我们描述了一种利用叶绿素荧光技术检测植物在低CO2处理后光合效率变化的方法。
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本文内容
摘要
摘要
光合作用和光呼吸是植物初级代谢中最大的碳通量过程，对植物的生存至关重要。几十年来，许多与光合作用和光呼吸相关的关键酶和基因已被深入研究，但这些生化途径的某些方面及其与多种亚细胞过程的相互作用尚未完全阐明。大量鉴定植物代谢中重要基因和蛋白质的研究是在高度受控的环境中进行的，而这种环境可能无法充分反映光合作用和光呼吸在自然和农业环境中的实际功能状态。鉴于非生物胁迫会导致光合效率下降，因此有必要开发一种高通量筛选方法，能够同时监测非生物胁迫及其对光合作用的影响。
因此，我们开发了一种相对较快的方法，通过叶绿素荧光分析和低 CO2 筛选，检测非生物胁迫诱导的光合效率变化，从而鉴定在光呼吸中发挥作用但尚未被表征的基因。本文描述了一种研究转基因 DNA（T-DNA）敲除突变体中光合效率变化的方法，所用材料为拟南芥（Arabidopsis thaliana）。该方法同样适用于筛选乙基甲磺酸（EMS）诱导的突变体或抑制子筛选。利用此方法可鉴定出参与植物初级代谢和非生物胁迫响应的候选基因。该方法所得数据有助于揭示基因功能，而这些功能可能只有在暴露于增强的胁迫环境时才会显现。
引言
农田中常见的非生物胁迫条件会通过降低光合效率而对作物产量产生负面影响。热浪、气候变化、干旱和土壤盐碱化等有害环境条件可引发非生物胁迫，改变CO2的可利用性，并削弱植物对高光强胁迫的响应能力。地球上最大的两个陆地碳通量过程是光合作用和光呼吸，二者对植物生长和作物产量至关重要。参与这些过程的许多重要蛋白质和酶已在实验室条件下得到表征，并在基因水平上被鉴定1。尽管在理解光合作用和光呼吸方面已取得显著进展，但仍有许多步骤尚未明确，包括植物细胞器之间的物质转运过程2,3。
光呼吸是植物中仅次于光合作用的第二大碳通量，当酶Rubisco将氧气而非二氧化碳固定到核酮糖-1,5-二磷酸（RuBP）上时，该过程即开始，生成抑制性化合物2-磷酸乙醇酸（2PG）1。为了减轻2PG的抑制效应并回收先前固定的碳，C3植物进化出了多细胞器参与的光呼吸过程。光呼吸将两分子2PG转化为一分子3-磷酸甘油酸（3PGA），后者可重新进入C3碳固定循环1。因此，光呼吸仅能回收由2PG生成过程中先前固定的75%的碳，并在此过程中消耗ATP。结果，光呼吸过程对光合作用造成了显著的拖累，使其效率降低10%至50%，具体程度取决于水分供应状况....
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方案
1. 种子准备与灭菌
注意：种子准备包括种子吸胀和种子灭菌。需要注意的是，所有这些步骤都必须在超净工作台中进行，以保持无菌条件。所有必要的材料、试剂和培养基都必须经过高压灭菌（参见材料表）。
- 种子吸胀与春化处理
注：所用种子品系为 plgg1-1 (salk_053463)、abcb26 (salk_085232) 以及野生型（WT, Col-0）。- 将种子分装至 1.5 mL 微型离心管中。在超净工作台中用无菌水浸泡种子，并于 4 °C 黑暗条件下春化处理 2 天。
- 种子灭菌
- 在无菌条件下，配制 10 mL 50% (v/v) 次氯酸钠溶液，并加入约 20 µL Tween 20。进行种子灭菌时，吸除吸胀后种子中的水分，向微型离心管中加入 1 mL 次氯酸钠溶液，室温孵育 5 分钟。
- 用移液器吸除次氯酸钠溶液。
- 用 1 mL 无菌水清洗种子并重悬。待种子沉降至管底后，吸除上清。重复步骤 1.6 和步骤 1.7 七次。
- 将种子重悬于无菌的 0.1% 琼脂糖溶液中。
- 种子点板
- 配制 1 L 含维生素和 1.0....
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结果
结果显示了野生型（WT）和测试突变体在正常和低 CO2 条件下筛选所获得的原始图像和荧光图像。每个植株均以区域编号标记，并给出相应的荧光读数 QY 值。数据以文本文件形式导出，可在电子表格中打开进行分析（见补充表 S1）。选择突变体品系 plgg1-1 和 abcb26 用于展示与光呼吸胁迫相关基因的阳性与阴性鉴定结果。PLGG1 编码 RuBP 氧化后光呼吸途径中的第一个转运蛋白6，而 ABCB26 被认为编码一种抗原转运蛋白，目前尚未发现其参与光呼吸过程11。野生型与突变体的暗适应 Fv/Fm QY 效率通过箱线图（box and whisker plots）进行可视化展示。为检验野生型与测试突变体之间的统计学差异，采用成对 t 检验，显著性水平设为 p 值 < 0.05。本研究使用已知 QY Fv/Fm 降低的光呼吸突变体作为测试样本，以验证该筛选方法的有效性。结果表明，测试突变体的 QY 效率显著低于野生型。
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讨论
本文所述实验方法具有一些优势和局限性。其优势之一是该方法可同时筛选大量植物幼苗，但在接种和培养过程中需采取一定预防措施，以防止植物培养基平板受到污染。因此，必须使用医用胶带密封拟南芥培养平板。本实验的另一优势在于，与先前发表的研究8相比，其光呼吸胁迫处理时间更短，仅为12小时。缩短处理时间有助于更清晰地区分野生型（WT）与所选突变体之间的Fv/Fm差异。然而，处理时间可能需要根据突变株表型的严重程度以及实验装置中CO2的浓度进行适当调整。但该方法的一个局限性在于，要求叶片具有足够大的面积，以便叶绿素荧光仪能够测量并计算Fv/Fm值。通过调整待测幼苗的初始生长时间，可确保荧光成像仪在成像时每株幼苗均有足够的叶面积可供测量，同时避免叶片在成像过程中相互重叠。为保持叶片大小和叶角度的一致性，必须在幼苗长出第一对真叶时进行成像。可通过提高相机的快门速度和灵敏度来改善图像分辨率，从而更好地区分相邻像素；但若灵敏度过高，则会导致相机过度曝光，产生虚假的荧光最大值。因此，可能需要进行优化和故障排查，以在图像分辨率与荧光值之间达到平衡。
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披露
作者无竞争性财务利益或利益冲突。
致谢
本研究由路易斯安那州立大学董事会资助（AWD-AM210544）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 微量离心管 | VWR | 10810-070 | 种子灭菌容器 |
| 琼脂糖 | VWR | 9012-36-6 | 用于悬浮种子以便于接种的化学物质 |
| 拟南芥 种子（abcb26) | ABRC，通过 TAIR www.arabidopsis.org 订购 | SALK_085232 | 实验组所用的拟南芥种子 |
| 拟南芥 种子（plgg1-1) | ABRC，通过 TAIR www.arabidopsis.org 订购 | SALK_053469C | 亲本拟南芥种子 |
| 拟南芥 种子（WT） | ABRC，通过 TAIR www.arabidopsis.org 订购 | Col-0 | 拟南芥野生型种子作为对照组 |
| 漂白 | clorox | 通用漂白剂 | 用于种子灭菌的化学物质 |
| 碳石灰吸收剂 | Medline 产品 | S232-104-001 | CO2 吸收剂 |
| 封闭式FluorCam | Photon Systems Instruments | FC 800-C | 荧光成像仪 |
| FluoroCam FC 800-C | Photon Systems Instruments | 封闭式 FluorCam FC 800-C/1010-S | 荧光成像仪 |
| FluoroCam7 | Photon Systems Instruments | 封闭式 FluorCam FC 800-C/1010-S | 荧光图像分析软件 |
| Gelzan（植物琼脂） | Phytotech 实验室 | 71010-52-1 | 用于将MS培养基固化成平板的化学物质 |
| 1 L 玻璃烧瓶 | Fisherbrand | FB5011000 | 用于制备和高压灭菌MS培养基的容器 |
| 生长室 | 卡龙 | 7317-50-2 | 用于植物培养的生长室 |
| 穆拉希吉 &含维生素的MS基本培养基 & 1.0 g/L MES (MS) | Phytotech 实验室 | M5531 | 拟南芥幼苗的生长培养基 |
| 氢氧化钾（KOH） | Phytotech 实验室 | 1310-58-3 | 配制1 M溶液用于pH调节 |
| 蜘蛛灯 | 明纬企业 | XLG-100-H-AB | 光检测实验中使用的光源 |
| 带网格方形培养皿，无菌 | Simport Scientific | D21016 | 用于盛放拟南芥幼苗的MS培养基 |
| 手术胶带 | 3M | 1530-1 | 用于密封培养板的胶带 |
| 吐温20 | 伯乐（Bio-Rad） | 9005-64-5 | 用于辅助种子灭菌的表面活性剂 |
参考文献
- Peterhansel, C., et al. Photorespiration. Arabidopsis Book. 8, 0130(2010).
- Bordych, C., Eisenhut, M., Pick, T. R., Kuelahoglu, C., Weber, A. P. Co-expression analysis as tool for the discovery of transport proteins in photorespiration. Plant Biology. 15 (4), 686-693 ....
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重印与许可
