标签保留扩展显微镜 （LR-ExM） 可实现超分辨率成像和高效标记

扩展显微镜（ExM）自首次作为传统显微镜（如落射荧光和共聚焦显微镜1，²，³，⁴，^5，6，⁷）实现超分辨率成像的便捷方法而引入以来，就已被研究人员使用.使用ExM，即使使用常规共聚焦显微镜也可以实现~70 nm的横向分辨率。当ExM与超分辨率成像相结合时，分辨率会进一步提高。例如，使用结构照明显微镜 （SIM） 可以实现大约 30 nm 的分辨率，使用随机光学重建显微镜 （STORM） 可以实现大约 4 nm 的分辨率^1，5。

然而，低标记效率是标准ExM方法的一个关键问题。荧光损失可能因荧光基团的类型和消化时间而异。然而，据报道，平均而言，在ExM的聚合和蛋白质消化步骤之后，超过50%的荧光团丢失，这对^{成像质量不利}3^，4。

因此，已经开发了标签保留扩展显微镜（LR-ExM），它可以有效地保留标签并减少信号损失¹。LR-ExM的关键创新是使用一组三功能锚，而不是仅仅使用荧光染料 - 如标准ExM程序 - 用于对感兴趣的蛋白质进行染色。这些三官能团接头由三部分组成:（1）连接到抗体的连接器（例如，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）），（2）锚定（例如，甲基丙烯酰胺（MA））将蛋白质锚定到聚合物上，以及（3）报告基因（例如，生物素或地高辛（DIG））与有机染料偶联。三官能团锚在聚合和蛋白质消化步骤中存活，因此可防止荧光团损失。

此外，该方法具有巨大的潜力，因为它与自标记的酶标签（如SNAP或CLIP）兼容。与免疫染色方法相比，酶标签方法在高特异性和标记效率方面具有一些优势⁸，^9，10。

在本手稿中，演示了LR-ExM的详细程序。LR-ExM是一种高效且灵活的方法，可实现高空间分辨率和增强的标记效率。

1. 细胞培养

1. 使用在McCoy的5A培养基中培养的U2OS细胞，该培养基在37°C的5%CO₂中补充有10%FBS。
2. 将细胞培养到16孔可拆卸的腔室盖玻片（培养区域0.4cm²）上，以便于处理。

2. 固定和透化

注意:固定和透化条件取决于优化的免疫染色方案。以下是共免疫染色微管和网格蛋白包被坑 （CCP） 的固定和透化方案。

1. 一旦细胞计数达到~0.04 x 10 6，在室温下将细胞与100μL的3.2%多聚甲醛（PFA）固定在PEM缓冲液（100mM PIPES，1mM EGTA和1mM MgCl₂，pH^6.9）中10分钟（表1）。
   注意:使用PFA的固定是在经过认证的安全罩中进行的。
2. 用 200 μL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。
3. 用100μL透化缓冲液在室温下透化细胞15分钟（表1）。
   注意:尽快进行标记，以避免靶蛋白，RNA或DNA降解，并获得最佳结果。但是，如果需要，固定样品可以在4°C的PBS缓冲液中长时间储存（长达一个月）。 更换任何蒸发的PBS并保护样品免受光漂白。

3. 内源性链霉亲和素和生物素阻断

1. 将细胞与在细胞封闭缓冲液（100μL）中稀释的链霉亲和素溶液在室温下孵育15分钟（表1）。
2. 用 200 μL 细胞封闭缓冲液短暂冲洗。
3. 将细胞与在细胞封闭缓冲液中稀释的 100 μL 生物素溶液在室温下孵育 15 分钟。
   注意:使用自标记标记方法（例如使用 SNAP 或 CLIP- 标记）时，请跳过步骤 4，然后继续执行步骤 5.1:自标记标记方法。

4. 一抗染色

1. 用大鼠抗α-微管蛋白抗体（1:500稀释）和兔抗网格蛋白重链抗体（1:100稀释）在100μL细胞封闭缓冲液中孵育细胞在4°C下孵育16小时或在室温下孵育1小时。将组织样品的孵育时间加倍。
2. 用 200 μL PBS 洗涤样品四次，每次 5 分钟。

5. LR-ExM特异性二抗染色

1. 与三官能团接头（如N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）-甲基丙烯酰胺（MA）-生物素或NHS-MA-地高辛（Dig））的偶联IgG抗体（图1B）。三官能锚的合成和二抗的偶联先前在Shi等人1中^介绍过。自标记标记方法:将IgG抗体与三功能接头偶联，例如MA-苄基鸟嘌呤（BG）-生物素或MA-苄基胞嘧啶（BC）-Dig（图1B）。三官能锚的合成和二抗的偶联先前在Shi等人1中介绍^过。
2. 将细胞与驴抗兔-Dig-MA（1:100稀释）和驴抗大鼠生物素-MA（1:100稀释）二抗在100μL细胞封闭缓冲液中孵育1小时。组织样品的孵育时间加倍。
3. 在 200 μL PBS 中洗涤样品四次，每次 5 分钟。

6. 附加锚定

1. 在室温下将细胞与0.25%戊二醛（GA）在PBS（100μL）中孵育15分钟，以使蛋白质锚定在水凝胶上。或者，使用25 mM甲基丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（MA-NHS）进行锚定。鼓励在室温下孵育一小时。
2. 在PBS中洗涤样品三次，每次5分钟。

7. 凝胶化

注意:膨胀速度由盐和水流出或进入凝胶的扩散时间决定;因此，浇注薄凝胶可加快扩增时间。

1. 去除16孔凝胶板的上部结构。向每个孔中加入 40 μL 单体溶液以调理冰上的细胞。在冰上孵育5分钟。
   1. 要制备单体溶液，请参见 表2。
2. 在冰上制备凝胶溶液。在单体溶液中加入双蒸水和10%N，N，N′，N′四甲基乙二胺（TEMED）促进剂（10%TEMED:单体溶液= 1:47）;不要添加启动器（表 3）。
3. 对于面积为 0.4 cm² 的细胞培养室，使用约 40 μL 的凝胶溶液体积。 为每个孔准备 45 μL 凝胶溶液。
4. 向凝胶溶液中加入 10% 过硫酸铵 （APS），在冰上孵育，并立即将 40 μL 凝胶溶液移液到冰上每个硅胶垫圈孔中。在冰上孵育3分钟（10%APS:10%TEMED:单体溶液= 1:1:47）。
5. 保护样品免受光照，并将10cm培养皿中的盖玻片移至37°C培养箱中1.5小时以进行凝胶化。为了在37°C孵育期间保持凝胶的湿度，用盖子盖住培养皿，并在培养皿中滴几滴水。

8. 消化

1. 凝胶化后，取出玻璃以分离凝胶并将凝胶转移到6孔板中。用2mL消化缓冲液（表1）在室温下或37°C下消化4小时。 使用至少 10 倍多余体积的消化缓冲液。
2. 用比最终凝胶体积多10倍的水洗涤凝胶。重复洗涤步骤四次，每次20至30分钟。凝胶在每个维度上膨胀约两倍。
   注意:凝胶样品可在4°C的PBS缓冲液中储存长达1个月。 更换任何蒸发的水以避免干燥，并在储存过程中保护样品避光。为避免三官能锚降解，样品应在消化和洗涤后尽快染色。

9. 消化后荧光染色

1. 将凝胶在 2 mL 体积的链霉亲和素 （STV）/地高辛 （DIG） 染色缓冲液中与 2 至 5 μM STV 染料和/或抗 DIG 染料在室温下孵育 24 小时。将样品放在黑暗中。

10. 扩展

1. 用过量的水（2-3mL）洗涤并展开凝胶四次，每次30分钟至1小时。
2. 为了在荧光显微镜下更容易地观察细胞，在五次洗涤中的第三次洗涤期间用DAPI对细胞进行染色。在洗涤水中以 1:5，000 稀释液稀释 DAPI 原液浓度（5 mg/mL，储存在 4 °C）。将凝胶与DAPI水溶液（2mL）孵育30分钟至1小时。
3. 用 3 mL 水再清洗两次。
4. 在任何足够大的扁平培养皿中扩增凝胶以容纳样品。在0.4cm² 面积盖玻片上制备的膨胀凝胶非常适合玻璃底部6孔板。
   注意:膨胀后染色的样品可以在4°C的PBS缓冲液中储存长达4个月，加入足够的水以避免干燥并保护样品免受光漂白。成像前重复扩增和DAPI染色步骤。为避免荧光基团降解的风险，需要尽快对样品进行成像。

11. 成像

1. 用 0.01% 聚-L-赖氨酸（每个 3 mL）涂覆 6 孔玻璃底部成像室以固定凝胶样品。
2. 将凝胶样品转移到包被的成像室中。
3. 使用任何所需的荧光范围对样品进行成像。

使用三功能锚对Clathrin包被的凹坑（CCP）进行免疫染色（图1B），并如图1A所述进行LR-ExM。与蛋白质保留扩展显微镜（proExM，图2A）或生物素-ExM（图2B）相比，LR-ExM（图2C，E）显示出更高的荧光强度;LR-ExM的信号比proExM高约六倍（图2D）。LR-ExM可以有效地捕获CCP等小结构，其甚至小于衍射极限（图2F，G）。

通过使用免疫染色方法展示了LR-ExM的一些代表性结果。微管和CCP使用三功能锚进行共免疫染色，包括NHS-MA-DIG和NHS-MA-生物素（图3A，B）。LR-ExM可用于基于酶标签的方法。使用图3C-F中的三功能锚点BG-MA-biotin（用于SNAP-tag）和BC-MA-DIG（用于CLIP-tag）证明了结果。此外，可以在LR-ExM中结合免疫染色和蛋白质标签方法，如图3G-J所示。从这些结果中可以证实，LR-ExM有利于获得具有增强标记效率和分辨率的高质量图像。

LR-ExM在组织样品中也表现出色。LR-ExM通过对突触前标记巴松管和突触后标记Homer1进行共免疫染色，对小鼠脑组织进行。两个标签清晰且分离良好，支持高分辨率和标记效率（图 4A-E）。

图 1:标签保留扩展显微镜 （LR-ExM） 的工作流程。 （a） LR-ExM的工作流程。（二）三功能锚的原理图。这个数字是从Shi等人1修改而来的。请点击此处查看此图的大图。

图 2:对网格蛋白重链 （POI） 进行间接免疫染色的 U2OS 细胞中网格蛋白包被凹坑 （CCP） 的信号保留 （A-C） 扩展显微镜 （ExM） 共聚焦图像的定量。（A）使用AF488偶联二抗的蛋白质保留ExM（ProExM）。（B）使用生物素偶联抗体进行扩增后标记的ExM。（C）使用与NHS-MA-生物素三功能锚偶联的抗体的LR-ExM。B和C中的样品用链霉亲和素-AF488进行扩增后染色。（D） A-C的强度量化。误差线表示 SD.n = 3 对于每种情况。A、B、C 和 E-G 中图像的长度扩展比分别为 4.3、4.5、4.6 和 4.3。图D中使用的样品的长度膨胀比为4.5±0.2。比例尺，500 nm（A-C 和 E）和 100 nm（F 和 G）。所有比例尺均采用预膨胀单元。套利。u.，任意单位;STV，链霉亲和素。所有图像均使用带有60倍水浸物镜（NA1.27）的转盘共聚焦显微镜（尼康CSU-W1）获得。这个数字是从Shi等人1修改而来的。请点击此处查看此图的大图。

图3:使用共聚焦显微镜的LR-ExM的代表性结果。 （A，B）在U2OS细胞中用NHS-MA-生物素偶联二抗（洋红色）标记的微管和用NHS-MA-DIG偶联二抗（绿色）标记的CCP的LR-ExM共聚焦图像。（B） 放大视图。（C-F）使用蛋白质标签方法（C）SNAP标签标记的网格蛋白，（D）CLIP标签标记的TOMM20和（E）双色成像标记的HeLa细胞中CCP和/或线粒体的LR-ExM共聚焦图像。（F） 放大视图。（G）使用免疫染色方法（NPC，红热）和蛋白质标签方法（SNAP标记层粘连蛋白A / C（青色）的组合的双色共聚焦LR-ExM图像。（H） 放大视图。（一，一）H的各个通道的视图。请注意，G 中的细胞质背景是由抗 NUP153 抗体引起的。A-B:4.7、C-D:4.4、E-F:4.5 和 G-J 中图像的长度扩展比为 4.5。 比例尺，A 为 1 μm，B 和 F 为 200 nm，C-E 为 500 nm，G 为 2 μm，H、I 和 J 为 500 nm。所有比例尺均采用预膨胀单元。所有图像都是使用带有60倍水浸物镜（NA1.27）的转盘共聚焦显微镜（尼康CSU-W1）获得的。这个数字是从Shi等人1修改而来的。请点击此处查看此图的大图。

图4:LR-ExM在组织样本上的代表性结果。 （A）对突触前标记巴松管（洋红色）和突触后标记物Homer1（绿色）进行间接免疫染色的小鼠脑切片的LR-ExM共聚焦图像。（乙，丙）突触的放大图像。（D，E）沿黄色框长轴的横向强度分布。巴松管用NHS-MA-DIG偶联二抗标记，Homer1用NHS-MA-生物素偶联二抗标记。所有样品均在扩增后用链霉素-AF488和/或抗地高辛-AF594染色。 A-C 中图像的长度扩展率为 4.2。比例尺，1 μm （A） 和 200 nm （B，C）。所有比例尺均采用预膨胀单元。所有图像都是使用带有60倍水浸物镜（NA1.27）的转盘共聚焦显微镜（尼康CSU-W1）获得的。这个数字是从Shi等人1修改而来的。请点击此处查看此图的大图。

表1:化学品和缓冲液 请点击此处下载此表格。

表2:单体溶液 请点击此处下载此表。

表3:凝胶溶液 请点击此处下载此表。

作者声明不存在利益冲突。