剖析自然杀伤细胞与伤害感受性神经元之间的相互作用

摘要

伤害感受神经元与自然杀伤细胞在炎症环境中会主动相互作用。通过共培养方法可实现对此类相互作用的研究。

摘要

躯体感觉神经元已进化出检测有害刺激并激活防御反射的能力。通过共享通讯机制，伤害感受神经元还能通过调控免疫系统的活性来调节机体防御功能。这些系统间的通讯大多具有适应性，有助于维持稳态，但也可能引发或促进慢性疾病的发生。这两个系统共同进化，使得局部相互作用成为可能，例如存在于初级和次级淋巴组织以及黏膜中的相互作用。近期研究表明，伤害感受器能够直接检测并响应外来抗原、免疫细胞分泌的细胞因子以及微生物。

伤害感受器的激活不仅会导致疼痛过敏和瘙痒，还会降低伤害感受器的放电阈值，从而引起局部神经肽的释放。由伤害感受器外周末梢产生并释放的这些肽类物质能够抑制淋巴细胞的趋化性和极化，调控炎症的定位、持续时间及类型。近期证据表明，感觉神经元与先天免疫细胞之间存在相互作用。 通过 细胞间接触，例如激活自然杀伤（NK）细胞上的2D组（NKG2D）受体。

鉴于自然杀伤细胞（NK细胞）表达多种伤害感受器产生介质的相应受体，伤害感受器可能通过神经肽来调控NK细胞的活性。在此，我们设计了一种共培养方法，用于在体外研究伤害感受神经元与NK细胞之间的相互作用。利用该方法，我们发现腰段伤害感受神经元可降低NK细胞的细胞因子表达。总体而言，这种简化的方法有助于研究肿瘤支配神经元如何调控NK细胞的抗癌功能，以及NK细胞如何参与受损神经元的清除过程。

引言

感觉神经元的胞体起源于背根神经节（DRG）。DRG位于周围神经系统（PNS）中，介于脊髓的背角与周围神经末梢之间。DRG神经元的假单极结构使其能够将来自外周分支的信息（支配靶组织）传递至中枢分支，后者将躯体感觉信息传送到脊髓¹。通过特化的离子通道受体，初级神经元可感知病原体、过敏原和污染物带来的威胁²，从而引起阳离子（Na⁺、Ca²⁺）内流并产生动作电位^3,4,⁵。

这些神经元还会向周围组织传递逆向动作电位，即最初发生危险感知的部位，从而导致神经肽在局部释放^1,4。因此，伤害感受神经元起到一种保护机制的作用，可提醒机体注意环境中的危险^4,5,6,7。 

为了与二级神经元进行通信，伤害性感受器会释放多种神经递质（例如谷氨酸）和神经肽（例如降钙素基因相关肽（CGRP）、P 物质（SP）和血管活性肠肽（VIP））^6,7。这些肽类作用于毛细血管，促进血浆外渗、水肿以及局部免疫细胞的浸润和调节^2,4,7。

躯体感觉系统和免疫系统利用由细胞因子和神经肽及其相应特异性受体组成的共同通讯系统⁴。这种双向通讯在帮助机体抵御危险和维持稳态的同时，也可能参与疾病病理生理过程的调控⁴。 

自然杀伤细胞（NK细胞）属于先天性淋巴细胞，专门负责清除病毒感染的细胞。NK细胞的功能由一系列激活性和抑制性受体的平衡所调控，其中包括激活性受体NKG2D⁸。NKG2D的内源性配体——视黄酸早期诱导因子1（RAE1）——在发生应激（如肿瘤发生和感染）的细胞中表达^8,9。

最近的研究表明，外周神经损伤会促使感觉神经元表达诸如stathmin 2（STMN2）和RAE1等适应不良分子。因此， 通过 细胞间接触后，表达 NKG2D 的自然杀伤细胞通过与表达 RAE1 的神经元相互作用而被激活。随后，自然杀伤细胞能够清除受损的伤害性感受神经元，并抑制通常与神经损伤相关的疼痛过敏反应¹⁰除了NKG2D-RAE1轴外，自然杀伤细胞还表达多种伤害感受器产生介质的相应受体。因此，这些介质可能调节自然杀伤细胞的活性。本文介绍了一种共培养方法，用于研究伤害感受器神经元与自然杀伤细胞相互作用的生物学特性。该方法将有助于深入理解伤害感受器神经元如何调节先天免疫细胞对损伤、感染或恶性病变的反应。

方案

蒙特利尔大学机构动物护理与使用委员会（#22053，#22054）批准了所有动物实验程序。有关本实验方案中所用溶液及其成分的列表，请参见表1；有关材料、设备和试剂的列表，请参见材料表。

1. NK细胞的分离、培养与刺激

1. 通过将lox-stop-lox-白喉毒素小鼠（DTA^fl/fl）与TRPV1^cre/wt小鼠杂交，获得伤害感受神经元完整（同窝对照；TRPV1^wt::DTA^fl/wt）和消融（TRPV1^cre::DTA^fl/wt）的小鼠。
2. 使用CO₂吸入法对一只未经处理的同窝对照小鼠（TRPV1^wt::DTA^fl/wt）实施安乐死。
3. 将脾脏收集至含有500 µL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的1.5 mL微量离心管中。
4. 使用研磨杵匀浆脾脏组织。
5. 用1 mL无菌PBS稀释细胞悬液。
6. 将混合液通过50 µm细胞筛网过滤至15 mL锥形管中。
7. 用无菌PBS补足体积至10 mL。
8. 取10 µL细胞悬液，使用血细胞计数板进行细胞计数。
9. 离心细胞（500 × g，5分钟），弃去上清液。
10. 将细胞重悬于补充培养基的RPMI 1640培养基中，调整浓度为10⁸个细胞/mL。
11. 按照生产商说明书，使用小鼠NK细胞分离试剂盒通过磁珠分选法纯化脾脏NK细胞。通过流式细胞术确认NK细胞纯度¹¹。
12. 取10 µL细胞悬液，使用血细胞计数板进行细胞计数。
13. 离心细胞（500 × g，5分钟），弃去上清液。
14. 将NK细胞重悬于含IL-2和IL-15的补充RPMI 1640培养基中。
15. 将2 × 10⁶个NK细胞/mL接种于96孔U型底培养板中，培养48小时。

2. 背根神经节神经元的分离与培养

1. 在NK细胞刺激结束前24 h（步骤1.15），用100 µL/孔的层粘连蛋白（1 ng/mL）包被96孔板，37 °C孵育45 min。
2. 孵育后，移除溶液，让孔板在室温下自然干燥 生物安全柜
3. 使用 CO₂ 吸入，安乐死，伤害感受神经元完整（同窝对照；TRPV1）^野生型::DTA^fl/wt）或消融（TRPV1^cre::DTA^fl/wt）小鼠。
   注意：CO₂ 吸入法优于颈椎脱位法，因其可避免损伤与背根神经节（DRG）相连的脊神经。
4. 将小鼠俯卧位固定于解剖板上，提起皮肤，沿背部中线切开皮肤。详细操作视频参见 Perner 等人¹².
5. 剪断腰骶关节，用剪刀将骶骨与腰椎分离。
6. 沿脊柱两侧向颅侧方向切断肌肉和肋骨，分离脊柱，直至到达颅底。
7. 使用剪刀在枕寰关节处剪断脊柱。
8. 去除脊柱上的肌肉和脂肪组织。
9. 用大头针固定并打开脊柱，以取出脊髓并暴露背根神经节（DRG）。在椎间孔处寻找DRG，其通过背根与脊髓相连，但与脑膜分离。
10. 将DRG收集至含有10 mL冰上预冷的添加物DMEM的15 mL锥形管中。
11. 离心样品（200 × g，5 分钟，室温）并移除上清液。
12. 加入含有胶原酶 IV（1 mg/mL）和 Dispase II（2.4 U/mL）的 PBS 250 µL。
13. 将背根神经节与胶原酶IV/分散酶II（C/D）溶液共同孵育（37 °C，80分钟，轻度振荡）。若合并来自多只小鼠的神经节，需维持每神经节125 µL C/D溶液的比例。
14. 为灭活酶，加入5 mL添加了补剂的DMEM培养基。
15. 离心溶液（200 × g，5 分钟）后，用移液器小心吸去上清液。
16. 为避免不必要的细胞损失，残留约100 µL上清液。
17. 加入1 mL含补充物的DMEM培养基。
18. 使用移液枪和三支尺寸依次减小的玻璃巴斯德吸管，轻轻吹打背根神经节（DRG），每次更换吸管上下吹打约10次，直至形成单细胞悬液。
19. 在生物安全柜中，将牛血清白蛋白（BSA）用无菌 PBS 稀释至终浓度为 15%。分装为 1 mL 每份，于 −20 °C 保存。
20. 在15 mL锥形管中，加入2 mL无菌PBS，然后缓慢将1 mL 15% BSA溶液加至管底，形成BSA梯度。移除移液器时应轻柔操作，避免破坏梯度。
21. 使用 P200 移液器，将经研磨的神经节悬液（含有神经元）缓慢地沿管壁加入梯度液中。
22. 离心含有神经元的BSA梯度溶液（200 × g，12 分钟，室温）。将离心机的加速度和减速度设置为最低速度。
    注意：离心后，神经元将位于管底，而细胞碎片则会被截留在BSA梯度中。
23. 使用移液器轻轻吸出所有上清液。
24. 将细胞重悬于500 µL Neurobasal培养基中。
25. 10号培养皿⁴ 每孔（每孔200 µL神经基础培养基）接种于经层粘连蛋白包被的平底96孔板中。
    注意：通常情况下，每只小鼠平均可填充约8个孔。
26. 将神经元在37 °C下培养过夜，以促进贴壁。

3. 共培养与流式细胞术

1. 缓慢移除神经元培养物中的Neurobasal培养基。
2. 经IL-2和IL-15刺激48小时后（见步骤1.14–1.15），重悬NK细胞，并将10⁵个NK细胞/孔加入神经元培养物中（96孔平底板）。
   注意：平均而言，每只小鼠可处理约6个孔。
3. 在添加补充物的Neurobasal MX培养基中共同培养细胞（37 °C，48小时）。
4. 收集细胞，用PBS洗涤（3次），离心（500 × g，5分钟，4 °C）。
5. 弃去上清液，用Viability Dye eFlour-780（1:1,000，15分钟，4 °C）对细胞进行染色。
6. 收集细胞，用PBS洗涤（3次），离心（500 × g，5分钟，4 °C）。
7. 使用CD16/32封闭细胞上的非特异性结合位点（1:100，15分钟，4 °C）。
8. 收集细胞，用PBS洗涤（3次），离心（500 × g，5分钟，4 °C）。
9. 用BV421标记的抗NK-1.1抗体（1:100）、异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗NKp46抗体（1:100）以及藻红蛋白（PE）标记的抗GM-CSF抗体（1:100）对细胞进行染色（15分钟，4 °C）。
10. 收集细胞，用PBS洗涤（3次），离心（500 × g，5分钟，4 °C）。
11. 弃去上清液，将细胞重悬于FACS缓冲液（500 µL）中，通过流式细胞术对NK细胞进行免疫表型分析¹¹。免疫分群策略见图1A。

结果

利用磁珠分选法从同窝对照小鼠（TRPV1^wt::DTA^fl/wt）的脾细胞中分离出自然杀伤（NK）细胞，并用IL-2和IL-15刺激48小时。随后将NK细胞单独培养，或与来自伤害性感受神经元完整（同窝对照；TRPV1^wt::DTA^fl/wt）或消融（TRPV1^cre::DTA^fl/wt）小鼠的背根神经节（DRG）神经元共培养。接着，细胞暴露于TRPV1激动剂辣椒素（1 µM）或其溶剂中。共培养24小时后，通过流式细胞术对NK细胞进行FACS分选，并检测其激活水平以进行免疫表型分析（图1A）。

单独培养时，NK细胞表达基础水平的GM-CSF和NKp46。当与来自伤害性感受器完整（TRPV1^wt::DTA^fl/wt）小鼠的背根神经节（DRG）神经元共培养时，辣椒素刺激降低了NK细胞中GM-CSF的表达。而当与来自伤害性感受器被消融（TRPV1^c...

讨论

Davies 等人¹¹ 发现受损神经元会上调 RAE1。 通过 细胞间接触后，表达 NKG2D 的 NK 细胞能够识别并清除 RAE1⁺ 神经元，进而限制慢性疼痛¹¹鉴于自然杀伤细胞也表达多种神经肽受体，而这些神经肽以其免疫调节能力著称，研究自然杀伤细胞与伤害感受神经元之间的相互作用显得愈发重要 体外在此，我们设计了一种简单的共培养方案，使研究者能够探究神经元如何调控自然杀伤细胞（NK细胞）的功能，以及NK细胞反过来如何调节背根神经节（DRG）神经元的功能。采用流式细胞术对神经元调控NK细胞活化的过程进行免疫表型分析。此外，研究者也可使用qPCR或RNA测序技术检测经FACS分选纯化的细胞中的转录变化，或利用ELISA分析细胞分泌的细胞因子或神经肽等分泌因子的释放情况。原始数据已存入并免费提供于www.talbotlab.com。

本研究发现，TRPV1⁺ 伤害感受神经元在辣椒素作用之后，可抑制自然杀伤细胞（...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗小鼠 CD16/32	Jackson Laboratory	Cat no: 017769
B-27	Jackson Laboratory	Cat no: 009669
牛血清白蛋白（BSA）培养级	World Precision Instruments	Cat no: 504167
BV421 抗小鼠 NK-1.1	Fisher Scientific	Cat no: 12430112
细胞筛（50 μm）	Fisher Scientific	Cat no: A3160702
胶原酶 IV	Fisher Scientific	Cat no: 15140148
白喉毒素fl/fl	Fisher Scientific	Cat no: SH3057402
分散酶 II	Fisher Scientific	Cat no: 13-678-20B
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Fisher Scientific	Cat no: 07-200-95
EasySep 小鼠 NK 细胞分离试剂盒	Sigma	Cat no: CLS2595
乙二胺四乙酸（EDTA）	Sigma	Cat no: C0130
FACSAria III	Sigma	Cat no: 04942078001
胎牛血清（FBS）	Sigma	Cat no: 806552
FITC 抗小鼠 NKp46	Sigma	Cat no: L2020
平底 96 孔板	Sigma	Cat no: 03690
玻璃巴斯德移液管	Sigma	Cat no: 470236-274
胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）	VWR	Cat no: 02-0131
层粘连蛋白	Cedarlane	Cat no: 03-50/31
L-谷氨酰胺	Gibco	Cat no: A14867-01
小鼠重组 IL-15	Gibco	Cat no: 22400-089
小鼠重组 IL-2	Gibco	Cat no: 21103-049
神经生长因子（NGF）	Life Technologies	Cat no: 13257-019
Neurobasal 培养基	PeproTech	Cat no: 450-51-10
PE 抗小鼠 GM-CSF	PeproTech	Cat no: 212-12
青霉素和链霉素	PeproTech	Cat no: 210-15
研磨棒	Stem Cell Technology	Cat no: 19855
磷酸盐缓冲液（PBS）	Biolegend	Cat no: 108732	克隆 PK136
RPMI 1640 培养基	Biolegend	Cat no: 137606	克隆 29A1.4
TRPV1Cre	Biolegend	Cat no: 505406	克隆 MP1-22E9
镊子和解剖工具	Biolegend	Cat no: 65-0865-14
圆底 96 孔板	Biolegend	Cat no: 101319
活率染料 eFlour-780	Becton Dickinson