将反射式共聚焦显微镜与光学相干断层扫描相结合，通过图像采集进行皮肤癌的无创诊断

摘要

在这里，我们描述了使用反射共聚焦显微镜（RCM）和RCM和光学相干断层扫描（OCT）组合的新型无创成像设备获取高质量图像的协议。我们还让临床医生熟悉他们的临床应用，以便他们可以将这些技术整合到常规的临床工作流程中，以改善患者护理。

摘要

皮肤癌是全球最常见的癌症之一。诊断依赖于肉眼检查和皮肤镜检查，然后进行活检以确认组织病理学。虽然皮肤镜检查的敏感性很高，但较低的特异性导致 70%-80% 的活检在组织病理学上被诊断为良性病变（皮肤镜检查呈假阳性）。

反射共聚焦显微镜（RCM）和光学相干断层扫描（OCT）成像可以无创地指导皮肤癌的诊断。RCM 可视化 面层 中的细胞形态。与皮肤镜检查相比，它使黑色素瘤和色素性角质形成细胞性皮肤癌的诊断特异性提高了一倍，使良性病变的活检数量减少了一半。RCM在美国获得了计费代码，现在正在整合到诊所中。

然而，成像深度浅 （~200 μm）、非色素性皮肤病变对比度差以及面 层 成像等局限性导致检测非色素基底细胞癌 （BCC） 的特异性相对较低，即与基底细胞层相邻的浅表基底细胞癌和更深的浸润性基底细胞癌。相比之下，OCT缺乏细胞分辨率，但在垂直平面上对组织进行成像，深度为~1毫米，这允许检测基底细胞癌的浅表和深层亚型。因此，这两种技术本质上是互补的。

"多模态"组合RCM-OCT设备同时以 面部 和垂直模式对皮肤病变进行成像。它有助于基底细胞癌的诊断和管理（浅表基底细胞癌的非手术治疗与深层病变的手术治疗）。与单独使用 RCM 相比，检测小的、无色素的基底细胞癌的特异性显著提高。RCM和RCM-OCT设备正在为皮肤癌的诊断和管理带来重大的范式转变;然而，它们的使用目前仅限于学术三级护理中心和一些私人诊所。本文使临床医生熟悉这些设备及其应用，解决常规临床工作流程中的转化障碍。

引言

传统上，皮肤癌的诊断依赖于对病变的目视检查，然后使用称为皮肤镜的放大镜仔细观察可疑病变。皮肤镜提供地下信息，与用于诊断皮肤癌的目视检查相比，该信息提高了灵敏度和特异性^1，2。然而，皮肤镜检查缺乏细胞细节，通常需要活检以确认组织病理学。皮肤镜^{检查 3} 的特异性低且可变（67%-97%），导致假阳性和活检，结果显示病理学上的良性病变。活检不仅是一种导致出血和疼痛的侵入性手术⁴ ，而且由于疤痕而在美容敏感区域（例如面部）也是非常不希望的。

为了通过克服现有的局限性来改善患者护理，正在探索许多非侵入性体内成像设备⁵，⁶，⁷，⁸，⁹，¹⁰，^11，12，13，14，¹⁵，^16，17，18.RCM和OCT设备是用于诊断皮肤病变，尤其是皮肤癌的两种主要的光学非侵入性设备。RCM已在美国获得当前程序术语（CPT）计费代码，并越来越多地用于学术三级护理中心和一些私人诊所⁷，^8，19。RCM 以近组织学（细胞）分辨率对病变进行成像。然而，图像位于面部平面（一次一层皮肤的可视化）中，成像深度限制在~200μm，足以仅到达浅表（状）真皮。RCM成像依赖于皮肤中各种结构的反射对比度。黑色素具有最高的对比度，使色素病变明亮且易于诊断。因此，与色素性病变（包括黑色素瘤）的皮肤镜检查相比，RCM 联合皮肤镜检查显著改善了诊断（敏感性为 90%，特异性为 82%）²⁰。然而，由于粉红色病变中缺乏黑色素对比，尤其是对于基底细胞癌，RCM的特异性较低（37.5%-75.5%）²¹。传统的OCT设备是另一种常用的无创设备，可对皮肤内深度达1毫米的病变进行成像，并在垂直平面上可视化（类似于组织病理学）⁹。然而，OCT缺乏细胞分辨率。OCT 主要用于诊断角质形成细胞病变，尤其是基底细胞癌，但特异性仍然较低⁹。

因此，为了克服这些器件的现有局限性，已经构建了多模态RCM-OCT器件²²。该设备将RCM和OCT集成到单个手持式成像探头中，可以同时采集病变的共配准面部RCM图像和垂直OCT图像。OCT提供病变的结构细节，并且可以在皮肤内更深（深度可达~1毫米）成像。与手持式RCM设备（~0.75 mm x 0.75 mm）相比，它还具有~2 mm²²的更大视场（FOV）。RCM图像用于提供OCT上识别的病变的细胞细节。该原型尚未商业化，正在诊所23^，24，25中用作研究设备。

尽管它们在改善皮肤癌的诊断和管理方面取得了成功（如文献所支持的那样），但这些设备尚未在临床中广泛使用。这主要是由于缺乏能够读取这些图像的专家，但也是由于缺乏训练有素的技术人员，他们可以在床边有效地（在临床时间范围内）获得诊断质量的图像⁸。在本手稿中，目标是促进这些设备在诊所的意识和最终采用。为了实现这一目标，我们让皮肤科医生、皮肤病理学家和莫氏外科医生熟悉使用 RCM 和 RCM-OCT 设备获取的正常皮肤癌和皮肤癌的图像。我们还将详细介绍每种设备在皮肤癌诊断中的效用。最重要的是，本手稿的重点是为使用这些设备采集图像提供分步指导，这将确保临床使用的高质量图像。

方案

下面描述的所有协议都遵循机构人类研究伦理委员会的指导方针。

1. RCM设备及成像协议

注意:有两种市售的 体内 RCM设备:宽探针RCM（WP-RCM）和手持式RCM（HH-RCM）。WP-RCM集成了数字皮肤镜。这两种设备可单独使用或作为组合单元提供。以下是使用最新一代（第 4 代）WP-RCM 和 HH-RCM 设备的图像采集协议及其临床适应症。

1. 病变选择和临床适应证
   1. 寻找以下类型的病变:皮肤镜下模棱两可的粉红色（基底细胞癌，鳞状细胞癌[SCC]，光化性角化病[AK]，其他良性病变）或色素性病变（痣和黑色素瘤，色素性角质形成细胞病变）;最近在临床或皮肤镜检查中发生变化的痣;炎症病变以确定炎症模式。
   2. 对恶性雀斑病 （LM） 边缘进行定位以确定病变范围，并绘制和选择具有亚临床扩展的疾病（例如乳外佩吉特病 （EMPD） 和 LM）的活检部位。
   3. 对局部药物（咪喹莫特）、放疗、光动力治疗和激光消融等非手术治疗进行无创监测。
2. 对于设备选择，对于位于相对平坦的皮肤表面（躯干和四肢）上的病变，使用 HH-RCM 设备处理曲面（鼻子、耳垂、眼睑和生殖器）上的病变。
   注意:成像设备的选择主要取决于病变的位置。
3. 对于成像，将患者放在完全倾斜的椅子或带有枕头或扶手支撑的平坦检查台上，并获得平坦的成像表面。
   注意:老一代（第 3 代）WP-RCM 设备每个病变需要 ~30 分钟。使用目前正在诊所使用的新一代（第 4 代）WP-RCM 设备，单个病变成像可能需要 ~15 分钟。尽管采集时间有所改善，但舒适地定位患者将确保最小的运动伪影，并有助于采集高质量的图像。以下步骤可能有助于正确定位患者:
4. 为准备影像学检查，请用酒精湿巾清洁病变和周围皮肤，以消除任何污垢、化妆水或化妆品。在连接组织窗口之前，请剃除毛茸茸的皮肤表面，以避免气泡阻碍组织微观结构的可视化。
   注意:要去除大量化妆品或防晒霜，请在用酒精清洁之前用温和的肥皂和水清洁场地。
5. 使用 WP-RCM 设备（图1, 图2, 补充图S1, 补充图S2和 补充图S3)
   注意:WP-RCM 设备能够捕获堆栈、马赛克、实时单帧视频和单帧图像。
   1. 要将一次性塑料窗帽连接到病变处（图1），请将探头垂直于病变放置以获得最佳图像。有关附件的示例，请参阅图 1A-F。在塑料窗口的中心添加一滴矿物油，小心地将其铺在窗口宽度上（图1A）。从塑料窗口的粘合剂侧取下纸背。轻轻拉伸皮肤以避免起皱并安装窗户。
      注意:使用安全且粘度高的食品级矿物油。确保病变居中并完全覆盖。对于大于 8 mm x 8 mm 的病变，可根据皮肤镜检查对关注区域进行成像，或进行单独的影像学检查以覆盖整个病变。
   2. 获取皮肤镜图像（图1C，D）
      注意:获取皮肤镜图像以作为在病变内导航的指南。应使用以下步骤来确保皮肤镜检查图像和共聚焦图像之间的完美配准。
      1. 将WP-RCM探头悬停在塑料窗盖上，并接近探头的最佳插入角度（图1C）。找到位于探头侧面的白色小箭头（图1C），并将其与皮肤镜相机侧面的箭头对齐（图1C）。
      2. 将皮肤镜相机插入塑料窗盖（图1D）。按下相机上的扳机键以获取图像。取下皮肤镜。在开始成像之前，请确保皮肤镜图像覆盖整个病变表面。
   3. 要将RCM探头连接到塑料一次性盖（图1E，F），请将豌豆大小的超声凝胶放入一次性塑料窗盖内（图1E）。将探头插入盖子内，直到听到尖锐的咔嗒声（图1F）。
      注意:为获得最佳图像，请将探头垂直（以 90° 角）插入塑料窗口。可以提高检查椅的高度，以实现更平坦的表面，减少运动伪影，排出气泡（图3 和 图4），并确保牢固地附着在皮肤上。
   4. 采集RCM图像（图2、补充图S1和补充图S2）
      1. 使用皮肤镜图像（步骤5.2）指导RCM图像采集（补充图S1）。选择病变的中心并确定皮肤的最顶层（最亮）——角质层的无核层（补充图S1）。
      2. 在此级别将 成像深度 设置为 零 （补充图S1）。
         注意:此深度可作为确定病变内后续层的实际z深度的参考点。
      3. 通过按堆栈图标获取病变中心的堆栈（图2和补充图S1）。从下拉菜单中选择一个解剖部位:面部或身体。设置 4.5 μm 步长和 250 μm 深度。
         注意:从角质层开始堆叠，到真皮中最深的可见层结束。 补充图 S1 显示了如何获取堆栈的示例，而 图 2 给出了堆栈的示例。
      4. 获取马赛克:在真皮-表皮交界处（DEJ）取第一个马赛克（补充图S2）。识别采集的堆栈中的DEJ层，然后使用鼠标选择一个8 mm x 8 mm的正方形来覆盖整个病变。按马赛克图标完成操作（补充图S2）。在不同深度获取至少 5 个马赛克:角质层、棘层、基底上层、DEJ 和浅表真状。
      5. 打开 DEJ 马赛克以指导后续马赛克的获取。单击 DEJ 马赛克上的任何结构，以在实时取景成像中调出该区域。向下滚动以获取真皮处的马赛克，然后向上滚动（从 DEJ）获取表皮中的马赛克。
      6. 让床边的专家RCM阅读器评估采集的马赛克，以确定感兴趣的区域并取堆。在床边没有专家的情况下，捕获5个堆栈:每个象限一个，一个在病变中心，皮肤镜检查上具有均匀的模式（步骤1.5.2）。对于异质性病变，应获取额外的堆栈以覆盖所有皮肤镜特征。
         注意:"堆栈"（图2）是从表皮的最顶层到表层真皮（~200μm）深度采集的高分辨率，单帧，小视场（FOV）图像（0.5mm x 0.5 mm）的连续集合。"马赛克"（补充图S2）是通过在"X-Y"（水平 面 平面）中将单个500μm x 500μm图像拼接在一起而获得的图像的大FOV。
   5. 完成映像会话
      1. 单击 完成成像。
      2. 将显微镜从塑料窗口上拆下。轻轻拉紧患者的皮肤并处理掉塑料窗。用酒精棉签擦去皮肤上的油脂。
      3. 拆下显微镜镜头周围的保护锥。用酒精棉签清洁物镜尖端以去除超声凝胶。用纸巾擦干物镜。将塑料锥体重新连接到显微镜探头上。
         注意:可以读取图像，并且可以由训练有素的医生在床边生成和签名报告。在没有专家阅读器的情况下，可以通过云传输图像或通过实时远程共聚焦会话²⁶来咨询远程专家。
   6. 生成 共聚焦诊断评估 报告（补充图S3）
      1. 单击" 新建评估"。从下拉菜单中的预选选项中输入诊断。
      2. 如果需要另一个映像会话，请选择 不足且需要重新捕获的图像。如果需要描述性诊断，请选择" 其他" 并在表单末尾的自由文本框中进行描述。输入计费⁷ 的 CPT 代码（补充图 S3A）。从报告清单中选择成像过程中看到的适用特征（补充图S3B）。从清单中选择适用的管理。
         注意:没有计费代码适用于 HH-RCM 映像。
      3. 单击 完成并签名。将报告生成为 PDF 并打印。获取由医生签名的报告，并将其添加到患者的图表中以进行计费。
6. 使用 HH-RCM 设备采集图像（图 5）
   注意:HH-RCM 设备能够捕获堆栈、实时单帧视频和单帧图像。
   1. 用纸环包围医生确定的病变。使用第 3 节中详述的步骤。用于定位患者和清洁病变部位。
      注意:根据病灶大小选择纸环的尺寸（5-15毫米），以定义病灶的边界并确保在病灶内进行成像。如果没有纸环，请使用纸带确定病变。
   2. 取下覆盖显微镜镜头的塑料盖。将豌豆大小的超声凝胶涂在HH-RCM的物镜上，并用塑料盖盖住（补充图S3A）。在塑料盖的侧面添加大量矿物油，该塑料盖将接触皮肤。
      注意:如果需要，请增加非常干燥的皮肤的油量。
   3. 用力按压将探针按压到皮肤上的病变部位。使用 HH-RCM 设备上的 z 深度控件在病变内的不同深度上下移动（补充图 S3B）。在感兴趣区域中获取多个单帧图像和堆栈。按照步骤 1.5.4.3 中所述获取堆栈。
   4. 对于无法连接WP-RCM设备的大病变，通过将HH-RCM探头在整个病变表面上移动，在各个层拍摄连续视频。单击 视频捕获符号 以执行此操作。如果需要，记录血管内血细胞的运动。
      注意:这些视频可以在以后使用软件进行拼接，以提供类似于马赛克的大型FOV图像。
   5. 成像会话完成后按 完成成像 。用酒精棉签清洁病变以去除油。用酒精湿巾清洁超声凝胶并重新安装塑料盖，从探头的物镜上取下超声凝胶。
      注意:与可由技术人员操作的WP-RCM设备不同，HH-RCM应由RCM阅读器操作，该阅读器可以实时解释图像以在病变内导航并得出正确的诊断。

2. RCM-OCT组合器件和成像协议

注:RCM-OCT 设备只有一个原型。该设备具有手持式探头，可用于所有身体表面，类似于HH-RCM设备。它获取RCM堆栈（类似于RCM设备）和OCT栅格（连续横截面图像的视频²²）。RCM 和 OCT 图像均为灰度。RCM 图像的 FOV 为 ~200 μm x 200 μm，而 OCT 图像的 FOV 为 2 mm（宽度）x 1 mm（深度）。以下是使用RCM-OCT设备的图像采集方案及其临床适应症。图 6 显示了 RCM-OCT 器件的图像，而 图 7 显示了 RCM-OCT 器件的软件系统。

1. 病变选择
   1. 寻找皮肤镜下模棱两可的粉红色或色素性病变，以排除基底细胞癌。
   2. 评估基底细胞癌的深度以进行管理，并评估处理后的残留基底细胞癌。
2. 定位患者进行影像学检查:使用 RCM-OCT 设备对单个病变进行成像可能需要长达 20 分钟的时间。该装置也是类似于HH-RCM装置的手持式探头，因此可以在病变处自由移动。有关患者定位的详细信息，请参阅第 1.4 节。以上。
3. 准备成像部位:使用此探头时，请确保病变边界没有过多的毛发和局部杂质，并且清晰界定。请参阅步骤 1.4.1。以上了解更多详情。
4. 使用 RCM-OCT 器件采集图像（图 6 和 图 7）
   1. 准备探头，类似于用于 HH-RCM 的探头（步骤 1.6.1-1.6.2）。
   2. 在线 成像 模式和 光栅 模式下获取图像。
      1. 单击 成像设置 （图7A）。选择 线成像 模式以获取RCM图像（蜂窝分辨率）（图7B）。将步 长 设置为 5μm ， 将步数 设置为 40 （图7A）。
      2. 点击 抓取。按照步骤 1.5.4.3 获取堆栈。完成后，单击 冻结 按钮。
      3. 单击 成像设置。选择 光栅模式 以获取病变结构的相关OCT视频（图7B）。切换到 技术人员 选项卡（图 7C）。完成后，单击 抓取 按钮（图 7A），然后立即按 保存 按钮。
      4. 根据医生的兴趣获取多个堆栈和视频。
      5. 按照步骤1.6.5所述清洁病灶和机器。

结果

反射式共聚焦显微镜 （RCM）
RCM上的图像解释:
RCM图像的解释方式模仿组织病理学载玻片的评估。首先评估马赛克以获得整体建筑细节并确定关注区域，类似于在扫描放大率（2x）上评估组织学部分。然后放大马赛克以评估细胞细节，类似于在高放大倍率（20x）下评估幻灯片。 图 8 显示了图像分析的这种模式。

图像质量:
在皮肤相关深度获得的没有任何明显伪影的高质量图像对于正确诊断至关重要。 图4A显示了一张这样的图像。无法解释图像的主要原因与伪影或获取图像的经验不足有关。 图3 和 图4B 显示了带有气泡、表面碎屑和运动伪影等伪影的图像，这些伪影阻碍了诊断评估。除了掌握图像采集的技术方面外，RCM操作员还应熟悉各种皮肤层的形态，以便在...

讨论

在本文中，我们描述了使用 体内 RCM和RCM-OCT设备进行图像采集的协议。目前，有两种商用RCM设备:宽探头或臂装RCM（WP-RCM）设备和手持式RCM（HH-RCM）设备。了解何时在临床环境中使用这些设备至关重要。癌症类型和位置是决定设备选择的主要因素。

WP-RCM设备非常适合平坦和轻微起伏的身体表面的病变，例如躯干和四肢，因为它需要与皮肤接触。由于探头很宽，因此不能连接到身体的狭窄区域或角落。然而，HH-RCM是一种更灵活的设备，并且具有更窄的探头。因此，该设备经常用于对身体弯曲和相对起伏的区域（包括鼻子、眼睑、耳垂和生殖器）上的病变进行成像，其中 WP-RCM 无法连接。

这两种设备都可以采集单帧、蜂窝分辨率的图像、堆栈和视频，并可用于对所有皮肤癌进行成像。然而，WP-RCM设备可以通过采集马赛克来可视化测量高达~8 mm x 8 mm的整个病变。马赛克提供了病变结构细节的概述（例如对称性和边界）。WP-RCM设备还配备了数字皮肤镜相机，用于获取病变的皮肤镜图像，在整个成像过程中指导RCM图像采...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Crystal Plus 500FG 矿物油	STE Oil Company， Inc.		一种食品级高粘度矿物油，用于我们的各种设备进行< em> 成像。
RCM-OCT	物理科学公司	-	一个 "多模态"组合 RCM-OCT 设备同时对水平和垂直模式的皮肤病变进行成像。
Vivascope 1500	机芯内径	-	一种宽探针 RCM （WP-RCM） 装置，可连接到皮肤上 体内 装置。
Vivascope 3000	机芯内径	-	一种手持式 RCM （HH-RCM） 设备，可在皮肤上移动以捕获 in vivo 图像。