通过乙二胺四乙酸介导的去黏附实现饲养细胞上人多能干细胞快速、经济、无酶传代

摘要

为避免在饲养细胞上培养的人胚胎干细胞（hESCs）和人诱导性多能干细胞（hiPSCs）在酶法或机械传代过程中存在的局限性，我们建立了一种快速、高效、成本低且得率高的收获方法，该方法利用EDTA介导的去黏附作用，用于收获维持在人包皮成纤维细胞饲养层上生长的hESC或hiPSC克隆。

摘要

人类多能干细胞（人类胚胎干细胞，hESCs，以及人类诱导多能干细胞，hiPSCs）最初在长期培养中需依赖不同类型的饲养细胞以维持其未分化状态。这一方法目前已在很大程度上被无饲养细胞的培养方案所取代，但后者涉及更昂贵的试剂，并可能促进细胞向始发态转变，从而限制其分化潜能。无论在有饲养细胞或无饲养细胞的条件下，对hESC或hiPSC克隆进行收获以传代，都是扩增培养过程中必不可少的操作步骤。

为了提供一种在饲养细胞上培养的人胚胎干细胞（hESC）/人诱导多能干细胞（hiPSC）传代的简便且高效率方法，我们建立了一种利用钙螯合剂乙二胺四乙酸（EDTA）诱导细胞解离的收获方法。我们通过将该方法与传统的机械收获法进行比较，评估了传代后细胞的产量和质量；其中机械收获法是在显微镜下使用手术刀分离克隆（选择机械收获作为对照方法，以避免酶消化收获中试剂批次间的变异性）。

在一组实验中，两种不同的人胚胎干细胞（hESC）系被维持在人包皮成纤维细胞的饲养层细胞上。每种细胞系均通过基于EDTA的消化法或机械法传代多次，并评估其 克隆大小和形态、细胞密度、多能性标志物表达、在拟胚体中向三个胚层的分化能力以及基因组异常情况。在另一组实验中，我们对两种不同的人诱导多能干细胞（hiPSC）系采用基于EDTA的消化法，获得了类似的结果。与机械法相比，EDTA诱导的细胞解离节省了时间，获得的克隆数量更多，且克隆大小更适宜、形态更均一。此外，该方法也比酶消化法更快，且不受酶批次间差异的影响。若后续实验或分析需要，EDTA诱导的解离法还可方便地将hESC/hiPSC细胞系从饲养层依赖的培养体系转移至无饲养层的培养条件。

引言

hESCs 和 hiPSCs 的适当培养与维持 体外 是人类细胞生物学和发育生物学多个研究领域中一种基础且便捷的方法。由于人胚胎干细胞（hESCs）和人诱导多能干细胞（hiPSCs）具有自发分化的内在倾向，维持其未分化状态 体外 需要特别的谨慎和关注。因此，开发成本效益高、方法学变异尽可能小的hESCs和hiPSCs培养与传代方案具有重要的普遍应用价值。

最初，hESCs 和 hiPSCs 被培养在不同类型的饲养细胞上，以协助长期培养并维持其未分化状态^1,2,3。近年来，无饲养层条件下的培养已成为常态，因其完全避免了饲养细胞的使用⁴。然而，一些实验室和核心设施仍继续在饲养细胞上培养 hESCs 或 hiPSCs。无饲养层培养成本较高，因其需要使用特殊成分的培养基，以及对培养表面进行某种形式的包被处理，以确保细胞集落的贴附（主要为细胞外基质 [ECM] 成分、商用 ECM 化合物，或使用市售的预包被培养板）。这一成本不容忽视，可能成为有意开展 hESC 或 hiPSC 相关研究与开发工作的部分实验室面临的经济障碍。此外，无饲养层条件下的培养倾向于使 hESCs 和 hiPSCs 进入比在饲养细胞上维持的状态更不幼稚的状态⁵，这可能影响 后续的分化能力，并导致遗传变异⁶。

传统上，培养在饲养细胞上的hESCs和hiPSCs传代依赖机械收获法——在显微镜下使用解剖刀切割克隆集落⁷ ——但后来该方法大多被酶消化法所取代，后者可结合轻柔刮擦以分离克隆集落或单细胞。机械收获法繁琐且需要精细的显微操作技术。酶消化法的效率可能因酶批次间的差异而波动，且倾向于导致细胞完全解离，从而引发细胞死亡，除非使用ROCK抑制剂加以抵消^8,9，并增加核型异常的发生率⁹。

为了在利用饲养层细胞培养人胚胎干细胞（hESCs）和人诱导多能干细胞（hiPSCs）时兼具成本较低和分化潜能更高的优势，同时避免机械法和酶法收获带来的缺点，我们建立了一种快速、高效、成本低且得率高的收获方法，该方法通过EDTA介导的去黏附作用，用于收获维持在人包皮成纤维细胞饲养层上生长的hESC和hiPSC克隆。我们对该方法的收获得率、变异程度及干细胞质量进行了评估，并与机械法收获的结果进行了比较（未与酶消化法进行比较，因其会引入额外的实验变异性）。我们注意到，若后续实验需要将细胞转移至无饲养层条件，EDTA介导的去黏附法同样适用于将克隆从饲养层依赖型培养体系转移至无饲养层培养体系。该方法实现了传代方式的一致性过渡，因为EDTA诱导的去黏附是目前无饲养层培养体系中广泛采用的一种技术。

方案

有关本实验方案中使用的所有材料、试剂和仪器的详细信息，请参见材料表。

1. 人类成纤维细胞的培养及饲养细胞层的制备

1. 接种 0.5 × 10⁶ 人包皮成纤维细胞（下文简称 "饲养层细胞"每个T-75培养瓶（根据需要确定培养瓶数量）加入20 mL含10%胎牛血清（FBS）的Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM），以下简称 "饲养层细胞培养基"
2. 当饲养细胞达到90%融合度时，移除培养基，并用10 mL杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）每瓶洗涤3次，以避免培养基中的成分抑制胰蛋白酶活性。每瓶加入2 mL胰蛋白酶-EDTA溶液，将培养瓶置于37 °C、5% CO₂培养箱中₂ 在培养箱中孵育5分钟，或直至饲养细胞从培养瓶脱离。在显微镜下观察细胞脱离情况，可见细胞呈悬浮的细胞团或单个细胞。
3. 向每个培养瓶中加入5 mL新鲜预热的饲养细胞培养基以灭活胰蛋白酶-EDTA，并用移液器轻轻吹打悬浮饲养细胞。
4. 将饲养细胞转移至15 mL离心管中。盖紧管盖，于200 × g条件下离心，使饲养细胞沉淀成团。 g 5分钟。
5. 小心移除上清液，避免扰动饲养细胞沉淀。随后，将沉淀轻轻重悬于4 mL新鲜饲养细胞培养基中。在使用细胞计数板或其他细胞计数装置计数前，确保饲养细胞充分重悬。
6. 加入 0.5 × 10⁶ 将饲养细胞按所需数量接种至新的T-75培养瓶中进行扩增，每瓶加入20 mL新鲜饲养细胞培养基。将培养瓶置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育₂ 孵育至饲养细胞达到90%融合度。
   注意：饲养细胞至少可使用至第25代。
7. 根据将用于培养人胚胎干细胞（hESCs）/人诱导多能干细胞（hiPSCs）的35 mm组织培养皿数量，计算所需的饲养细胞数量。
   注意：通常，3.0 × 10⁵ 每培养皿的饲养细胞数量足以形成一层汇合的饲养细胞层。
8. 为防止饲养层细胞增殖，需通过以下两种方法之一确保其有丝分裂被阻断。
   注意：两种方法均可制备大量有丝分裂阻滞的饲养细胞，并分装冻存，以备后续使用。
   1. 通过γ射线照射进行有丝分裂阻滞：将所需全部饲养细胞转移至50 mL离心管中，并加入饲养细胞培养基至总体积5 mL。立即于室温下运送至γ射线照射仪，进行照射以实现饲养细胞的有丝分裂阻滞（300 kV，10 mA，照射20 min）。
      注意：运输过程中的延迟可能导致饲养细胞意外贴附到50 mL离心管管壁上。若运输时间超过几分钟，须在运输过程中持续振荡管子，以确保饲养细胞保持悬浮状态。
   2. 使用丝裂霉素C进行有丝分裂阻滞：将所需全部饲养细胞转移至50 mL离心管中，加入5 mL饲养细胞培养基，然后加入15 mL含20 μg/mL丝裂霉素C的饲养细胞培养基，混匀后于37°C孵育  37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 3 小时。加入 20 mL 37 °C 的 PBS，于 200 × g 孵育5分钟，再用PBS洗涤两次，然后重悬于饲养细胞培养基中。
9. 在饲养细胞经有丝分裂阻断后，返回组织培养超净台，将饲养细胞以 3.0 × 10⁵ 每35 mm组织培养皿接种细胞数如下：确保饲养细胞充分重悬，加入饲养细胞培养基，使饲养细胞浓度达到1.5 × 10⁵ 每毫升加入2 mL该饲养细胞悬液至每个35 mm组织培养皿中。
10. 将培养皿转移至 37 °C、5% CO₂ 培养箱中₂ 培养箱。为确保饲养层细胞均匀分布，将培养皿在培养箱搁架上缓慢而有力地前后移动3次，暂停片刻，再以同样方式左右移动3次。此后不再移动培养皿，并轻柔关闭培养箱门。
11. 24小时后，将培养基从饲养细胞培养基更换为含10%血清替代物（SR）的IMDM培养基，之后每三天更换一次该培养基。饲养细胞在培养的前3天后即可用于实验。

2. hESC 或 hiPSC 克隆的机械收获

1. 预热hESC培养基，其成分为80%达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）、20% SR、1 mM 谷氨酰胺替代物（100倍浓度）、1 mM 非必需氨基酸（NEAA）、1 mM 青霉素/链霉素（P/S）、0.1 mM 2-巯基乙醇，以及10 ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。该hESC培养基用于在饲养细胞上培养hESC或hiPSC。
2. 取含有有丝分裂阻滞饲养细胞的新鲜35 mm组织培养皿，在转移hESC/hiPSC克隆前至少30分钟，将饲养细胞培养基更换为1.2 mL含bFGF的hESC培养基。
3. 将含有hESC/hiPSC克隆、并置于有丝分裂阻滞饲养细胞上的培养皿放入超净台内的显微镜下，使用10倍物镜观察。用无菌手术刀小心地沿每个克隆的边缘切割，然后将每个克隆切成5–6个大致相等的小块。用刀片尖端小心挑起克隆碎片，使其从饲养细胞层上脱离，并在培养基中自由漂浮。
   1. 尽量避免切割到含有分化细胞的区域，这些区域表现为克隆内出现较小细胞形成的岛状结构，其细胞核不如hESC/hiPSC清晰可辨。
4. 用1 mL移液器将自由漂浮的克隆转移至含有饲养细胞的新培养皿中。尽量使各克隆彼此分离，以防后续生长过程中相互融合。小心移动培养皿至细胞培养箱中，并在次日之前避免扰动培养皿。
5. 次日，小心加入600 µL含bFGF的hESC培养基，使终体积达到1.8 mL。此后每天更换含bFGF的hESC培养基，直至下一次传代（通常约1周后）。

3. 使用EDTA介导的去黏附法收获hESC或hiPSC克隆

1. 取含有有丝分裂阻滞饲养细胞的新鲜培养皿，在转移克隆前至少30分钟，将培养基从含10% SR的IMDM更换为1.2 mL预热的hESC + bFGF培养基。
2. 每次操作一个含有hESC或hiPSC克隆的培养皿。吸除hESC + bFGF培养基，用1 mL室温DPBS洗涤克隆，以去除可能存在的未贴壁细胞和细胞碎片。加入1 mL 0.5 mM EDTA，于37 °C孵育1分钟。若超净台配有加热板，为获得更好的解离效果，可在加热板上进行本步骤及第4节中的后续操作。
3. 孵育1分钟后，吸除EDTA溶液，用1 mL移液器小心加入1 mL hESC + bFGF培养基。使用同一移液器轻轻吹打，使克隆从饲养细胞层上脱离。继续小心吹打，直至饲养细胞层松动并卷曲成独立的团块，然后用移液器尖端将饲养细胞层移除。
4. 用新的1 mL移液器将悬浮的hESC/hiPSC克隆转移至含有饲养细胞和hESC + bFGF培养基的新培养皿中，按1:5的比例进行传代。克隆通常会在新培养皿中均匀分布，可通过轻轻左右晃动培养皿促进其分布。此后每天更换hESC + bFGF培养基，直至下一次传代（通常在1周后）。

结果

在下文记录的实验和比较中，我们使用了两个hESC细胞系（H9和HS429，分别来自WiCell和卡罗林斯卡研究所）以及两个hiPSC细胞系（NCS001和NCS002，均由挪威人类多能干细胞核心设施中心建立）。图中和表中所示数据来自hESC细胞系，但hiPSC细胞系获得了完全类似的结果。

在我们的实验中，机械收获法将集落分离成大约5至6个直径约为200–250 µm的团块，而采用EDTA诱导解离并随后进行吹打处理时，每个集落则被分离成约10至20个直径约为60 µm的团块。我们估计，经EDTA收获的每个团块中的细胞数量约为20个。由于使用手术刀难以将集落切割成如此小的团块，因此在这一方面，EDTA诱导解离更具优势，因其产生的团块尺寸更有利于集落细胞的存活^10,11。

使用EDTA收获的hESC/hiPSC集落，在大小和形状上也比机械法收获的集落更均一（图1A-F）。这是因为机械收获所需的切割操作会产生不规则的边缘和大小不一的集落块。为了进行定量评估，我们采用ImageJ-win64方案¹²，在传代后5天测定集落的圆形度（作为衡量集落边缘圆整程度的指标；数值为1表示完美的圆形）。机械法收获的集落圆形度显著较低（机械法收获：0.61 ± 0.10；EDTA法收获：0.84 ± 0.01；n = 10，p < 0.001，Mann-Whitney U检验，U = 10）。

收获后重新接种的克隆中细胞密度反映了收获后细胞间相互作用在克隆形成过程中的情况，EDTA 法收获与机械法收获的细胞密度相似（表 1 和 图 1G、H）。机械法收获的克隆更倾向于在中央区域出现坏死（图 1J）。这可能是由于机械分离所得细胞团块在形状和尤其是大小上存在较大变异性；当这些团块过大时，在转移至新的培养皿过程中容易发生自我折叠。而使用 EDTA 收获的克隆则未出现此现象，其均呈现出透明外观且边缘清晰（图 1I）。

使用基于EDTA的收获方法，我们能够在2-3分钟内几乎收集到孔中形成的所有克隆。而采用机械法收获时，收集孔内全部克隆则繁琐且耗时。通常使用机械法仅能收集约30%（即约20-25个克隆），且耗时约20分钟。同样，采用胶原酶消化后轻柔刮取的方法，通常也难以完全收获所有克隆，尽管整个过程仅需几分钟。因此，基于EDTA的收获方法在速度上等于或快于酶解法，在效率上则高于机械法和酶解法。

为了评估不同传代方法对干性和多能性的影响，我们首先对使用 EDTA 法或机械法传代 20 代后获得的细胞集落进行了干性标志物的 qPCR 分析（图 2）以及免疫细胞化学染色（图 3 和 图 4）。两种方法获得的细胞集落在 mRNA 和蛋白水平上均表现出干性标志物的稳定表达。随后，我们通过拟胚体向三个胚层分化的方法评估了多能性（图 5 和 图 6）。由经两种方法传代 20 代后获得的人胚胎干细胞（hESCs）或人诱导多能干细胞（hiPSCs）所产生的拟胚体中，均包含表达外胚层、中胚层和内胚层常见标志物的多种细胞。

最后，我们采用基于qPCR的遗传分析方法（参见材料表），评估了使用不同传代方法培养的hESCs和hiPSCs中基因组异常的发生情况。无论采用哪种收获方法，在传代20次后获得的细胞集落均表现出某些相对于参考二倍体染色体模式的轻微偏离（所检测的异常是与hiPSC重编程过程常见相关的类型，但也可能在hESCs中出现）（图7）。然而，两种收获方法获得的集落中这些偏离的模式基本相同，表明这些异常与收获方法无关。

图1：基于EDTA或机械法收获后的集落形态与细胞密度。 （A-F）H9人胚胎干细胞（hESC）集落在无饲养层条件下培养20代后第5天的代表性明场图像，分别采用（A-C）基于EDTA法或（D-F）机械法进行传代。 （G，H）H9 hESC集落在20代后采用（G）基于EDTA法或（H）机械法传代后的代表性荧光图像。细胞核经DAPI染色。 （I，J）H9 hESC集落在20代后采用（I）基于EDTA法或（J）机械法传代后的代表性明场图像。注意机械法收获的集落中央出现坏死区域（J中箭头所示）。所有图像均在第20代传代后第5天采集。比例尺 = 100 µm。缩写：hESC = human embryonic stem cell；EDTA = ethylenediaminetetraacetic acid；DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：通过 EDTA 法或机械法收获后，两个 hESC 细胞系（H9 和 HS429）中干性标志物 mRNA 的表达情况。对经一次机械法传代、20 次机械法传代以及 20 次 EDTA 法传代（1:5 稀释）后的 H9（上图）和 HS429（下图）人胚胎干细胞（hESC）进行指定标志物的定量实时聚合酶链式反应检测。表达水平相对于看家基因 ACTB（β-肌动蛋白）进行归一化。误差线表示标准差。缩写：hESC = human embryonic stem cell（人胚胎干细胞）；EDTA = ethylenediaminetetraacetic acid（乙二胺四乙酸）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：不同收获条件下H9人胚胎干细胞系中干性标志物蛋白的表达。 H9人胚胎干细胞集落分别在机械法收获后（A-E）进行传代前、经20次机械法传代后（F-J）以及经20次EDTA法收获后（K-O）的代表性免疫荧光染色结果。比例尺 = 100 µm。缩写：hESC = human embryonic stem cell（人胚胎干细胞）；EDTA = ethylenediaminetetraacetic acid（乙二胺四乙酸）；DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4：不同收获条件下HS429人胚胎干细胞系中干性标志蛋白的表达。 HS429人胚胎干细胞集落在不同传代方式下的代表性免疫荧光染色结果：机械法收获后（A-E），经20次机械法传代后（F-J），以及经20次EDTA法收获传代后（K-O）。比例尺 = 100 µm。缩写：hESC = human embryonic stem cell（人胚胎干细胞）；EDTA = ethylenediaminetetraacetic acid（乙二胺四乙酸）；DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5H9 人胚胎干细胞系经机械法或 EDTA 法收获后所形成类胚体中三胚层标志物的表达 代表性免疫荧光染色标记物用于（A 和 D 外胚层（ECTO，TUJI），（行）B 和 E 内胚层（ENDO，AFP），以及（C 和 F 胚层（MESO，SMA）的细胞排）生成的拟胚体（EBs）A-C) 经过20次机械收获后或 (D-F) 经20次EDTA法传代后。比例尺＝40 µm。缩写：hESC＝人类胚胎干细胞；EDTA＝乙二胺四乙酸；EBs＝拟胚体。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图6：HS429人胚胎干细胞系经机械法或EDTA法收获后形成的拟胚体中三个胚层标记物的表达情况。代表性免疫荧光染色结果显示外胚层（ECTO，TUJI）（A 和 D 行）、内胚层（ENDO，AFP）（B 和 E 行）以及中胚层（MESO，SMA）（C 和 F 行）的标记物表达。拟胚体分别在经过20代机械法收获（A-C）或20代基于EDTA的收获方法（D-F）后生成。比例尺 = 40 µm。缩写：hESC = human embryonic stem cell；EDTA = ethylenediaminetetraacetic acid；EBs = embryoid bodies。 请点击此处查看该图的放大版本。

图7：采用机械法或EDTA消化法收获后，HS9和HS429胚胎干细胞系及NCS002诱导性多能干细胞系经20次传代后的基于qPCR的常见基因组异常遗传分析。 数值2的基线代表所有染色体标记位点的正常二倍体状态。数值1或3分别表示所有细胞中相应染色体标记位点的缺失或增加。介于1与2之间或2与3之间的中间值表明部分细胞中存在相应标记位点的缺失或增加。请注意，在两种收获条件下，异常模式相似。缩写：ESC = embryonic stem cell；EDTA = ethylenediaminetetraacetic acid；iPSC = induced pluripotent stem cell。 请点击此处查看该图的放大版本。

细胞密度（细胞/mm2）
H9	均值	标准差
传代前机械法收获	3918	263.3
机械法收获 20 次	3868	197.7
EDTA 法收获 20 次	4080	127.8
HS429	均值	标准差
传代前机械法收获	5249	565.4
机械法收获 20 次	5247	726.3
EDTA 法收获 20 次	4963	448.8

表1：通过EDTA法或机械法收获后，两个hESC细胞系（H9和HS429）形成的克隆中细胞密度的比较。细胞密度的评估分别在以下条件下进行：机械法传代一次后、机械法连续传代20次后，或EDTA法连续传代20次后（按1:5稀释）。所有情况下，n = 5个克隆。

讨论

我们描述了一种快速且成本效益高的方法，用于收获在饲养细胞上培养的人胚胎干细胞（hESCs）和人诱导多能干细胞（hiPSCs） ，该方法利用EDTA介导的去黏附作用，并主要将其与使用手术刀进行机械收获的传统方法进行了比较。我们还比较了基于EDTA的收获方法与酶法收获在操作速度方面的差异，但未比较所得克隆质量的相关特性。原因是酶法收获本身具有更高的变异性，且已被发现与更高频率的基因组异常相关⁵，这可能会掩盖不同方法之间的实际差异。

我们证明了 基于EDTA的收获方法比其他两种方法更快、更高效，且产生的克隆较小、形态更均一，而机械法收获得到的克隆则形态较大。后一特性对细胞存活有利，因为机械收获产生的较大细胞团块容易发生中心坏死，而酶消化法往往产生单个分离的人胚胎干细胞（hESCs）和人诱导多能干细胞（hiPSCs），这些单细胞更容易发生凋亡，通常需要额外处理（例如使用ROCK抑制剂）才能存活。基于EDTA的收获方法可连续使用至少20代。在克隆细胞密度、干性基因的mRNA和蛋白表达、拟胚体中三胚层分化能力以及基因组异常等方面，基于EDTA的收获方法与机械法收获方法相当。如果目标是提高效率、获得更高产量、减少实验变异并更温和地处理hESCs和hiPSCs，则优先选择基于EDTA的收获方法。

我们还注意到，使用基于EDTA的方法收获培养在饲养细胞上的hESC和hiPSC是一种成本较低的方式，可维持更原始的状态，并在需要时实现从饲养细胞依赖培养向无饲养细胞培养的平稳过渡。

方案中的关键步骤
EDTA介导的去黏附过程中最关键的步骤是方案第3部分（在EDTA溶液中孵育）和第4部分（吹打）。如果暴露于EDTA溶液的时间超过1分钟，组织完全解离为单个细胞的风险会增加。如果吹打时间过长或过于剧烈，也可能出现这种情况。后者受移液器吸头尺寸的影响。如本文所述，使用1 mL细胞培养移液管最为理想。使用吸头直径更小的其他类型移液器则存在风险。

故障排除
如果饲养细胞持续增殖，说明有丝分裂阻断未奏效，必须更换新一批饲养细胞并重新开始操作。如果克隆无法从饲养细胞层上松解，需确保EDTA中不含Ca²⁺，并在加入EDTA前用PBS充分冲洗含有克隆的培养皿，以去除残留的细胞培养基。过度解离会导致产生过多的单个细胞或过小的细胞团，这通常由过度吹打引起，会影响新克隆的形成。吹打程度应通过预实验根据本方案进行经验性确定，以确认 所得细胞团直径约为60 µm。如果饲养层在人类胚胎干细胞（hESCs）/人诱导多能干细胞（hiPSCs）尚未准备好收获前自发从培养皿脱落，可能是由于饲养细胞未在制备后约7天内使用所致。因此，应严格监控饲养细胞的使用时间窗口。如果饲养层在EDTA处理过程中发生解离（本研究中所使用的饲养细胞从未观察到此现象），则必须更换饲养细胞类型或其培养方法。

该技术的局限性
该技术的主要局限在于需要通过肉眼观察去黏附过程，以获得成功的结果。这意味着操作者必须学会识别克隆何时从饲养层细胞脱离，以及饲养层细胞何时从基质上松动。然而，这一过程并不困难，根据我们的经验，新使用者通常在几次尝试后即可掌握该技术。

收获的 hESCs 或 hiPSCs 也可能存在被少量饲养细胞污染的固有风险。如果计划转移至无饲养层条件，或需要分离 hESCs 或 hiPSCs 用于检测，则此类污染将影响 纯度。需要注意的是，本实验所使用的饲养细胞（人包皮成纤维细胞）即使经过酶消化处理也极难解离（未展示数据）。由于未解离的饲养细胞层会被整体移除，in toto， 因此收获的 hESCs 或 hiPSCs 被污染的可能性极低。此外，由于饲养细胞已处于有丝分裂阻滞状态，任何残留的污染都会随着 hESCs 或 hiPSCs 的进一步传代而最终减少至无。

相对于现有方法的意义
目前培养人胚胎干细胞（hESCs）和人诱导多能干细胞（hiPSCs）的常规方法是在无饲养层条件下进行，而EDTA在传代过程中被广泛使用。无饲养层培养依赖于特殊配制的培养基和培养基质以确保细胞贴壁，这些试剂会带来额外费用，可能超出部分实验室的预算。此外，由于无饲养层培养基中缺乏某些特定因子，细胞容易从初始态向始发态转变，导致分化潜能发生改变。在有丝分裂阻滞的饲养层细胞上培养可避免这种状态转变，并将整体成本降低至可接受水平，从而促进多能干细胞在实验室研究中的更广泛应用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 M EDTA pH 8.0	Invitrogen	15575020
15 mL 离心管	Sarstedt	62.554.502
2-巯基乙醇	Gibco	31350-010
50 mL 离心管	Sarstedt	62.547.254
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）	PeproTech	AF-100-18B-250UG
Brand Bürker 计数板	Fisher Scientific	10628431
一次性手术刀片 15 号	Susann-Morton	505
不含 Ca/Mg 的 DPBS (1x)	Gibco	14190-094
Easy Grip 组织培养皿，35 × 10 mm	Falcon	353001
Eppendorf 移液器 1 mL	Eppendorf
Eppendorf 移液器 200 μL	Eppendorf
FBS（胎牛血清）	Gibco	10270-106
滤芯吸头 1,000 μL	Sarstedt	70.1186.210
滤芯吸头 200 μL	Sarstedt	70.760.211
Gamma Cell 3000 ELAN 照射仪（或使用丝裂霉素 C 抑制细胞增殖）	Best Theratronics	BT/MTS 8007 GC3000E
Glutamax 100x	Gibco	35050-038
生长因子减少型基质胶（Matrixgel）	Corning	734-0269
H9 人胚胎干细胞系	WiCell	WAe009-A
hPSC 遗传分析试剂盒	Stem Cell Technologies	#07550
HS429 人胚胎干细胞系	ECACC	KIe024-A
人包皮成纤维细胞 - CRL2429 细胞系	ATTC	CRL2429
IMDM (1x)	Gibco	21980-032
iPSC 细胞系	挪威人多能干细胞核心设施	NCS001 & NCS002
Knockout DMEM	Gibco	10829-018
激光共聚焦显微镜或同等设备（我们使用 Zeiss 的 LSM 700）	Zeiss
显微镜	CETI
丝裂霉素 C	Sigma Aldrich	M4287
非必需氨基酸（NEAA）	Gibco	11140.035
塑料移液管 10 mL	Sarstedt	86.1254.001
塑料移液管 5 mL	Sarstedt	86.1253.001
血清替代物（SR）	Gibco	10828-028
0.22 µm 无菌滤器	Sarstedt	83.1826.102
T-75 培养瓶	ThermoScientific	156499
台盼蓝染液（0.4 %）	Gibco	15250-061
胰蛋白酶-EDTA，500 mL	Gibco	25300062