本方案描述了对小鼠脑组织游离切片进行切片、染色和成像的方法，随后详细介绍了星形胶质细胞区域体积以及星形胶质细胞区域重叠或拼接的分析方法。
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本文内容
摘要
摘要
星形胶质细胞具有惊人的形态复杂性，使其能够与大脑内的几乎所有类型的细胞和结构相互作用。通过这些相互作用，星形胶质细胞主动调控多种关键的大脑功能，包括突触形成、神经传递以及离子稳态。在啮齿类动物大脑中，星形胶质细胞在出生后的前三周内体积和复杂性逐渐增加，并建立起彼此独立、不重叠的结构域，以覆盖整个大脑。本实验方案提供了一种成熟的方法，用于分析小鼠脑组织游离切片中星形胶质细胞的结构域体积及其拼接（tiling）情况。首先，本方案描述了组织取材、冷冻切片以及游离脑组织切片免疫染色的操作步骤。其次，本方案介绍了如何使用商业化的图像分析软件进行图像采集，并分析星形胶质细胞结构域体积及结构域重叠体积。最后，本文讨论了这些方法的优势、重要注意事项、常见问题及局限性。该方案需要对星形胶质细胞进行稀疏或嵌合式荧光标记的脑组织样本，且设计为可配合常规实验室设备、共聚焦显微镜以及商业化图像分析软件使用。
引言
星形胶质细胞是具有复杂分支结构的细胞，在大脑中执行多种重要功能1在小鼠大脑皮层中，放射状胶质干细胞在胚胎晚期和出生后早期阶段产生星形胶质细胞2在出生后的前三周内，星形胶质细胞在体积和复杂性上逐渐增大，发育出数千条细小分支，直接与突触相互作用。1同时，星形胶质细胞与邻近的星形胶质细胞相互作用，形成独立且不重叠的区域，以覆盖整个大脑3，同时保持通信 通过 缝隙连接通道4. 损伤或创伤后，许多疾病状态下星形胶质细胞的形态和结构均受到破坏5，表明这些过程对大脑正常功能的重要性。在正常发育、衰老及疾病过程中分析星形胶质细胞的形态学特征，可为星形胶质细胞的生物学与生理学特性提供重要见解。此外，在基因操作后对星形胶质细胞形态进行分析，是揭示调控星形胶质细胞形态复杂性建立与维持的细胞与分子机制的重要工具。
小鼠脑内星形胶质细胞形态的分析因星形胶质细胞分支的复杂性及其拼接式分布特性而变得复杂。使用胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）这一星形胶质细胞特异性标志物进行抗体染色，仅能标记出主要分支，严重低估了星形胶质细胞形态的复杂程度
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方案
所有小鼠的使用均遵循北卡罗来纳大学教堂山分校机构动物护理与使用委员会（IACUC）以及比较医学部的规定（IACUC方案编号21-116.0）。实验使用出生后21天（P21）的雄性和雌性小鼠。CD1小鼠购自商业来源（材料表），MADM9 WT:WT和MADM9 WT:KO小鼠此前已有描述9。
注意：本实验方案需要星形胶质细胞稀疏表达荧光蛋白的脑组织。荧光蛋白的表达可通过遗传学方法、病毒转导或电穿孔引入。稀疏标记星形胶质细胞的具体方法详见此前已发表的研究与实验方案1,7,8,9,10,11,12,13。
1. 组织采集与制备
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结果
图1 展示了本实验方案主要步骤和工作流程的示意图。 图2 显示使用图像分析软件生成表面、在表面附近生成斑点以及生成凸包等关键步骤的截图。 图3 展示了该技术在确定星形胶质细胞区域重叠/镶嵌中的应用。在 图 4此前已发表论文中的代表性结果9 展示本方案的应用。在 图 4A 和 图 4B，敲低星形胶质细胞富集的细胞黏附分子 hepaCAM 显著降低了星形胶质细胞的占域体积。在 图 4C 和 图4D采用双标记嵌合体分析（MADM）技术，在小鼠皮层中引入稀疏的嵌合标记及同步的遗传修饰。通过MADM技术，成功构建了野生型星形胶质.......
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讨论
本方案描述了一种用于分析小鼠大脑皮层星形胶质细胞占据体积及星形胶质细胞拼接行为的成熟方法，详细阐述了从灌注到图像分析的全部主要步骤。该方案需要使用在星形胶质细胞稀疏或嵌合表达荧光蛋白的小鼠脑组织。除这一要求外，任何年龄的小鼠均可用于本方案，仅需对灌注参数和包埋模具中添加的冷冻介质体积进行微小调整。尽管已有其他方法发表用于分析脑组织切片中星形胶质细胞的分支复杂性与体积7,11，但本方案具有若干独特优势。首先，本方案提供了一段自定义代码，可用于获取星形胶质细胞占据体积。星形胶质细胞占据体积与星形胶质细胞体积是不同的测量指标，前者测量的是星形胶质细胞所占据的全部空间，而不考虑其分支复杂程度。此外，本方案还阐述了如何利用星形胶质细胞占据体积的测量方法来计算星形胶质细胞占据区域的重叠体积，从而评估星形胶质细胞的拼接行为。最后，本方案详细讨论了可能影响星形胶质细胞占据体积及数据采集的潜在变量，包括封片条件、样本储存条件，以及成像与分析中的纳入与排除标准。除了这些独特特点外，本方案的许多部分——包括灌注、冷冻切片以及游离切片的免疫染色.......
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致谢
显微成像在北卡罗来纳大学神经科学显微成像中心（RRID:SCR_019060）完成，部分经费来自美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所（NIH-NINDS）神经科学中心支持基金 P30 NS045892 和美国国立卫生研究院儿童健康与人类发育研究所（NIH-NICHD）智力与发育障碍研究中心支持基金 U54 HD079124。图1使用 BioRender.com 制作。图4中的图像和数据转载自先前发表的文章9，已获得出版方许可。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| #5 镊子 | Roboz | RS-5045 | |
| 1 mL TB 注射器 | Becton Dickinson (BD) | 309623 | |
| 10x TBS（Tris 缓冲盐水） | 30 g Tris，80 g NaCl，2 g KCl，用 HCl 调至 pH 7.4，加 dH2O 定容至 1 L；室温（RT）保存 | ||
| 1x TBS | 100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O；室温保存 | ||
| 1x TBS + 肝素 | 28.2 mg 肝素 + 250 mL 1x TBS；4 °C 保存 | ||
| 12 孔板 | Genesee Scientific | 25-106MP | |
| 24 孔板 | Genesee Scientific | 25-107MP | |
| TBS 中含 30% 蔗糖 | 15 g 蔗糖，用 1x TBS 定容至 50 mL；4 °C 保存 | ||
| TBS 中含 4% PFA（多聚甲醛） | 40 g PFA，4–6 粒 NaOH 小球，100 mL 10x TBS，加 dH2O 定容至 1 L；4 °C 保存 | ||
| Avertin | 0.3125 g 三溴乙醇，0.625 mL 甲基丁醇，加 dH2O 定容至 25 mL；4 °C 保存；配制后 2 周内弃用 | ||
| 封闭和抗体缓冲液 | 含 10% 山羊血清的 TBST；4 °C 保存 | ||
| CD1 小鼠 | Charles River | 022 | |
| 脑组织收集管 | Fisher Scientific | 03-337-20 | |
| 共聚焦图像采集软件 | Olympus | FV31S-SW | |
| 共聚焦显微镜 | Olympus | FV3000RS | |
| 盖玻片 | Fisher Scientific | 12544E | |
| 冷冻切片机 | Thermo Scientific | CryoStar NX50 | |
| 冷冻切片机刀片 | Thermo Scientific | 3052835 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| 包埋模具 | Polysciences | 18646A-1 | |
| 冷冻介质 | 30% 蔗糖:OCT 按 2:1 混合；室温保存 | ||
| GFP 抗体 | Aves Labs | GFP1010 | |
| 甘油 | Thermo Scientific | 158920010 | |
| 山羊抗鸡 IgG 488 | Invitrogen | A-11039 | |
| 山羊抗兔 IgG 594 | Invitrogen | A11037 | |
| 山羊血清 | Gibco | 16210064 | |
| 肝素 | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| 盐酸 | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imaris | Bitplane | N/A | 版本 9.8.0 |
| MATLAB | MathWorks | N/A | |
| 金属便当盒 | AQUARIUS | N/A | 来自 Amazon，"DIY 大型趣味盒" |
| 甲基丁醇 | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| 显微解剖剪 | Roboz | RS-5921 | |
| 封片介质 | 20 mM Tris（pH 8.0），90% 甘油，0.5% N-丙基没食子酸酯；4 °C 保存；有效期最长 2 个月 | ||
| 指甲油 | VWR | 100491-940 | |
| N-丙基没食子酸酯 | Sigma-Aldrich | 02370-100G | |
| O.C.T. | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| 镜油 | Olympus | IMMOIL-F30CC | 与显微镜/物镜配套使用 |
| 6" 手术剪 | Roboz | RS-6820 | |
| 轨道摇床 | Fisher Scientific | 88861043 | 最低所需转速：25 rpm |
| 画笔 | Bogrinuo | N/A | 来自 Amazon，"细节画笔 - 微型画笔" |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| 巴斯德吸管（5.75"） | VWR | 14672-608 | |
| 巴斯德吸管（9"） | VWR | 14672-380 | |
| 氯化钾 | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
| 剃须刀片 | Fisher Scientific | 12-640 | |
| RFP 抗体 | Rockland | 600-401-379 | |
| 切片介质 | 甘油:1x TBS 按 1:1 混合；室温保存 | ||
| 载玻片 | VWR | 48311-703 | |
| 氯化钠 | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| 氢氧化钠 | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| TBST（TBS + Triton X-100） | 含 0.2% Triton 的 1x TBS；室温保存 | ||
| 移液管 | VWR | 414004-002 | |
| 三溴乙醇 | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| 三（羟甲基）氨基甲烷 | Thermo Scientific | 424570025 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Triton X-100（高纯度） | Fisher Scientific | 50-489-120 | |
| XTSpotsConvexHull | N/A | N/A | 作为补充材料提供的自定义 XTension 插件 |
参考文献
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Akdemir, E. S., Huang, A. Y., Deneen, B. Astrocytogenesis: where, when, and how. F1000Research. 9, F1000 Faculty Rev-233 (2020).
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