标签保留型扩展显微技术（LR-ExM）实现超分辨率成像与高效标记

摘要

本文演示了一种标签保留型扩增显微镜技术（LR-ExM）的实验方案。LR-ExM采用了一种新型的三功能锚定分子，与此前报道的扩增显微镜技术相比，具有更高的标记效率。

摘要

膨胀显微技术（ExM）是一种样品制备技术，可与大多数光学显微方法结合使用，以提高分辨率。在将细胞或组织包埋于可膨胀的水凝胶后，样品相对于原始尺寸可在线性尺寸上物理膨胀三至十六倍。因此，任何显微镜的有效分辨率均随膨胀倍数相应提高。早期引入的ExM技术存在一个主要局限性，即在聚合和消化步骤后荧光信号减弱。为克服这一局限，已开发出信号保留型膨胀显微技术（LR-ExM），该技术采用一组新型三功能锚定分子，可防止信号丢失并显著提高标记效率。该技术使得在纳米尺度下研究细胞或亚细胞结构时，在荧光信号损失极小的情况下实现更高分辨率。LR-ExM不仅可用于免疫荧光标记，还可与自标记蛋白标签（如SNAP标签和CLIP标签）联用，从而实现更高的标记效率。本文介绍了基于免疫染色的该技术操作流程及故障排除方法，并讨论了LR-ExM中自标记标签策略作为替代方案的应用。

引言

自膨胀显微技术（ExM）首次被提出以来，研究人员已将其作为一种便捷的方法，用于在常规显微镜（如落射荧光显微镜和共聚焦显微镜）上实现超分辨率成像^{1,2,3,4,5,6,7}。利用ExM，即使使用普通的共聚焦显微镜，也能实现约70 nm的横向分辨率。当ExM与超分辨率成像技术结合时，分辨率可进一步提高。例如，与结构光照明显微镜（SIM）结合时，分辨率可达约30 nm；与随机光学重建显微镜（STORM）结合时，分辨率可达约4 nm^1,5。

然而，标记效率低是标准扩展显微技术（ExM）方法中的一个关键问题。荧光损失的程度可能因荧光基团的类型和消化时间的不同而有所变化。然而据报告，平均而言，在ExM的聚合和蛋白质消化步骤后，超过50%的荧光分子会丢失，这会对成像质量产生不利影响^....

方案

1. 细胞培养

1. 使用在含10% FBS的McCoy's 5A培养基中、37 °C、5% CO₂条件下培养的U2OS细胞。
2. 将细胞接种于16孔可拆卸式腔室盖玻片（培养面积0.4 cm²）中，便于操作。

2. 固定与通透处理

注意：固定和通透条件取决于优化的免疫染色方案。以下是用于共免疫染色微管和网格蛋白包被小窝（CCPs）的固定和通透方案。

1. 当细胞计数达到约 0.04 x 10⁶ 时，在室温下用 100 µL 含 3.2% 多聚甲醛（PFA）的 PEM 缓冲液（100 mM PIPES、1 mM EGTA 和 1 mM MgCl₂，pH 6.9）固定细胞 10 分钟（表 1）。
   注意：使用 PFA 的固定操作需在经认证的安全通风橱中进行。
2. 用 200 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞三次，每次 5 分钟。
3. 在室温下用 100 µL 透化缓冲液对细胞进行透化处理，持续 15 分钟（表 1）。
   ​注意：应尽快进行标记操作，以避免靶蛋白、RNA ....

结果

使用三功能锚定剂对网格蛋白包被小窝（CCPs）进行免疫染色（图1B），并按照 图1A 所述方法进行LR-ExM实验。与蛋白保留型膨胀显微镜（proExM，图2A）或生物素-ExM（图2B）相比，LR-ExM（图2C、E）显示出更高的荧光强度；LR-ExM的信号强度约为proExM的六倍（图2D）。LR-ExM能够有效捕捉CCPs等微小结构，其尺寸甚至小于衍射极限（图2F、G）。

通过免疫染色方法展示了LR-ExM的一些代表性结果。微管和网格蛋白包被小窝（CCPs）使用三功能锚定分子NHS-MA-DIG和.......

讨论

LR-ExM 的关键创新在于使用三功能锚定分子有效标记目标蛋白并提高图像质量。该方法受限于三功能锚定分子，而这类分子目前尚不易被研究人员获得。然而， 三功能锚定分子可根据请求与其他研究人员共享，类似产品如 Chrometa 公司的 ExM 探针也已实现商业化供应。

在本方案中，一抗和二抗染色步骤均在室温下孵育1小时。然而，这些步骤也可在4 °C下过夜孵育，据观察，过夜染色可降低背景噪声。

为了防止水凝胶各向异性膨胀导致的结构畸变，使用蛋白酶进行彻底的蛋白质消化至关重要³。然而，以往的扩展显微技术显示，在聚合和蛋白质消化步骤后，超过50%的荧光标记会丢失，从而导致图像质量下降^3,4。为解决这一问题，已开发出LR-ExM技术，该方法通过在消化后引入荧光标记，最大限度地减少了信号损失¹。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
丙烯酰胺	Sigma	A9099	ExM 凝胶
驴抗兔 IgG（AffiniPure）	Jackson ImmunoResearch	H+L, 711–005-152	抗体
驴抗大鼠 IgG（AffiniPure）	Jackson ImmunoResearch	H+L, 712–005-153	抗体
Alexa Fluor 488 标记链霉亲和素	Jackson ImmunoResearch	016-540-084	荧光探针
Alexa Fluor 594 标记链霉亲和素	Jackson ImmunoResearch	016-580-084	荧光探针
Alexa Fluor 647 标记链霉亲和素	Jackson ImmunoResearch	016-600-084	荧光探针
过硫酸铵	Sigma	A3678	ExM 凝胶
抗 H3K4me3 抗体	Abcam	ab8580	抗体
抗 H3K9me3 抗体	Abcam	ab176916	抗体
DAPI 二乙酸盐	Thermofisher Scientific	D3571	荧光探针
DyLight 488 标记抗地高辛/地高辛（DIG）抗体	Vector Laboratories	DI-7488	荧光探针
DyLight 594 标记抗地高辛/地高辛（DIG）抗体	Vector Laboratories	DI-7594	荧光探针
EGTA	EMD Millipore Corp.	324626-25GM	固定缓冲液
乙二胺四乙酸	Sigma	EDTA	消化缓冲液
10% 电镜级戊二醛	Electron Microscopy Sciences	50-262-13	锚定
Grace Bio-Labs CultureWell 可拆卸腔室盖玻片	Grace Bio-Labs	GBL112358-8EA	细胞培养腔室
Grace Bio-Labs CultureWell 拆卸工具	Grace Bio-Labs	GBL103259	拆卸工具
盐酸胍	Sigma	G3272	消化缓冲液
氯化镁	Sigma	M8266-1KG	固定缓冲液
McCoy's 5a 培养基	ATCC	30–2007	细胞培养基
甲基丙烯酸 N-羟基琥珀酰亚胺酯，98% （MA-NHS）	Sigma	730300-1G	锚定
单克隆小鼠抗 Nup153 抗体	Abcam	ab24700	抗体
N,N′ 亚甲基双丙烯酰胺	Sigma	M7279	ExM 凝胶
N,N,N′,N′ 四甲基乙二胺 （TEMED）	Sigma	T7024	ExM 凝胶
16% 甲醛水溶液	Electron Microscopy Sciences	50-980-487	固定缓冲液
PIPES	Sigma	P6757-25G	固定缓冲液
聚-L-赖氨酸	Sigma	P8920-100ML	腔室包被
蛋白酶 K	Sigma-Aldrich	P4850-5ML	消化缓冲液
兔抗网格蛋白重链抗体	Abcam	ab21679	抗体
大鼠抗–α-微管蛋白抗体，酪氨酸化，克隆 YL1/2	Millipore Sigma	MAB1864-I	抗体
丙烯酸钠	Sigma	408220	ExM 凝胶
链霉亲和素/生物素封闭试剂盒	Vector Laboratories	SP-2002	封闭缓冲液
Tris-HCl	Life Technologies	AM9855	消化缓冲液
U2OS 细胞	ATCC	HTB-96	细胞系
6 孔玻璃底培养板	Cellvis	P06-1.5H-N	成像板