所有四种IAb的预测价值，尤其在单一IAb阳性情况下效果更为明显16,17,18,21。多重ECL检测技术建立在单重ECL检测平台的基础之上，继承了其特异性检测高亲和力抗体的显著优势。在本研究中，6重ECL检测显示出与相应单重ECL检测在敏感性和特异性方面具有相似的表现。

多重ECL检测使用多块Plex板时存在的一些局限性和技术问题已在先前的出版物中有所论述27,28在同一个孔中使用六种标记抗原时，不同抗原之间可能存在相互影响，且在同一孔中进行多重抗体检测时，检测背景信号可能随之增加。需要开展大量的检测条件优化工作，特别是根据每种抗原的棋盘滴定实验，调整每种标记抗原蛋白的最终浓度，以维持每种抗体检测的灵敏度和特异性。如先前研究中所述27,28，少量样本（<1%）会导致多重Plex板出现假阳性结果，且无明确的潜在原因。所有阳性结果均应通过单个ECL检测重复并确认，作为常规实验室质量保证措施；通常情况下，假阳性结果将被排除。由 "前带效应" 在之前的7重ECL检测中观察到27,28 在本研究中未观察到上述情况。在本实验方案中，我们省略了先前方案中血清样本的酸处理步骤，改为将血清样本在56 °C预加热30分钟（步骤5.1）。在第二天的板洗过程中，我们使用含有0.4 M NaCl的洗涤缓冲液（步骤8.1）替代常规洗涤缓冲液，以实现更严格的洗涤。这些改进使多重电化学发光（ECL）检测操作更简便，背景信号降低，同时未影响检测灵敏度。

综上所述，该检测方法在同时检测四种胰岛自身抗体（IAb）、甲状腺球蛋白抗体（TGA）和新型冠状病毒抗体（COVID-19A）方面表现出优异的性能。其多重检测能力，以及高通量、低成本和所需血清量少等优势，使得在普通人群中大规模筛查1型糖尿病（T1D）及其伴随疾病变得更加可行。患有1型糖尿病或任何一种自身免疫性疾病的患者，发生其他自身免疫性疾病的风险显著增高。这种多重电化学发光（ECL）检测法为同时筛查1型糖尿病及多种自身免疫性疾病提供了一个极佳的平台。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究由JDRF基金2-SRA-2019-695-S-B、2-SRA-2020-965-S-B、1-SRA-2017-564-M_N、NIH基金DK32083以及糖尿病研究中心（DRC）基金P30 DK116073资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5 mM NaClThermoFisher1070832
96孔板振荡器VWR12620-926
96孔圆底板Fisher8408220
生物素ThermoFisherPI21329
封闭剂AMSDR93AA
500 ml瓶顶过滤装置Fisher0974064A
牛血清白蛋白SigmaA-7906
GAD65蛋白Diamyd Medical10-65702-01
IA-2蛋白（氨基酸605-979）Creative BioMart283309
MESO QuickPlex SQ120MSDR31QQ-3电化学发光分析仪
PBS 10xThermoFisher70011044
PBS 1xThermoFisher10010023
胰岛素原蛋白AmideBio20160118B3
读板缓冲液BMSDY0800019
SARS-CoV-2 RBD蛋白Creative BiomartSpike-190V
终止液MSDY0090019
Sulfo-TAGMSDR91AO-1
tTG蛋白Diarect AG15201
吐温20SigmaP-1379
U-Plex 6-重检测SECTOR板MSDZ00U0142E6重检测板
U-PLEX连接剂1MSDL0010022
U-PLEX连接剂10MSDL0100020
U-PLEX连接剂2MSDL0020015
U-PLEX连接剂3MSDL0030018
U-PLEX连接剂8MSDL0080018
U-PLEX连接剂9MSDL0090014
ZeBa柱ThermoFisher89892离心柱
ZnT8蛋白Research Laboratoryn/a

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Group, T. S. The Environmental Determinants of Diabetes in the Young (TEDDY) Study. Annals of the New York Academy of Sciences. 1150, 1-13 (2008).
  2. Vehik, K., et al. Increasing incidence of type 1 diabetes in 0- to 17-year-old Colorado youth. Diabetes Care. 30 (3), 503-509 (2007).
  3. Insel, R. A., et al. Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association. Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).
  4. Stahl, M. G., et al. Mass screening for celiac disease: The autoimmunity screening for kids study. The American Journal of Gastroenterology. 116 (1), 180-187 (2021).
  5. Al-Hussaini, A., Sulaiman, N., Al-Zahrani, M., Alenizi, A., El Haj, I. High prevalence of celiac disease among Saudi children with type 1 diabetes: A prospective cross-sectional study. BMC Gastroenterology. 12, 180(2012).
  6. Agardh, D., et al. Clinical features of celiac disease: A prospective birth cohort. Pediatrics. 135 (4), 627-634 (2015).
  7. Jaime, G., Deville, E. S., Ouellette, C. P. COVID-19: Clinical manifestations and diagnosis in children. UpToDate. , Available from: https://www.uptodate.com/contents/covid-19-clinical-manifestations-and-diagnosis-in-children/print (2021).
  8. Barron, E., et al. Associations of type 1 and type 2 diabetes with COVID-19-related mortality in England: a whole-population study. The Lancet Diabetes & Endocrinology. 8 (10), 813-822 (2020).
  9. Miao, D., et al. Electrochemiluminescence assays for insulin and glutamic acid decarboxylase autoantibodies improve prediction of type 1 diabetes risk. Diabetes Technology & Therapeutics. 17 (2), 119-127 (2015).
  10. Jia, X., et al. Prevalence of SARS-CoV-2 antibodies in children and adults with Type 1 diabetes. Diabetes Technology & Therapeutics. 23 (7), 517-521 (2021).
  11. He, L., et al. High-throughput multiplex electrochemiluminescence assay applicable to general population screening for type 1 diabetes and celiac disease. Diabetes Technology & Therapeutics. , (2022).
  12. McQueen, R. B., et al. Cost and cost-effectiveness of large-scale screening for type 1 diabetes in Colorado. Diabetes Care. 43 (7), 1496-1503 (2020).
  13. Insel, R. A., Dunne, J. L., Ziegler, A. G. General population screening for type 1 diabetes: has its time come. Current Opinion in Endocrinology & Diabetes and Obesity. 22 (4), 270-276 (2015).
  14. Ziegler, A. G., et al. 3 Screen ELISA for high-throughput detection of beta cell autoantibodies in capillary blood. Diabetes Technology & Therapeutics. 18 (11), 687-693 (2016).
  15. Cortez, F. J., et al. Sensitive detection of multiple islet autoantibodies in type 1 diabetes using small sample volumes by agglutination-PCR. PLoS One. 15 (11), 0242049(2020).
  16. Steck, A. K., et al. ECL-IAA and ECL-GADA can identify high-risk single autoantibody-positive relatives in the TrialNet pathway to prevention study. Diabetes Technology & Therapeutics. 18 (7), 410-414 (2016).
  17. Yu, L., et al. Proinsulin/Insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity. Diabetes Care. 36 (8), 2266-2270 (2013).
  18. Miao, D., et al. GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes. Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).
  19. Yu, L., et al. Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: Nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay. Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).
  20. Zhao, Z., et al. Higher sensitivity and earlier identification of celiac disease autoimmunity by a nonradioactive assay for transglutaminase autoantibodies. Journal of Immunology Research. 2016, 2904563(2016).
  21. Jia, X., et al. High-affinity ZnT8 autoantibodies by electrochemiluminescence assay improve risk prediction for type 1 diabetes. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (12), 3455-3463 (2021).
  22. He, L., et al. A complete-panel islet autoantibody multiplex ECL assay. Diabetes. 70, Supplement 1 158(2021).
  23. Achenbach, P., et al. Mature high-affinity immune responses to (pro)insulin anticipate the autoimmune cascade that leads to type 1 diabetes. Journal of Clinical Investigation. 114 (4), 589-597 (2004).
  24. Schlosser, M., et al. In insulin-autoantibody-positive children from the general population, antibody affinity identifies those at high and low risk. Diabetologia. 48 (9), 1830-1832 (2005).
  25. Mayr, A., et al. GAD autoantibody affinity and epitope specificity identify distinct immunization profiles in children at risk for type 1 diabetes. Diabetes. 56 (6), 1527-1533 (2007).
  26. Siljander, H., et al. Role of insulin autoantibody affinity as a predictive marker for type 1 diabetes in young children with HLA-conferred disease susceptibility. Diabetes/Metabolism Research and Reviews. 25 (7), 615-622 (2009).
  27. Gu, Y., et al. High-throughput multiplexed autoantibody detection to screen type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases simultaneously. Ebiomedicine. 47, 365-372 (2019).
  28. Jia, X., He, L., Gu, Y., High, H., Yu, L. A high-throughput electrochemiluminescence 7-plex assay simultaneously screening for type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases. Journal of Visualized Experiments. (159), e61160(2020).

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