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光呼吸突变体中光合效率的叶绿素荧光分析评估

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DOI：

10.3791/63801

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2022年12月9日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Louisiana State University, 2Department of Plant Pathology and Crop Physiology, Louisiana State University AgCenter

本文内容

摘要

我们描述了一种利用叶绿素荧光技术检测植物在低CO2处理后光合效率变化的方法。

摘要

光合作用和光呼吸是植物初级代谢中最大的碳通量过程，对植物的生存至关重要。几十年来，许多与光合作用和光呼吸相关的关键酶和基因已被深入研究，但这些生化途径的某些方面及其与多种亚细胞过程的相互作用尚未完全阐明。大量鉴定植物代谢中重要基因和蛋白质的研究是在高度受控的环境中进行的，而这种环境可能无法充分反映光合作用和光呼吸在自然和农业环境中的实际功能状态。鉴于非生物胁迫会导致光合效率下降，因此有必要开发一种高通量筛选方法，能够同时监测非生物胁迫及其对光合作用的影响。

因此，我们开发了一种相对较快的方法，通过叶绿素荧光分析和低 CO2 筛选，检测非生物胁迫诱导的光合效率变化，从而鉴定在光呼吸中发挥作用但尚未被表征的基因。本文描述了一种研究转基因 DNA（T-DNA）敲除突变体中光合效率变化的方法，所用材料为拟南芥（Arabidopsis thaliana）。该方法同样适用于筛选乙基甲磺酸（EMS）诱导的突变体或抑制子筛选。利用此方法可鉴定出参与植物初级代谢和非生物胁迫响应的候选基因。该方法所得数据有助于揭示基因功能，而这些功能可能只有在暴露于增强的胁迫环境时才会显现。

引言

农田中常见的非生物胁迫条件会通过降低光合效率而对作物产量产生负面影响。热浪、气候变化、干旱和土壤盐碱化等有害环境条件可引发非生物胁迫，改变CO2的可利用性，并削弱植物对高光强胁迫的响应能力。地球上最大的两个陆地碳通量过程是光合作用和光呼吸，二者对植物生长和作物产量至关重要。参与这些过程的许多重要蛋白质和酶已在实验室条件下得到表征，并在基因水平上被鉴定1。尽管在理解光合作用和光呼吸方面已取得显著进展，但仍有许多步骤尚未明确，包括植物细胞器之间的物质转运过程2,3。

光呼吸是植物中仅次于光合作用的第二大碳通量，当酶Rubisco将氧气而非二氧化碳固定到核酮糖-1,5-二磷酸（RuBP）上时，该过程即开始，生成抑制性化合物2-磷酸乙醇酸（2PG）1。为了减轻2PG的抑制效应并回收先前固定的碳，C3植物进化出了多细胞器参与的光呼吸过程。光呼吸将两分子2PG转化为一分子3-磷酸甘油酸（3PGA），后者可重新进入C3碳固定循环1。因此，光呼吸仅能回收由2PG生成过程中先前固定的75%的碳，并在此过程中消耗ATP。结果，光呼吸过程对光合作用造成了显著的拖累，使其效率降低10%至50%，具体程度取决于水分供应状况和生长季温度4。

参与光呼吸的酶类数十年来一直是研究重点，但尽管该过程涉及至少25个转运步骤，目前在遗传水平上得到表征的转运蛋白却仅有少数5,6,7。直接参与光呼吸过程中碳代谢物转运的两种转运蛋白是质体乙醇酸/甘油酸转运蛋白PLGG1和胆汁酸钠共转运蛋白BASS6，二者均参与乙醇酸从叶绿体的外运5,6。

在环境 [CO2] 条件下，Rubisco 约有 20% 的时间会将一个氧分子固定到 RuBP 上1。当植物处于低 [CO2] 环境时，光呼吸速率上升，因此低 [CO2] 是筛选在增强的光呼吸胁迫下可能发挥重要作用的突变体的理想条件。通过在低 CO2 条件下处理额外的拟测叶绿体转运蛋白 T-DNA 株系 24 小时，并检测叶绿素荧光的变化，鉴定出表现出光呼吸突变表型的 bass6-1 植株株系5。进一步的表征表明，BASS6 是定位于叶绿体内膜的乙醇酸转运蛋白。

本文详细描述了一种与最初用于鉴定BASS6为光呼吸转运蛋白的实验方案相似的方法，该蛋白源自位于叶绿体膜内的一组假定转运蛋白列表8。该方案可用于高通量实验，以表征拟南芥T-DNA突变体或EMS诱导产生的突变植株，从而鉴定在多种非生物胁迫（如高温、强光胁迫、干旱和CO2可利用性）条件下维持光合效率的重要基因。过去，利用叶绿素荧光筛选植物突变体已被用于快速鉴定参与初级代谢的关键基因9。鉴于拟南芥基因组中多达30%的基因编码功能未知或功能表征不充分的蛋白质，在胁迫条件下对光合效率进行分析，可能揭示在标准控制条件下无法观察到的突变体分子功能10。本方法的目标是通过低CO2筛选来鉴定光呼吸途径中的突变体。我们提出了一种在低CO2暴露后鉴定破坏光呼吸过程的突变体的方法。该方法的优势在于可对幼苗进行高通量筛选，且耗时相对较短。视频方案部分详细介绍了种子准备与灭菌、植株培养与低CO2处理、荧光成像系统的配置、处理样品的量子产率测定、代表性结果及结论。

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方案

1. 种子准备与灭菌

注意：种子准备包括种子吸胀和种子灭菌。需要注意的是，所有这些步骤都必须在超净工作台中进行，以保持无菌条件。所有必要的材料、试剂和培养基都必须经过高压灭菌（参见材料表）。

  1. 种子吸胀与春化处理
    注：所用种子品系为 plgg1-1 (salk_053463)、abcb26 (salk_085232) 以及野生型（WT, Col-0）。
    1. 将种子分装至 1.5 mL 微型离心管中。在超净工作台中用无菌水浸泡种子，并于 4 °C 黑暗条件下春化处理 2 天。
  2. 种子灭菌
    1. 在无菌条件下，配制 10 mL 50% (v/v) 次氯酸钠溶液，并加入约 20 µL Tween 20。进行种子灭菌时，吸除吸胀后种子中的水分，向微型离心管中加入 1 mL 次氯酸钠溶液，室温孵育 5 分钟。
    2. 用移液器吸除次氯酸钠溶液。
    3. 用 1 mL 无菌水清洗种子并重悬。待种子沉降至管底后，吸除上清。重复步骤 1.6 和步骤 1.7 七次。
    4. 将种子重悬于无菌的 0.1% 琼脂糖溶液中。
  3. 种子点板
    1. 配制 1 L 含维生素和 1.0 g/L 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MS）的 Murashige & Skoog 基本培养基：将 5.43 g 粉末溶于 500 mL 蒸馏水中，用氢氧化钾（KOH）调节 pH 至 5.6–5.8，再加蒸馏水定容至 1 L。
      1. 将液体培养基均分为两份，每份 500 mL，分别倒入含有磁力搅拌子的 1 L 三角瓶中。每瓶加入 5 g 琼脂粉，制成 1% (w/v) 琼脂溶液。
      2. 121 °C、15 psi 条件下高压灭菌 30 分钟，然后在缓慢搅拌下冷却至室温。冷却后，向每个方形培养皿中倒入 25 mL MS 琼脂培养基，静置使其凝固。
        注：这些 Murashige & Skoog 基本培养基平板含有 1% MS 培养基（含维生素）和 1% 琼脂，用于测试突变体的培养。
    2. 用剃刀片切去 200 µL 移液枪头的尖端。使用 200 µL 微量移液器，将一粒种子点在方形 MS 平板（图 1）上每个测试突变体或基因型对应方格（1 cm2）的中央。
      注：1 cm × 1 cm 的方格有助于保持幼苗之间间距均匀，避免重叠，这对后续的荧光成像与分析至关重要。
    3. 种子点板完成后，用医用胶带将培养皿盖子密封，然后置于生长室中，培养条件如下所述。

2. 植物生长与低 CO2 处理

  1. 在20 °C、光照周期8小时（光照强度120 µmol·m−2s−1）和16小时黑暗（18 °C）条件下培养植物7-9天。在第6天检查植物，以确定其是否已生长至适合成像的大小。接种后第8天，将植物暴露于低CO2环境中。
  2. 低CO2处理
    1. 培养7-9天后，将八块培养板中的四块从常温生长箱条件转移至光呼吸条件：20 °C、200 µmol·m−2s−1的持续光照和低CO2环境，持续12小时。
    2. 使用一个密闭透明容器构建低CO2环境，容器底部放置100 g的苏打石灰。将该容器置于与对照组相同的生长箱内。对照组植物则在常温CO2浓度和120 µmol·m−2s−1光照条件下培养12小时。

3. 配置荧光成像系统

  1. 将检测板（根据第1节和第2节制备）置于荧光成像系统的摄像头正下方固定距离处，居中放置。
  2. 在仪器软件中，进入实时窗口，勾选测量闪光选项，以开启非作用光测量闪光。
  3. 点击缩放和聚焦工具，直至获得完整且清晰的图像。为此，可使用载物台或支架调节植物与摄像头之间的距离。整个实验过程中，保持缩放、聚焦以及与摄像头的距离恒定。
  4. 将电子快门值设为0，并调节灵敏度，使荧光信号处于200–500 数字单位范围内。
    注意：较低的电子快门值（0–1）可确保测量闪光为非作用光，而较高的值（2）可提高图像分辨率。
  5. 将光量计置于先前用于调整摄像头设置的相同位置。
  6. 在实时窗口中，勾选饱和脉冲选项，以启动持续800 ms的饱和脉冲。每次施加新的脉冲时，请务必重新勾选该选项。
  7. 使用滑块调节饱和脉冲相对功率的百分比，直至光量计读数为6,000–8,000 µmol·m−2s−1。

4. 设计量子产率程序

  1. 导入成像系统的标准操作工具。
    包含 default.inc
    包含 light.inc
    注意：本实验中用作参考的程序语法适用于 FluorCam 成像系统。
  2. 根据配置的光照设置定义以下全局变量：
    快门 = 0
    灵敏度 = 40
    65 超级
  3. 包含数据记录的时间步长：
    TS = 20 ms
  4. 在暗适应状态下，通过采样荧光收集Fo值。
    F0持续时间 = 2秒；
    F0周期 = 200毫秒；
    注意： F0 持续时间 定义记录暗适应荧光的时间范围。 F0周期 定义了暗适应荧光测量重复进行的时间间隔。
  5. 将 Fo 测量值记录到数据表中。
    <0，F0周期..F0持续时间>=>mfmsub
    <0秒>->检查点"开始Fo"
    <基频持续时间 - 基频周期>=>检查点"endFo";
    何处 < , > 表示由时间索引的荧光值集合；=> 将测量值存储在系统文件中； mfmsub 代表该实验的完整数据集；以及 检查点 为特定测量数据创建子集，例如 开始Fo.
  6. 在施加饱和脉冲后，通过采样荧光收集并储存 Fm 测量值。
    脉冲持续时间=960ms; ##
    a1=F0持续时间 + 40毫秒
    a2 = a1 + 480 ms；
    <a1>=>SatPulse（脉冲持续时间）；
    <a1 + 80毫秒，a1 + 160毫秒，a1 + 脉冲持续时间>=>mfmsub
    <a1 + 脉冲持续时间 + 80 ms>=>mfmsub
    <a2>=>检查点"开始Fm"
    <a1 + 脉冲持续时间 - 80毫秒>=>检查点"endFm"
    <a2 + 80毫秒>=>检查点"时间可视化";
    ​何处 a1 和 a2 是用于协调采样时间与饱和脉冲的变量； a1 表示 Fm 测量的起始时间；以及 a2 表示脉冲的中点时刻。

5. 测定处理样品的量子产率

  1. 处理结束后，立即用铝箔将培养皿覆盖，避光适应15分钟。取下铝箔，使用脉冲振幅调制式叶绿素荧光仪测定光系统II的量子产额。随后，将幼苗培养皿直接置于相机下方，运行GitHub仓库中提供的量子产额检测程序。
  2. 从GitHub下载quantum_yield程序（https://github.com/South-lab/fluorescent-screen），或使用第4节中设计类似的程序。通过点击文件夹图标并在软件中导航至文件所在位置，使用荧光仪的软件打开该程序文件。
  3. 点击红色闪电图标运行量子产额程序。
  4. 程序运行完成后，进入预分析窗口。使用选择工具在培养皿图像上逐个框选每株幼苗的所有像素，将培养皿划分为单个幼苗区域。点击背景排除，去除所有选中的背景像素，仅保留幼苗区域。
  5. 点击分析，生成培养皿图像中每株幼苗的荧光数据。手动调整荧光值范围，使所有培养皿的最小值和最大值显示一致。
  6. 在实验 | 导出 | 数值选项卡中，点击数值-平均。选择全部数据和按列，然后点击确定，生成包含每株幼苗量子产额（QY）测量值的文本文件。

6. 打开数据文件

  1. 将文本文件在电子表格中打开以进行分析。在显示区域编号、像素大小、Fm、Ft、Fq 和 QY 的标题中，确定核心基因型（WT 或测试突变体）的区域编号及 QYmax。相对于野生型进行成对 t 检验以确定显著性。当 p 值低于 0.05 时，数据被视为具有显著差异。

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结果

结果显示了野生型（WT）和测试突变体在正常和低 CO2 条件下筛选所获得的原始图像和荧光图像。每个植株均以区域编号标记，并提供相应的荧光读数 QY 值。数据以文本文件形式导出，可导入电子表格进行分析（见补充表 S1）。选择突变体品系 plgg1-1 和 abcb26 用于展示与光呼吸胁迫相关基因的阳性与阴性鉴定结果。PLGG1 编码 RuBP 氧化后光呼吸途径中的第一个转运蛋白6，而 ABCB26 被认为编码一种抗原转运蛋白，目前尚未发现其参与光呼吸过程11。野生型与突变体的暗适应 Fv/Fm QY 效率通过箱线图进行可视化展示。为检验野生型与测试突变体之间的统计学差异，采用成对 t-检验，显著性水平设为 p 值 < 0.05。本研究选用具有较低 QY Fv/Fm 的光呼吸突变体作为测试样本，以评估该筛选方法的有效性。结果表明，测试突变体的 QY 效率显著低于野生型。图 3B

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讨论

本文所述实验方法具有一些优势和局限性。其优势之一是该方法可同时筛选大量植物幼苗，但在接种和培养过程中需采取一定预防措施，以防止植物培养基平板受到污染。因此，必须使用医用胶带密封拟南芥培养平板。本实验的另一优势在于，与先前发表的研究8相比，其光呼吸胁迫处理时间更短，仅为12小时。缩短处理时间有助于更清晰地区分野生型（WT）与所选突变体之间的Fv/Fm差异。然而，处理时间可能需要根据突变株表型的严重程度以及实验装置中CO2的浓度进行适当调整。但该方法的一个局限性在于，要求叶片具有足够大的面积，以便叶绿素荧光仪能够测量并计算Fv/Fm值。通过调整待测幼苗的初始生长时间，可确保荧光成像仪在成像时每株幼苗均有足够的叶面积可供测量，同时避免叶片在成像过程中相互重叠。为保持叶片大小和叶角度的一致性，必须在幼苗长出第一对真叶时进行成像。可通过提高相机的快门速度和灵敏度来改善图像分辨率，从而更好地区分相邻像素；但若灵敏度过高，则会导致相机过度曝光，产生虚假的荧光最大值。因此，可能需要进行优化和故障排查，以在图像分辨率与荧光值之间达到平衡。

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披露

作者无竞争性财务利益或利益冲突。

致谢

本研究由路易斯安那州立大学董事会资助（AWD-AM210544）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 微量离心管VWR10810-070种子灭菌容器
琼脂糖VWR9012-36-6用于悬浮种子以便于接种的化学物质
拟南芥 种子（abcb26)ABRC，通过 TAIR www.arabidopsis.org 订购SALK_085232实验组所用的拟南芥种子
拟南芥 种子（plgg1-1)ABRC，通过 TAIR www.arabidopsis.org 订购SALK_053469C亲本拟南芥种子 
拟南芥 种子（WT）ABRC，通过 TAIR www.arabidopsis.org 订购Col-0拟南芥野生型种子作为对照组
 漂白 clorox通用漂白剂 用于种子灭菌的化学物质
碳石灰吸收剂Medline 产品S232-104-001CO2 吸收剂
封闭式FluorCamPhoton Systems InstrumentsFC 800-C荧光成像仪
FluoroCam FC 800-CPhoton Systems Instruments封闭式 FluorCam FC 800-C/1010-S荧光成像仪
FluoroCam7Photon Systems Instruments封闭式 FluorCam FC 800-C/1010-S荧光图像分析软件
Gelzan（植物琼脂）Phytotech 实验室71010-52-1用于将MS培养基固化成平板的化学物质 
1 L 玻璃烧瓶FisherbrandFB5011000用于制备和高压灭菌MS培养基的容器
生长室卡龙7317-50-2用于植物培养的生长室
穆拉希吉 &含维生素的MS基本培养基 & 1.0 g/L MES (MS)Phytotech 实验室M5531 拟南芥幼苗的生长培养基 
氢氧化钾（KOH）Phytotech 实验室1310-58-3配制1 M溶液用于pH调节
蜘蛛灯明纬企业XLG-100-H-AB光检测实验中使用的光源 
带网格方形培养皿，无菌Simport ScientificD21016用于盛放拟南芥幼苗的MS培养基
手术胶带3M1530-1用于密封培养板的胶带
吐温20伯乐（Bio-Rad） 9005-64-5用于辅助种子灭菌的表面活性剂

参考文献

  1. Peterhansel, C., et al. Photorespiration. Arabidopsis Book. 8, 0130(2010).
  2. Bordych, C., Eisenhut, M., Pick, T. R., Kuelahoglu, C., Weber, A. P. Co-expression analysis as tool for the discovery of transport proteins in photorespiration. Plant Biology. 15 (4), 686-693 (2013).
  3. Eisenhut, M., Pick, T. R., Bordych, C., Weber, A. P. Towards closing the remaining gaps in photorespiration--the essential but unexplored role of transport proteins. Plant Biology. 15 (4), 676-685 (2013).
  4. Walker, B. J., VanLoocke, A., Bernacchi, C. J., Ort, D. R. The costs of photorespiration to food production now and in the future. Annual Review of Plant Biology. 67 (1), 107-129 (2016).
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  6. Pick, T. R., et al. PLGG1, a plastidic glycolate glycerate transporter, is required for photorespiration and defines a unique class of metabolite transporters. Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 110 (8), 3185-3190 (2013).
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  9. Ogawa, T., Sonoike, K. Screening of mutants using chlorophyll fluorescence. Journal of Plant Research. 134 (4), 653-664 (2021).
  10. Kleffmann, T., et al. The Arabidopsis thaliana chloroplast proteome reveals pathway abundance and novel protein functions. Current Biology. 14 (5), 354-362 (2004).
  11. Hempel, J. J. Molecular characterization of the plastid-localized ABC protein TAP1 in Arabidopsis thaliana. , University of Stavanger. Ph.D. thesis (2018).

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