通过叶绿素荧光分析评估光呼吸突变体的光合效率

Summary

我们描述了一种使用叶绿素荧光测量低CO₂ 处理后植物光合效率变化的方法。

Abstract

光合作用和光呼吸是植物初级代谢中最大的碳通量，是植物生存所必需的。几十年来，许多对光合作用和光呼吸很重要的酶和基因已经得到了很好的研究，但这些生化途径的某些方面及其与几个亚细胞过程的串扰尚未完全了解。许多确定植物代谢中重要基因和蛋白质的工作都是在高度受控的环境中进行的，这些环境可能无法最好地代表自然和农业环境中的光合作用和光呼吸功能。考虑到非生物胁迫导致光合作用效率受损，有必要开发一种可以监测非生物胁迫及其对光合作用影响的高通量屏幕。

因此，我们开发了一种相对快速的方法来筛选非生物胁迫诱导的光合效率变化，该方法可以使用叶绿素荧光分析和低CO₂ 筛选来识别在光呼吸中起作用的未表征基因。本文描述了一种研究 拟南芥中转移的DNA（T-DNA）敲除突变体光合效率变化的方法。相同的方法可用于筛选甲磺酸乙酯（EMS）诱导的突变体或抑制因子筛选。利用该方法可以鉴定候选基因，以进一步研究植物初级代谢和非生物胁迫反应。来自这种方法的数据可以深入了解基因功能，直到暴露于增加的压力环境之前可能无法识别。

Introduction

农民田间常见的非生物胁迫条件会降低光合效率，从而对作物产量产生负面影响。热浪、气候变化、干旱和土壤盐度等有害环境条件会导致非生物胁迫，从而改变 CO₂ 的可用性并降低植物对高光胁迫的反应。两个最大的陆地碳通量是光合作用和光呼吸，这对植物生长和作物产量至关重要。参与这些过程的许多重要蛋白质和酶已在实验室条件下进行了表征，并在遗传水平^上进行了鉴定1。尽管在了解光合作用和光呼吸方面取得了很大进展，但许多步骤，包括植物细胞器之间的运输，仍未表征^2，3。

光呼吸是植物中仅次于光合作用的第二大碳通量，当Rubisco酶将氧气而不是二氧化碳固定到核酮糖1，5二磷酸（RuBP）上，产生抑制性化合物2-磷酸乙醇酸酯（2PG）¹时开始。为了尽量减少2PG的抑制作用并回收先前固定的碳，C3植物已经进化出光呼吸的多器官过程。光呼吸将两个2PG分子转化为一个3-磷酸甘油酸（3PGA）分子，可以重新进入C3固碳循环¹。因此，光呼吸仅从2PG的产生中转换了先前固定碳的75%，并在此过程中消耗了ATP。因此，光呼吸过程对光合作用过程有10%-50%的显着拖累，具体取决于水分的可用性和生长季节的温度

Protocol

1. 种子制备和灭菌

注意:种子制备包括种子吸收和种子灭菌。重要的是要注意，所有这些步骤都将在层流罩中进行，以保持无菌条件。所有必要的材料、试剂和生长培养基必须高压灭菌（参见 材料表）。

1. 种子吸收和分层
   注意:使用的种子系是 plgg1-1 （salk_053463）， abcb26 （salk_085232）和野生型（WT，Col-0）。
   1. 将种子分配到 1.5 mL 微量离心管中。将种子在层流罩中的无菌水中吸收，并在4°C下在黑暗中分层2天。
2. 种子灭菌
   1. 在无菌条件下，制备 10 mL 的 50% （v/v） 漂白剂溶液，并加入约 20 μL 吐温 20。对于种子灭菌，从吸收的种子中除去水，将1mL漂白剂溶液加入微量离心管中，并在室温下孵育5分钟。
   2. 用移液管取出漂白剂溶液。
   3. 用 1 mL 无菌水冲洗种子以重悬。种子沉降到底部后取出水。重复步骤 1.6 和步骤 1.7 七次。
   4. 将种子重悬于无菌0.1%琼脂糖溶液中。
3. 种子镀层
   1. 将 5.43 g 粉末加入 500 mL 蒸馏水中，制成 1 L 体积的含有维生素的 Murashige & Skoog 基础培养基和....

Results

结果显示了来自WT和测试突变体的环境和低CO₂筛选的原始和荧光图像的板图像。每个幼苗按面积编号标记，相应的荧光读数为QY。数据导出为文本文件，可以在电子表格中打开进行分析（请参阅补充表S1）。选择突变系plgg1-1和abcb26来证明与光呼吸应激相关的基因的阳性和阴性鉴定。PLGG1编码RuBP⁶氧合后通路中的第一个转运蛋白，而ABCB26被认为编码未知参与光呼吸¹¹的抗原转运蛋白。WT和突变体的暗适应Fv/Fm QY效率通过箱形图和晶须图可视化。为了检验WT和测试突变体之间的统计差异，使用了成对t检验，p值<0.05。在这里，我们使用QY Fv/Fm降低的光呼吸突变株系作为测试突变体来检查筛选方法的效率。结果表明，测试突变体的QY效率显著低于WT。 图3B显示了在低CO₂下plgg1-1的可变与最大荧光（Fv/Fm）比值显着降.......

Discussion

本文概述的实验方法具有一些优点和局限性。一个优点是这种方法可以筛选许多植物幼苗，尽管必须采取一些预防措施以防止在电镀和生长过程中污染植物培养基板。因此，用手术胶带密封拟南芥板至关重要。该实验的另一个优点是，与先前^{发表的工作相比}，它具有更短的12小时光呼吸应激期8。治疗时间的减少是为了更好地区分WT和选定突变体之间的Fv/Fm差异。治疗时间可能需要根据突变菌株中表型的严重程度和实验设置中CO₂ 的水平而变化。然而，一个限制是这种方法需要足够大的叶面积，以便荧光计进行测量并计算Fv/Fm值。调整测试幼苗的初始生长时间将确保荧光计成像仪有足够的叶面积来测量每个幼苗，而不会在成像过程中叶子重叠。幼苗必须在第一片真叶处成像，以保持叶子大小和叶角均匀。通过提高相机的快门速度和灵敏度，可以提高图像的分辨率。相邻像素将更好地区分;但是，过多地增加感光度会使相机过度曝光并导致错误的荧光最大值。可能需要进行优化和故障排除以平衡分辨率和荧光值。

在标准化程序中筛选光合突变体的能力很重要。它可以允许一种一致的高通量方法来鉴定具有光合作.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL 微量离心管	VWR	10810-070	种子灭菌容器
脂糖	VWR	9012-36-6	悬浮种子以便于电镀
的化学品拟南芥种子 （abcb26）	ABRC，通过 TAIR www.arabidopsis.org 订购	SALK_085232	拟南芥种子用作实验组
拟南芥种子 （plgg1-1）	ABRC，通过 TAIR www.arabidopsis.org	SALK_053469C	亲本拟南芥种子订购
拟南芥种子 （WT）	ABRC，通过 TAIR www.arabidopsis.org	Col-0	拟南芥野生型种子
用作对照组 漂白剂	Corox	通用漂白剂	用于种子消毒的化学品
碳酸盐吸收剂	Medline 产品	S232-104-001	CO2 吸收剂
封闭式 FluorCam	光子系统仪器	FC 800-C	荧光成像仪
FluoroCam FC 800-C	光子系统仪器	封闭式 FluorCam FC 800-C/1010-S	荧光成像仪
FluoroCam7	光子系统仪器	封闭式 FluorCam FC 800-C/1010-S	荧光图像分析软件
Gelzan（植物琼脂）	Phytotech labs	71010-52-1	用于将 MS 培养基固化为板的化学品
玻璃培养瓶 1 L	Fisherbrand	FB5011000	用于制作和高压灭菌 MS 培养基
生长室	caron	7317-50-2	用于植物生长的生长室
Murashige &含维生素 & 的 Skoog 基础培养基1.0 克/升 MES （MS）	Phytotech labs	M5531	拟南芥幼苗生长培养基
氢氧化钾 （KOH）	Phytotech labs	1310-58-3	制成 1 M 溶液，用于调节 pH
值蜘蛛灯	Mean Well Enterprises	XLG-100-H-AB	灯用于光分析
带网格的方形培养皿，无菌	Simport Scientific	D21016	用于保存拟南芥幼苗的 MS 培养基
手术胶带	3M	1530-1	胶带用于密封
板 20	生物辐射	9005-64-5	用于辅助种子灭菌的表面活性剂