鸡颅神经嵴细胞培养物的制备与形态学分析

摘要

该多功能实验方案描述了通过切除鸡胚头部神经褶来分离迁移前神经嵴细胞（NCCs）的方法。将神经褶外植体接种并培养后，迁移期的神经嵴细胞会从中迁移而出，从而可在简化的二维环境中对细胞形态和迁移行为进行评估。

摘要

在脊椎动物发育过程中，神经嵴细胞（NCCs）广泛迁移并分化为多种细胞类型，参与颅面骨骼和周围神经系统等结构的形成。尽管在三维胚胎背景下理解NCC迁移至关重要，但在二维培养中分离迁移细胞有助于实现细胞的可视化和功能表征，从而补充胚胎研究。本实验方案介绍了一种分离鸡胚颅部神经褶以建立原代NCC培养的方法。将神经褶外植体接种于纤连蛋白包被的基质上后，迁移中的NCCs会从中迁移而出。由此获得分散且贴壁生长的NCC群体，可通过染色和定量形态学分析进行评估。该简化培养方法具有高度可适性，可与其他技术结合使用。例如，可通过延时成像分析NCC的迁移行为，或通过引入抑制剂、基因表达干预手段（如DNA、吗啉寡核苷酸或CRISPR电穿孔）进行功能研究。由于其多功能性，该方法为研究颅部NCC的发育提供了强有力的实验体系。

引言

神经嵴细胞（NCCs）是脊椎动物胚胎中一种短暂存在的细胞群体。NCCs在神经板的边缘区域被确定，并经历上皮-间质转化（EMT），从背侧神经管迁移而出¹。EMT发生后，NCCs广泛分散于整个胚胎中，最终分化并参与形成多种结构，包括颅面骨骼、心脏流出道以及大部分周围神经系统²。细胞极性、细胞骨架以及黏附特性的改变是NCCs从前迁移状态转变为迁移状态的基础³。研究NCC的EMT过程和迁移行为有助于揭示细胞运动的基本机制，并为预防和治疗先天性畸形及癌症转移提供理论依据。

尽管在胚胎环境中，体内分析对于理解神经嵴细胞（NCC）发育过程至关重要，但体外方法提供了更直观的可视化和物理可及性，从而拓展了额外的实验途径。在简化的二维环境中，可对NCC的形态、细胞骨架结构以及迁移距离进行评估。此外，还可分析基因或可溶性因子扰动对运动性NCC迁移行为的影响^4,5,6,7,8,<....

方案

可使用多种Gallus gallus品种，包括白来航鸡、金羽伴性品系或罗得岛红鸡。本研究中使用的鸡胚来自不同品种，且取自多个来源，包括本地农场和孵化场。

1. 溶液与材料的准备

1. 通过混合 123.3 mM NaCl、1.53 mM CaCl₂、4.96 mM KCl、0.809 mM Na₂HPO₄ 和 0.147 mM KH₂PO₄ 配制任氏液（参见材料表）。调节 pH 至 7.4，并过滤除菌后分装至 100 mL 瓶中。存放于洁净干燥处。切勿用肥皂清洗瓶子（按组织培养玻璃器皿处理）。
2. 将纤连蛋白（FN）溶于无菌任氏液中，配制成 1 mg/mL 的储存液（参见材料表），分装为 100 µL 每份，于 -80 °C 保存（至少可稳定保存 4 年）。
3. 通过在 L15 培养基中添加 0.8% L-谷氨酰胺、0.08% 青霉素/链霉素、10% 胎牛血清（FBS）和 10% 鸡胚提取物¹²，配制完全培养基。分装为 3 mL 每份，于 -20 °C 或 -80 °C 保存。
   注意：若培养物需在 CO₂ 培养箱中孵育....

结果

本方案的总体流程见图1。将孵育的鸡蛋打开，轻轻倒入戴手套的手掌中，分离出表面带有胚胎的卵黄（图2A，B）。清除蛋白后（图2C），将滤纸框置于包围胚胎的卵黄膜上，以辅助切割并提起胚胎；一旦卵黄膜被切开，卵黄即开始流出（图2D，E）。

图2

讨论

本文所述技术提供了一种可调节的方法，用于分离鸡胚神经褶并将其接种培养，从而获得迁移性颅神经嵴细胞（NCC）的培养物。此类培养物为鸡胚神经嵴细胞的迁移和形态学分析提供了简化的二维条件，可作为技术上更具挑战性的鸡胚内（in ovo）成像方法的补充^24,25,26。尽管该体外（in vitro）方法相对简单，但获得稳定结果依赖于高质量的种蛋和试剂。此外，由于培养体系本身存在固有的变异性，实验的可重复性需要通过重复实验和定量分析来实现。

神经褶与纤连蛋白（FN）的黏附对于体外培养中神经嵴细胞（NCC）的迁移至关重要。有时外植体无法正常黏附，导致神经褶漂浮或几乎不产生迁移的NCC。这种情况可能发生在头颅神经褶未以切面朝下的方向放置时；因此，在孵育前应尽量将外植体在培养容器中正确摆放，并在移动前静置10–15分钟使其充分沉降。然而，由于转移至培养箱过程中液体混合，部分神经褶.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
配备由 ZEN 3.0 SR 软件控制的 LSM710 共聚焦扫描头的 AxioObserver 显微镜	Zeiss		使用 alpha Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC M27 物镜
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3306
培养皿（玻璃底，单室或分隔式）	MatTek；Cell Vis	P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis) X000NOK1OJ (Cellvis)	单室 35 mm 或四室 35 mm
盖玻片	Carolina Biological Supply Company	633029, 633031, 633033, 633035, 633037	圆形，厚度 0.13–0.17 mm，直径范围 12–25 mm 可选
DMEM/F12	ThermoFisher Scientific	11320033	L15 培养基的替代选择
孵蛋器	Sportsman	1502
FBS	Life Technologies	10437-028
纤连蛋白	Fisher Scientific	CB-40008A
滤纸	Whatman		3MM 级层析滤纸
镊子（钝头）	Fisher Scientific；Thomas Scientific	08-890 (Fisher)；1141W97 (Thomas)
镊子（精细）	Fine Science Tools	11252-20	Dumont #5
Image J	https://fiji.sc/		免费图像分析软件
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662
L15 培养基	Invitrogen	11415064
L-谷氨酰胺	Invitrogen	25030
封片剂（Vectashield 或 ProLong Gold）	Vector Laboratories；ThermoFisher Scientific	H-1700 (Vectashield)；P36930 (ProLong Gold)
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S9638
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148
青霉素/链霉素	Life Technologies	15140-148	10,000 单位/mL 青霉素；10,000 mg/mL 链霉素
培养皿	VWR（或类似品牌）		60 mm，100 mm
鬼笔环肽	Sigma-Aldrich	P1951	提供多种荧光标记物
持针器	Fine Science Tools	26016-12	用于钨针（可替代弹簧剪）
手术剪	Fine Science Tools	14061-10
弹簧剪	Fine Science Tools	15000-08	2.5 mm 刃口（可替代钨针）
Sylgard	Krayden	Sylgard 184
注射器滤器	Sigma-Aldrich	SLGVM33RS	Millex-GV 注射器滤器，0.22 µm，PVDF 材质，33 mm，经伽马射线灭菌
组织培养皿	Sarstedt	83-3900	35 mm 培养皿，用于大量神经褶培养
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
钨丝	多种来源		直径 0.01"，用于制作钨针（可替代弹簧剪）