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方法文章

标签保留型扩展显微技术（LR-ExM）实现超分辨率成像与高效标记

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DOI：

10.3791/63793

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2022年10月11日

 ,  , 
1Center for Complex Biological Systems, University of California Irvine, 2Department of Developmental and Cell Biology, University of California Irvine, 3Department of Chemistry, University of California Irvine

本文内容

摘要

本文演示了一种标签保留型扩增显微镜技术（LR-ExM）的实验方案。LR-ExM采用了一种新型的三功能锚定分子，与此前报道的扩增显微镜技术相比，具有更高的标记效率。

摘要

膨胀显微技术（ExM）是一种样品制备技术，可与大多数光学显微方法结合使用，以提高分辨率。在将细胞或组织包埋于可膨胀的水凝胶后，样品相对于原始尺寸可在线性尺寸上物理膨胀三至十六倍。因此，任何显微镜的有效分辨率均随膨胀倍数相应提高。早期引入的ExM技术存在一个主要局限性，即在聚合和消化步骤后荧光信号减弱。为克服这一局限，已开发出信号保留型膨胀显微技术（LR-ExM），该技术采用一组新型三功能锚定分子，可防止信号丢失并显著提高标记效率。该技术使得在纳米尺度下研究细胞或亚细胞结构时，在荧光信号损失极小的情况下实现更高分辨率。LR-ExM不仅可用于免疫荧光标记，还可与自标记蛋白标签（如SNAP标签和CLIP标签）联用，从而实现更高的标记效率。本文介绍了基于免疫染色的该技术操作流程及故障排除方法，并讨论了LR-ExM中自标记标签策略作为替代方案的应用。

引言

自膨胀显微技术（ExM）首次被提出以来，研究人员已将其作为一种便捷的方法，用于在常规显微镜（如落射荧光显微镜和共聚焦显微镜）上实现超分辨率成像1,2,3,4,5,6,7。利用ExM，即使使用普通的共聚焦显微镜，也能实现约70 nm的横向分辨率。当ExM与超分辨率成像技术结合时，分辨率可进一步提高。例如，与结构光照明显微镜（SIM）结合时，分辨率可达约30 nm；与随机光学重建显微镜（STORM）结合时，分辨率可达约4 nm1,5。

然而，标记效率低是标准扩展显微技术（ExM）方法中的一个关键问题。荧光损失的程度可能因荧光基团的类型和消化时间的不同而有所变化。然而据报告，平均而言，在ExM的聚合和蛋白质消化步骤后，超过50%的荧光分子会丢失，这会对成像质量产生不利影响3,4。

因此，已开发出标签保留型膨胀显微技术（label-retention expansion microscopy, LR-ExM），该方法可高效保留标记物并减少信号损失1。LR-ExM 的关键创新在于使用一组三功能锚定分子，而非标准 ExM 流程中仅使用荧光染料来标记目标蛋白。这些三功能连接分子包含三个部分：（1）连接基团（例如 N-羟基琥珀酰亚胺，NHS），用于与抗体结合；（2）锚定基团（例如甲基丙烯酰胺，MA），用于将蛋白锚定至聚合物网络；（3）报告基团（例如生物素或地高辛，DIG），用于与有机荧光染料偶联。三功能锚定分子可在聚合反应和蛋白消化步骤中保持稳定，从而防止荧光基团丢失。

此外，该方法具有巨大潜力，因其可与SNAP或CLIP等自标记酶标签兼容。相较于免疫染色方法，酶标签技术在高特异性和标记效率方面具有一定优势8,9,10。

本文展示了LR-ExM的详细操作流程。LR-ExM是一种高效且灵活的方法，可实现高空间分辨率并提高标记效率。

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方案

1. 细胞培养

  1. 使用在含10% FBS的McCoy's 5A培养基中、37 °C、5% CO2条件下培养的U2OS细胞。
  2. 将细胞接种于16孔可拆卸式腔室盖玻片（培养面积0.4 cm2）中，便于操作。

2. 固定与通透处理

注意：固定和通透条件取决于优化的免疫染色方案。以下是用于共免疫染色微管和网格蛋白包被小窝（CCPs）的固定和通透方案。

  1. 当细胞计数达到约 0.04 x 106 时，在室温下用 100 µL 含 3.2% 多聚甲醛（PFA）的 PEM 缓冲液（100 mM PIPES、1 mM EGTA 和 1 mM MgCl2，pH 6.9）固定细胞 10 分钟（表 1）。
    注意：使用 PFA 的固定操作需在经认证的安全通风橱中进行。
  2. 用 200 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞三次，每次 5 分钟。
  3. 在室温下用 100 µL 透化缓冲液对细胞进行透化处理，持续 15 分钟（表 1）。
    ​注意：应尽快进行标记操作，以避免靶蛋白、RNA 或 DNA 降解，并获得最佳结果。然而，若有必要，固定后的样品可在 4 °C 的 PBS 缓冲液中长期保存（最长可达一个月）。需补充蒸发损失的 PBS，并防止样品发生光漂白。

3. 内源性链霉亲和素和生物素的封闭

  1. 将细胞与用细胞封闭缓冲液稀释的链霉亲和素溶液（100 µL）在室温下孵育 15 分钟（表 1）。
  2. 用 200 µL 细胞封闭缓冲液短暂漂洗。
  3. 将细胞与用细胞封闭缓冲液稀释的生物素溶液（100 µL）在室温下孵育 15 分钟。
    ​注意：当使用自标记标签方法（如 SNAP 或 CLIP 标签）时，跳过步骤 4，直接进行步骤 5.1：自标记标签方法。

4. 一抗孵育

  1. 将细胞与大鼠抗α-微管蛋白抗体（1:500 稀释）和兔抗网格蛋白重链抗体（1:100 稀释）在 100 µL 细胞封闭缓冲液中孵育，4 °C 孵育 16 小时，或室温孵育 1 小时。组织样本的孵育时间加倍。
  2. 用 200 µL PBS 洗涤样本 4 次，每次 5 分钟。

5. LR-ExM 特异性二抗染色

  1. 将IgG抗体与三功能连接子（如N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）-甲基丙烯酰胺（MA）-生物素或NHS-MA-地高辛（Dig））进行偶联（图1B）。三功能锚分子的合成及二抗的偶联方法此前已在Shi等1中介绍。自标记标记方法：将IgG抗体与三功能连接子（如MA-苄基鸟嘌呤（BG）-生物素或MA-苄基胞嘧啶（BC）-Dig）进行偶联（图1B）。三功能锚分子的合成及二抗偶联方法此前已在Shi等1中介绍。
  2. 在100 µL细胞封闭缓冲液中，室温下用驴抗兔-Dig-MA（1:100稀释）和驴抗大鼠-生物素-MA（1:100稀释）二抗孵育细胞，孵育1小时。组织样本的孵育时间加倍。
  3. 用200 µL PBS洗涤样本4次，每次5分钟。

6. 额外固定

  1. 将细胞与0.25%戊二醛（GA）在PBS中（100 µL）于室温孵育15分钟，以将蛋白质锚定在水凝胶上。或者，可使用25 mM甲基丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（MA-NHS）进行锚定，建议在室温下孵育1小时。
  2. 用PBS洗涤样品三次，每次5分钟。

7. 凝胶化

注意：膨胀速度由盐和水扩散出或进入凝胶的时间决定；因此，制备较薄的凝胶可加快膨胀时间。

  1. 取下16孔凝胶板的上部结构。向每个孔中加入40 µL单体溶液，于冰上孵育5分钟以对细胞进行预处理。
    1. 单体溶液的配制方法见表2。
  2. 在冰上配制凝胶溶液。将双蒸水和10% N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED）促凝剂加入单体溶液中（10% TEMED : 单体溶液 = 1:47）；此时暂不加入引发剂（表3）。
  3. 对于面积为0.4 cm2的细胞培养腔室，每孔使用约40 µL凝胶溶液。每孔应准备45 µL凝胶溶液。
  4. 向凝胶溶液中加入10%过硫酸铵（APS），在冰上孵育，并立即用移液器将40 µL凝胶溶液加入冰上的硅胶垫圈各孔中。继续在冰上孵育3分钟（10% APS : 10% TEMED : 单体溶液 = 1:1:47）。
  5. 将样品避光，并将10 cm培养皿中的盖玻片转移至37 °C培养箱中孵育1.5小时以完成凝胶化。为保持凝胶在37 °C孵育过程中的湿度，需用培养皿盖盖住培养皿，并在培养皿内加入数滴水。

8. 消化

  1. 凝胶化后，移除玻璃以分离凝胶，并将凝胶转移至6孔板中。使用2 mL消化缓冲液（表1）在室温下过夜或在37 °C下消化4小时，以消化包埋的细胞。消化缓冲液的用量应至少为凝胶体积的10倍以上。
  2. 使用至少为最终凝胶体积10倍以上的水对凝胶进行洗涤。重复洗涤步骤四次，每次20至30分钟。凝胶在每个维度上大约膨胀两倍。
    ​注意：凝胶样品可在4 °C的PBS缓冲液中保存长达1个月。需补充蒸发的水分以避免干燥，并在储存期间避免光照。为防止三功能锚定剂降解，建议在消化和洗涤后尽快进行染色。

9. 消化后荧光染色

  1. 将凝胶在含有 2 至 5 µM STV-染料和/或抗 DIG-染料的 2 mL 体积的链霉亲和素（STV）/地高辛（DIG）染色缓冲液中室温孵育 24 小时。样品需避光保存。

10. 扩增

  1. 每次使用过量水（2–3 mL）清洗并膨胀凝胶，每次30分钟至1小时，共重复4次。
  2. 为了在荧光显微镜下更清晰地观察细胞，可在五次清洗中的第三次加入DAPI对细胞进行染色。将DAPI储备液（5 mg/mL，4 °C保存）按1:5,000的比例稀释于清洗用水中。将凝胶与DAPI水溶液（2 mL）共同孵育30分钟至1小时。
  3. 再用3 mL水额外清洗两次。
  4. 将凝胶置于足够容纳样品的平底培养皿中进行膨胀。在0.4 cm2面积盖玻片上制备的膨胀凝胶可很好地适配玻璃底6孔板。
    注意：膨胀后染色的样品可在4 °C的PBS缓冲液中保存长达4个月。需加入足量水以防止干燥，并避免样品发生光漂白。成像前需重复膨胀及DAPI染色步骤。为避免荧光染料降解，样品应尽快成像。

11. 成像

  1. 用0.01%多聚-L-赖氨酸（每孔3 mL）包被6孔玻璃底成像培养皿，以固定凝胶样品。
  2. 将凝胶样品转移至包被好的成像培养皿中。
  3. 使用任意所需的荧光显微镜对样品进行成像。

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结果

使用三功能锚定分子对网格蛋白包被凹陷（CCPs）进行免疫染色（图1B），并按照图1A所述方法进行LR-ExM。与蛋白保留型扩增显微技术（proExM，图2A）或生物素-ExM（图2B）相比，LR-ExM（图2C、E）显示出更高的荧光强度；LR-ExM的信号强度约为proExM的六倍（图2D）。LR-ExM能够有效捕获CCPs等微小结构，其尺寸甚至小于衍射极限（图2F、G）。

通过免疫染色方法展示了LR-ExM的一些代表性结果。微管和网格蛋白包被小窝（CCPs）使用三功能锚定分子NHS-MA-DIG和NH...

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讨论

LR-ExM 的关键创新在于使用三功能锚定分子有效标记目标蛋白并提高图像质量。该方法受限于三功能锚定分子，而这类分子目前尚不易被研究人员获得。然而， 三功能锚定分子可根据请求与其他研究人员共享，类似产品如 Chrometa 公司的 ExM 探针也已实现商业化供应。

在本方案中，一抗和二抗染色步骤均在室温下孵育1小时。然而，这些步骤也可在4 °C下过夜孵育，据观察，过夜染色可降低背景噪声。

为了防止水凝胶各向异性膨胀导致的结构畸变，使用蛋白酶进行彻底的蛋白质消化至关重要3。然而，以往的扩展显微技术显示，在聚合和蛋白质消化步骤后，超过50%的荧光标记会丢失，从而导致图像质量下降3,4。为解决这一问题，已开发出LR-ExM技术，该方法通过在消化后引入荧光标记，最大限度地减少了信号损失1。

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（R00 GM126136，授予 X.S.）、美国国家科学基金会（DMS1763272，授予 S.P.）和西蒙斯基金会（594598，授予 S.P.）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
丙烯酰胺 Sigma A9099 ExM 凝胶
驴抗兔 IgG（AffiniPure）Jackson ImmunoResearchH+L, 711–005-152抗体
驴抗大鼠 IgG（AffiniPure）Jackson ImmunoResearchH+L, 712–005-153抗体
Alexa Fluor 488 标记链霉亲和素Jackson ImmunoResearch016-540-084荧光探针 
Alexa Fluor 594 标记链霉亲和素Jackson ImmunoResearch016-580-084荧光探针 
Alexa Fluor 647 标记链霉亲和素Jackson ImmunoResearch016-600-084荧光探针 
过硫酸铵 Sigma A3678 ExM 凝胶
抗 H3K4me3 抗体Abcamab8580抗体
抗 H3K9me3 抗体Abcamab176916抗体
DAPI 二乙酸盐Thermofisher ScientificD3571荧光探针 
DyLight 488 标记抗地高辛/地高辛（DIG）抗体Vector LaboratoriesDI-7488荧光探针 
DyLight 594 标记抗地高辛/地高辛（DIG）抗体Vector LaboratoriesDI-7594荧光探针 
EGTAEMD Millipore Corp.324626-25GM固定缓冲液
乙二胺四乙酸 Sigma EDTA消化缓冲液
10% 电镜级戊二醛Electron Microscopy Sciences50-262-13锚定
Grace Bio-Labs CultureWell 可拆卸腔室盖玻片Grace Bio-Labs GBL112358-8EA细胞培养腔室
Grace Bio-Labs CultureWell 拆卸工具Grace Bio-Labs GBL103259拆卸工具
盐酸胍 Sigma G3272 消化缓冲液
氯化镁SigmaM8266-1KG固定缓冲液
McCoy's 5a 培养基ATCC30–2007细胞培养基
甲基丙烯酸 N-羟基琥珀酰亚胺酯，98% （MA-NHS）Sigma 730300-1G锚定
单克隆小鼠抗 Nup153 抗体Abcamab24700抗体
N,N′ 亚甲基双丙烯酰胺 Sigma M7279 ExM 凝胶
N,N,N′,N′ 四甲基乙二胺 （TEMED）Sigma T7024 ExM 凝胶
16% 甲醛水溶液Electron Microscopy Sciences50-980-487固定缓冲液
PIPESSigmaP6757-25G固定缓冲液
聚-L-赖氨酸SigmaP8920-100ML腔室包被
蛋白酶 K Sigma-AldrichP4850-5ML消化缓冲液
兔抗网格蛋白重链抗体Abcamab21679抗体
大鼠抗–α-微管蛋白抗体，酪氨酸化，克隆 YL1/2Millipore SigmaMAB1864-I抗体
丙烯酸钠 Sigma408220ExM 凝胶
链霉亲和素/生物素封闭试剂盒Vector LaboratoriesSP-2002封闭缓冲液
Tris-HCl Life Technologies AM9855 消化缓冲液
U2OS 细胞ATCCHTB-96细胞系
6 孔玻璃底培养板CellvisP06-1.5H-N成像板

参考文献

  1. Shi, X., et al. Label-retention expansion microscopy. The Journal of Cell Biology. 220 (9), 202105067(2021).
  2. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  3. Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
  4. Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
  5. Wang, Y., et al. Combined expansion microscopy with structured illumination microscopy for analyzing protein complexes. Nature Protocols. 13 (8), 1869-1895 (2018).
  6. Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
  7. Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super resolution imaging of three-dimensional protein localization in size adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
  8. Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
  9. Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (27), 9955-9959 (2004).
  10. Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super resolution microscopy. Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
  11. Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (19), 45836(2018).
  12. Damstra, H. G. J., et al. Visualizing cellular and tissue ultrastructure using Ten-fold Robust Expansion Microscopy (TREx). eLife. 11, 73775(2021).
  13. M'Saad, O., Bewersdorf, J. Light microscopy of proteins in their ultrastructural context. Nature Communications. 11 (1), 3850(2020).

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