星形胶质细胞区域体积与拼接在厚切游离组织切片中的分析

摘要

本方案描述了对小鼠脑组织游离切片进行切片、染色和成像的方法，随后详细介绍了星形胶质细胞区域体积以及星形胶质细胞区域重叠或拼接的分析方法。

摘要

星形胶质细胞具有惊人的形态复杂性，使其能够与大脑内的几乎所有类型的细胞和结构相互作用。通过这些相互作用，星形胶质细胞主动调控多种关键的大脑功能，包括突触形成、神经传递以及离子稳态。在啮齿类动物大脑中，星形胶质细胞在出生后的前三周内体积和复杂性逐渐增加，并建立起彼此独立、不重叠的结构域，以覆盖整个大脑。本实验方案提供了一种成熟的方法，用于分析小鼠脑组织游离切片中星形胶质细胞的结构域体积及其拼接（tiling）情况。首先，本方案描述了组织取材、冷冻切片以及游离脑组织切片免疫染色的操作步骤。其次，本方案介绍了如何使用商业化的图像分析软件进行图像采集，并分析星形胶质细胞结构域体积及结构域重叠体积。最后，本文讨论了这些方法的优势、重要注意事项、常见问题及局限性。该方案需要对星形胶质细胞进行稀疏或嵌合式荧光标记的脑组织样本，且设计为可配合常规实验室设备、共聚焦显微镜以及商业化图像分析软件使用。

引言

星形胶质细胞是具有复杂分支结构的细胞，在大脑中执行多种重要功能¹在小鼠大脑皮层中，放射状胶质干细胞在胚胎晚期和出生后早期阶段产生星形胶质细胞²在出生后的前三周内，星形胶质细胞在体积和复杂性上逐渐增大，发育出数千条细小分支，直接与突触相互作用。¹同时，星形胶质细胞与邻近的星形胶质细胞相互作用，形成独立且不重叠的区域，以覆盖整个大脑³，同时保持通信 通过 缝隙连接通道⁴. 损伤或创伤后，许多疾病状态下星形胶质细胞的形态和结构均受到破坏⁵，表明这些过程对大脑正常功能的重要性。在正常发育、衰老及疾病过程中分析星形胶质细胞的形态学特征，可为星形胶质细胞的生物学与生理学特性提供重要见解。此外，在基因操作后对星形胶质细胞形态进行分析，是揭示调控星形胶质细胞形态复杂性建立与维持的细胞与分子机制的重要工具。

小鼠脑内星形胶质细胞形态的分析因星形胶质细胞分支的复杂性及其拼接式分布特性而变得复杂。使用胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）这一星形胶质细胞特异性标志物进行抗体染色，仅能标记出主要分支，严重低估了星形胶质细胞形态的复杂程度¹。其他细胞特异性标志物，如谷氨酸转运体1（GLT-1；slc1a2）、谷氨酰胺合成酶或S100β，对星形胶质细胞分支的标记效果更佳⁶，但引入了新的问题。星形胶质细胞的支配区域基本互不重叠，但在边缘区域存在轻微重叠。由于分支结构复杂，当相邻星形胶质细胞被同一颜色标记时，无法分辨一个细胞的终点与另一个细胞的起点。利用内源性荧光蛋白对星形胶质细胞进行稀疏或嵌合式标记可同时解决这两个问题：荧光标记物可完整填充细胞，呈现所有分支结构，并允许对单个星形胶质细胞进行成像，从而将其与邻近细胞区分开来。已有多种不同策略被用于实现星形胶质细胞的稀疏荧光标记，这些方法可包含或不包含遗传操作，包括病毒注射、质粒电穿孔或转基因小鼠品系。这些策略的具体实施细节已在先前发表的研究和方案中详细描述^{1,7,8,9,10,11,12,13}。

本文介绍了一种通过稀疏标记星形胶质细胞的荧光标记小鼠脑组织来测量星形胶质细胞占位体积的方法（图1）。由于小鼠皮层中单个星形胶质细胞的平均直径约为60 µm，因此采用100 µm厚的脑切片，以提高完整捕获单个星形胶质细胞的效率。免疫染色并非必需，但建议进行以增强内源性荧光信号，便于共聚焦成像与分析。此外，免疫染色还可提高对星形胶质细胞细小分支的检测灵敏度，并减少成像过程中内源性蛋白的光漂白。为了增强抗体在厚切片中的渗透性，并在整个切片至成像过程中保持组织体积的稳定性，采用游离漂浮式脑切片。星形胶质细胞占位体积的分析使用 commercially available 图像分析软件完成。此外，本方案还描述了一种针对镶嵌式荧光标记组织切片中星形胶质细胞拼接（tiling）的分析方法，其中相邻的星形胶质细胞表达不同的荧光标记。该方案已在多项近期研究^1,8,9中成功应用，用于表征正常脑发育过程中星形胶质细胞的生长特性，以及基因操作对星形胶质细胞发育的影响。

方案

所有小鼠的使用均遵循北卡罗来纳大学教堂山分校机构动物护理与使用委员会（IACUC）以及比较医学部的规定（IACUC方案编号21-116.0）。实验使用出生后21天（P21）的雄性和雌性小鼠。CD1小鼠购自商业来源（材料表），MADM9 WT:WT和MADM9 WT:KO小鼠此前已有描述⁹。

注意：本实验方案需要星形胶质细胞稀疏表达荧光蛋白的脑组织。荧光蛋白的表达可通过遗传学方法、病毒转导或电穿孔引入。稀疏标记星形胶质细胞的具体方法详见此前已发表的研究与实验方案^{1,7,8,9,10,11,12,13}。

1. 组织采集与制备

警告：多聚甲醛（PFA）是一种危险化学品，所有涉及PFA的操作步骤均须在化学通风橱中进行。

1. 使用可注射麻醉剂（例如 Avertin；0.8 mg/kg）对小鼠进行麻醉，并通过脚趾夹捏测试确认麻醉深度。使用蠕动泵以约 3 mL/min 的速度用冰冻的 Tris 缓冲盐水（TBS）加肝素进行心脏灌注，直至肝脏变清（通常为 3–5 分钟），随后以约 3 mL/min 的速度用冰冻的 4% 多聚甲醛（PFA）TBS 溶液灌注 5 分钟。
   注：流速和时间已针对出生后第 21 天（P21）小鼠优化。对于不同年龄的小鼠，可能需要调整流速和灌注时间。
2. 灌注完成后，使用手术剪剪下头部并去除皮肤以暴露颅骨。接着使用显微解剖剪去除颅骨顶部以暴露脑组织。使用镊子或小刮勺取出脑组织，并转移至含有冰冻 4% PFA 的离心管中，在 4 °C 下孵育过夜。
   注：务必使用平底管（例如 7 mL 闪烁瓶），以防止脑组织卡在管底，造成组织受压并改变星形胶质细胞体积。
3. 次日，倒出管中的 PFA 溶液。向管中加入 5 mL 1× TBS 溶液以冲洗脑组织并去除残留的 PFA。倒出 TBS 溶液，并重复此步骤两次，共完成三次冲洗。
4. 加入 4–5 mL 含 30% 蔗糖的 TBS 溶液，将脑组织在 4 °C 下孵育 1–2 天，或直至脑组织完全沉入管底。
   注：脑组织一旦下沉即可用于冷冻，但也可在 4 °C 下保存于蔗糖溶液中数周。
5. 在 50 mL 离心管中配制冷冻介质：将 15 mL 100% 最佳切割温度（OCT）包埋剂与 30 mL 含 30% 蔗糖的 TBS 溶液混合。使用旋转混合仪或轨道摇床混合至少 1 小时，确保溶液充分混匀。将离心管直立静置额外 1 小时，使气泡完全上浮至液面。
   注：冷冻介质可预先配制，并在室温下保存数周。
6. 使用移液管将冷冻介质加入方形包埋模具中（材料表）。注意避免将气泡引入介质中。对于 P21 小鼠脑组织，3 mL 已足够。根据脑组织大小调整体积，确保脑组织完全浸没于介质中。
7. 将脑组织放入介质中，并使用 #5 镊子去除可能阻碍脑组织平稳放置的脑干部分。将脑组织前端与模具的一侧边缘对齐。
8. 将模具转移至用干冰冷却的平坦表面。装有干冰的金属饭盒可有效实现此目的。用干冰颗粒包围模具，以确保缓慢且均匀地冷冻。
9. 当冷冻介质完全变为白色且凝固后，将模具储存于 -80 °C。
   ​注：脑组织可在 -80 °C 下保存数年。

2. 冷冻切片

注意：本切片方法适用于多种市售冷冻切片机。使用此处的冷冻切片机（材料表）时，最佳样本头切割温度为 -23 °C，腔室环境温度应保持在 -23 °C 至 -25 °C 之间。

警告：冷冻切片机刀片极为锋利。操作刀片和使用冷冻切片机时需格外小心。

1. 在50 mL离心管中混合25 mL的1×TBS和25 mL甘油，配制切片介质。最简便的方法是直接将甘油倒入管中，并利用管壁上的刻度进行量取。充分震荡或涡旋混匀。该溶液可在室温下保存数周。
2. 准备收集组织切片：向12孔板的每孔中加入2 mL切片介质。在板的顶部和底部标记样品信息。将该板连同其他用品（冷冻切片机刀片、剃须刀片、样本头、毛刷）一起放入冷冻切片机内，使其在机内适应温度约5分钟。
3. 将脑组织移入冷冻切片机腔室，与上述用品一同进行温度平衡。
4. 用剃须刀片切去模具的两个角，将模具从组织块上剥离，取出冷冻的组织块。调整组织块方向，使脑的前端朝上。
5. 在样本头上加入OCT包埋剂，使其覆盖约2/3的样本头表面，立即把组织块放置于其上，并保持上述方向。将组织块压入OCT中，使其与样本头表面完全贴平。
6. 待OCT完全冻结且组织块固定牢固后，将样本头夹紧于切片机标本头。安装冷冻切片机刀片，并将刀片移近标本。
7. 以100 µm的间隔切片，直至接近目标脑区。为减少OCT在切片介质中溶解，可用剃须刀片修去组织块两侧多余的包埋介质。
8. 到达目标区域后，开始收集厚度为100 µm的切片。可使用防卷板，或一手缓慢推进切片机，另一手持毛刷引导切片从组织块脱离刀片时顺利展开。若切片机配有脚踏板，可使用脚踏板推进，以便双手均用于引导切片脱离组织块。
9. 使用毛刷或镊子将切片转移至12孔板中。每个孔可容纳至少10–12张切片。将切片加入介质时，通常只需将切片底边接触切片介质，使其自然融化进入介质中，避免毛刷或镊子浸湿。若毛刷接触了介质，务必用纸巾彻底擦干，因为过湿的毛刷会妨碍组织切片的转移。
10. 用铝箔或封口膜包裹12孔板以密封保存。确保标签清晰，然后于-20 °C保存。
    ​注意：对于大多数染色实验方案，切片在-20 °C条件下可保存至少1–2年，信号无明显损失。

3. 免疫染色

注意：所有洗涤和孵育步骤均在转速约为 100 rpm 的轨道摇床上进行。除一抗孵育在 4 °C 下进行外，其余所有步骤均在室温下操作。提前配制封片剂，将各组分加入 50 mL 离心管中，于旋转混合仪上过夜混合。避光保存，4 °C 条件下可保存最多 2 个月。若内源性荧光信号足够强，无需免疫染色即可进行成像和分析，则可跳过步骤 3.1–3.9。若跳过免疫染色步骤，需用 TBS 洗涤三次，每次 10 分钟，然后继续进行步骤 3.10。

1. 通过将1 mL 10% Triton-X加入50 mL离心管中，并用1×TBS定容至50 mL，配制新鲜的TBST溶液（含0.2% Triton的TBS）。为每只小鼠脑组织配制2 mL封闭液和抗体溶液（含10%山羊血清的TBST）。
   注意：为获得最佳结果，每次染色实验均应现配TBST，并选用高质量的10%水溶性Triton-X（材料表）。
2. 根据示意图（图1）标记一个24孔板。将不同样本置于不同行，不同溶液置于不同列。在前三列（“洗涤1”、“洗涤2”和“洗涤3”）中各加入1 mL TBST。在第四列中加入1 mL封闭液。
3. 用本生灯将5.75英寸巴斯德吸管末端熔化成小钩状，制备玻璃挑针。使用该挑针将组织切片从12孔板转移至24孔板的“洗涤1”列中。
   注意：为获得最佳结果，在开始染色前应对切片进行筛选。筛选方法：将切片逐个转移至盛有1×TBS的培养皿中，使用荧光显微镜配合5×或10×物镜观察，确保切片中含有足够数量的荧光标记细胞。建议每孔染色4至6个切片，必要时可增至8个。
4. 将切片依次在“洗涤1”、“洗涤2”和“洗涤3”孔中各洗涤10分钟，随后在封闭液中4°C孵育1小时。使用玻璃挑针将切片从一个孔转移至下一个孔。该挑针可一次性转移多个脑切片。
5. 为每个样本配制1 mL一抗溶液（例如，Rabbit RFP 1:2000 或 Chicken GFP 1:2000）。将抗体加入抗体稀释液中，短暂涡旋混匀，然后在4 °C下以≥ 4,000 × g离心5分钟。将切片在4 °C轻摇孵育2至3夜。
6. 一抗孵育结束后，吸除洗涤孔中的第1天TBST，向每个洗涤孔中加入1 mL新配TBST，并将切片转移至第一个洗涤孔。重复洗涤3次，每次10分钟。
   注意：吸液时可使用连接软管的9英寸巴斯德吸管，并接入真空抽滤瓶。可采用实验室真空管线或电动真空泵作为真空源。
7. 在切片洗涤的同时，按1:200比例将二抗加入抗体稀释液中，配制二抗溶液（例如，goat anti-rabbit 594 或 goat anti-chicken 488）。短暂涡旋混匀后，在4 °C下以≥ 4,000 × g离心5分钟。
8. 将切片在室温下避光孵育二抗3小时。此步骤及后续所有步骤均需避光，以防二抗荧光淬灭。
9. 二抗孵育结束后，吸除第2天的TBST，向各洗涤孔中加入1 mL新配TBST，并将切片转移至第一个洗涤孔。在TBST中洗涤3次，每次10分钟。
10. 在最后一次洗涤期间，将封片剂从4 °C取出，使其升至室温。配制1×TBS:dH₂O的2:1混合液，并加入培养皿中。在载玻片表面加入800 µL 2:1 TBS:dH₂O，准备封片。
    注意：强烈推荐使用非固化型封片剂。固化型封片剂可能改变组织体积，从而干扰星形胶质细胞领域体积的准确分析。本方法在材料表中提供了一种简单且经济的自制封片剂配方。
11. 使用细毛画笔将切片从“洗涤3”孔逐个转移至培养皿中。此步骤可去除Triton并帮助切片展平。随后将切片从培养皿转移至载玻片液滴中。
12. 使用画笔辅助调整切片位置，使其在载玻片上完全展平。用P1000移液器小心吸除多余液体，随后进行真空抽吸。
    注意：可在巴斯德吸管末端连接P200移液器吸头，以实现更精细的真空抽吸控制。
13. 待载玻片上所有多余液体去除后，立即使用移液器向每个切片滴加一滴封片剂，并轻轻盖上盖玻片。让封片剂自然扩散数分钟，随后通过真空抽吸去除盖玻片边缘溢出的多余封片剂。
    注意：在滴加封片剂前，切勿让切片干燥。若切片在封片前开始干燥，可能影响组织体积，进而干扰数据的准确采集。
14. 用透明指甲油密封盖玻片的四周边缘。室温下静置30分钟使载玻片干燥，然后平放于4 °C保存。至少等待2小时后再进行成像，或于次日成像。
    ​注意：若使用指甲油完全密封，针对GFP和RFP抗体染色的切片可在成像前保存长达2周。

4. 共聚焦成像

注意：本方案提供的是适用于不同共聚焦显微镜的通用图像采集指南，而非针对某一特定共聚焦显微镜和软件界面的具体操作细节。

1. 使用10倍物镜定位用于成像的单个细胞，并记录与实验相关的特定脑区或亚区（例如视觉皮层的第5层）。使用调焦旋钮判断整个星形胶质细胞是否完全包含在切片内。
2. 切换至更高倍率的油镜物镜（例如40倍、60倍或63倍），并将细胞调至焦点。通过目镜观察时，使用调焦旋钮从细胞顶部到底部进行移动。
   1. 目视检查细胞，确保整个细胞均包含在切片内。如果细胞突然失焦并在切片边缘被截断，则排除该细胞并另选一个细胞。
3. 使用共聚焦显微镜配套的采集软件，调整采集参数以获得适当的信噪比和细节水平（512 × 512分辨率足以满足区域分析需求，并可缩短图像采集时间）。若使用40倍物镜，采用2倍缩放；若使用60倍或63倍物镜，则不使用缩放。
4. 设置z轴堆栈的上下边界。为确保完整捕获整个星形胶质细胞，z轴堆栈的第一张和最后一张图像中不应出现细胞的任何荧光标记。为实现充分采样，步进尺寸应设为0.5 µm。

5. 图像分析

注意：本方案描述了使用市售图像分析软件（即 Imaris；参见材料表）进行图像分析的步骤。其他版本的该软件经对工作流程进行微小调整后也可使用。本方案还需使用 MATLAB 来运行 Convex Hull XTension 文件（补充文件）。

1. 开始分析前，安装 Convex Hull XTension 文件 XTSpotsConvexHull.m 通过将文件粘贴到 XT 文件夹的 rtmatlab 子文件夹中。
2. 使用 Imaris 文件转换器将图像转换为 '.ims' 格式。在图像分析软件中打开图像文件，并通过选择 3D 查看模式来浏览图像 3D 视图 按钮
3. 分析前，检查细胞以确保其符合纳入标准。
   1. 确保整个细胞均位于图像范围内（即细胞的任何部分均不应被裁剪出图像）。旋转图像以检查前缘和后缘。
   2. 确保细胞只有一个细胞体。点击 切片 按钮，将光标移至屏幕左侧并拖动以浏览z轴层叠图像，确认标记的细胞仅包含一个细胞体。
   3. 确保有一个星形胶质细胞能够与任何其他被相同颜色标记的邻近星形胶质细胞区分开来。
4. 创建一个表面
   1. 随着 3D 视图 按钮再次选中后，通过点击蓝色区域创建新表面 添加新表面 图标。
      1. 在 创建 软件窗口左下角出现的标签，确保仅选中 仅分割感兴趣区域 和 对象-对象统计学 检查盒子 算法设置，以及 使用 Slicer 视图开始创建 盒 创建偏好设置 未选中。单击 蓝色箭头 继续进行。
         注意：如果图像中目标细胞以外的区域没有其他荧光信号，则可能无需选择感兴趣区域。在此情况下，请保留 仅分割感兴趣区域 未检查，继续进行步骤 5.4.3。
   2. 通过在下方的输入框中输入尺寸，在细胞周围创建一个感兴趣区域 大小 的 表面制备 工具，或拖动黄色方框的边缘（图2A）。点击 蓝色箭头 继续进行。
   3. 选择正确的 源通道 从下拉列表中选择用于分析的通道（例如，通道1，或包含荧光细胞标记的通道）。该值在 表面细节 该数值由软件根据图像采集参数确定。请确保实验中所有样本的该值保持恒定。点击 蓝色箭头 继续进行。
   4. 调节 阈值（绝对强度） 通过拖动黄色条或在输入框中设置数值，使灰色表面尽可能覆盖细胞信号的范围，但不要超出细胞边界。在表面边缘处会可见少量荧光信号图2B）。点击 蓝色箭头 继续进行。
   5. 最后一个面板 表面制备 工具集设置 最低质量值，这是该软件的默认设置 较低阈值 值。在下拉列表中，确保 那 图像体素数量 Img=1 被选中。检查是否仅左侧电源按钮 较低阈值 呈绿色（激活状态）；右侧电源按钮应为红色（非激活状态）。软件默认的 较低阈值 值 10. 保持不变，然后单击 绿色箭头 完成表面的生成。
   6. 仔细检查新生成的表面。通过选中不属于细胞的表面部分，然后点击铅笔图标，将其删除。 编辑 工具，然后单击 删除 选项
   7. 通过单击漏斗来统一剩余的表面部分 过滤 图标以全选，点击铅笔图标 编辑 图标，并单击 统一 选项 (图2C).
      注意：图像文件较大时，软件可能在本方案后续步骤中偶尔崩溃。建议在此时保存文件。
5. 生成靠近表面的斑点
   1. 点击橙色 添加新斑点 图标。使用新的 斑点 例如， "斑点 1") 选择，在 创建 标签，确保仅 对象-对象统计学 选中该复选框 算法设置，以及 从 Slicer 视图开始创建 用于 创建偏好 未选中。单击 蓝色箭头 继续进行。
   2. 选择正确的 源通道 从下拉列表中选择（例如，Channel 1），然后输入一个 估计的 XY 直径 0.400 µm 的数值输入到方框中。确保仅 背景扣除 选中该方框。单击 蓝色箭头 继续进行。
      注意：使用63倍、60倍或40倍物镜采集1024 × 1024或512 × 512图像时，0.400 µm是合适的直径设置。对于其他成像条件，必须根据具体成像参数确定该直径，并在所有分析过程中保持一致。合适的数值应足以生成足够多的斑点以覆盖所有阳性信号，但不会在背景信号上增加额外的斑点。
   3. 最后一个面板 斑点生成 工具集设置 最低质量值，这是该软件的默认设置 较低阈值 值；确保该值保持不变，除非斑点的位置/分布出现明显差异（例如由于染色质量较差所致）。点击 绿色箭头 完成斑点的制作。
   4. 为了更清晰地观察斑点，可通过选择来调整表面的透明度 表面 并点击多色 颜色 工具。在 材料，选择一种材料，使表面足够透明，以便观察细胞内的各个斑点（列表中倒数第四个材料）图 2D，E).
   5. 重新选择 斑点，点击 过滤 图标并选择 表面间最短距离 表面=表面 X，其中“Surfaces X”为待分析的表面（例如，Surfaces 1），从下拉列表中选择。确保两者 较低阈值 和 上限阈值 电源按钮为绿色（激活状态）。
      1. 输入 A 最小距离 -1.0 µm（斑点距表面内侧的距离） 较低阈值 盒，和一个 最大距离 0.1 µm（距外侧的距离） 上阈值 盒。单击 重复选择至新位点 按钮以完成表面附近斑点的生成。
         注意：最小和最大距离值可能因不同的图像采集参数（如物镜、缩放倍数和分辨率）而有所变化，这些数值需通过实验确定。透明表面有助于判断所选参数值是否捕捉到了所有能准确反映表面形态的斑点。
6. 生成凸包并收集区域测量数据
   1. 确保新创建的 斑点 在软件窗口的左上方面板中选择（例如， "斑点1选择【最短距离…】"）。点击齿轮图标 工具 图标，然后 凸包 插件。仅单击插件一次，等待 MATLAB 窗口出现后消失（此过程可能需要数秒）。三维视图中将显示一个实心外壳。
   2. 在左上方面板中选择 斑点凸包 X 选择 ['最短距离...]，其中“Spots X 选择”为新创建的斑点（例如，Spots 1 选择），然后单击 外壳 以选择它（图2F).
   3. 点击图表 统计学 图标，选择 选择 标签，确保 特定值 从顶部下拉列表中选择，然后从底部下拉列表中选择体积。记录船体的体积。 保存 文件并继续处理下一张图像。
7. 测量具有不同荧光标记的邻近细胞的 territory 重叠体积
   注意：如果样本中包含表达不同荧光标记的邻近星形胶质细胞（例如，星形胶质细胞1仅表达GFP，星形胶质细胞2仅表达RFP），可使用本方案的此部分内容。此类标记可通过先前所述的病毒或遗传学策略实现^9,10 (图3A).
   1. 使用步骤 5.4–5.6 中详述的步骤，为每个星形胶质细胞创建表面、靠近表面的斑点以及凸包图3B).
   2. 随着 斑点1选择的凸包... 选定后，点击铅笔图标 编辑 图标并单击 口罩选择. 在 掩膜通道 窗口，确保 通道1 （或代表星形胶质细胞1的通道）被选中，并确保其旁边的复选框 应用遮罩前复制通道 选项已勾选。单击 好的 创建通道 掩蔽的 CH1.
   3. 随着 斑点2选择的凸包... 选定后，点击铅笔图标 编辑 图标并单击 口罩选择. 在 掩膜通道 窗口，选择 通道 2 （或代表星形胶质细胞2的通道）从下拉菜单中选择，并确保其旁边的复选框 应用遮罩前复制通道 选项已勾选。单击 好的 创建通道 掩蔽的 CH2 (图3C).
   4. 点击 共定位 屏幕顶部的按钮并使用 共定位 用于创建两个掩膜通道的共定位通道的工具。设置 通道 A 到 通道 3 - 掩蔽的 CH1 和 通道 B 到 通道 4 - 掩膜的 CH2 (图3D).
   5. 拖动黄色 直方图条形 向左移动两个通道。使用 切片视图 下方以观察共定位信号，该信号将显示为灰色。需要注意的是，由于两个细胞的荧光信号实际上并未共定位，因此 阈值 需要向左移动，以便在细胞-细胞接触点开始出现假的共定位。
   6. 点击 构建共定位通道 在右侧点击以完成该过程。点击 3D 视图 返回标准的3D视图。A 共定位结果 通道现在将以灰色显示，并出现在显示调整框中。
   7. 创建表面、靠近表面的点以及凸包 共定位结果 使用5.4-5.7步骤中所述的方法建立通道（图 3E，F).
   8. 记录凸包的体积，此即为区域重叠体积。将该数值除以其中一个星形胶质细胞的区域体积，以计算区域重叠的百分比。若其中一个星形胶质细胞相对于另一个经过基因操作，则选择对照组或野生型星形胶质细胞进行计算。

结果

图1 展示了本实验方案主要步骤和工作流程的示意图。图2 显示了使用图像分析软件生成表面、在表面附近生成斑点以及生成凸包等关键步骤的截图。图3 展示了该技术在确定星形胶质细胞区域重叠/拼接中的应用。图4 展示了来自先前发表论文⁹的代表性结果，用以说明本方案的应用。在图4A和图4B中，敲低星形胶质细胞富集的细胞黏附分子 hepaCAM 显著降低了星形胶质细胞的区域体积。在图4C和图4D中，采用双标记嵌合体分析（Mosaic Analysis with Double Markers, MADM）技术在小鼠大脑皮层中实现稀疏嵌...

讨论

本方案描述了一种用于分析小鼠大脑皮层星形胶质细胞占据体积及星形胶质细胞拼接行为的成熟方法，详细阐述了从灌注到图像分析的全部主要步骤。该方案需要使用在星形胶质细胞稀疏或嵌合表达荧光蛋白的小鼠脑组织。除这一要求外，任何年龄的小鼠均可用于本方案，仅需对灌注参数和包埋模具中添加的冷冻介质体积进行微小调整。尽管已有其他方法发表用于分析脑组织切片中星形胶质细胞的分支复杂性与体积^7,11，但本方案具有若干独特优势。首先，本方案提供了一段自定义代码，可用于获取星形胶质细胞占据体积。星形胶质细胞占据体积与星形胶质细胞体积是不同的测量指标，前者测量的是星形胶质细胞所占据的全部空间，而不考虑其分支复杂程度。此外，本方案还阐述了如何利用星形胶质细胞占据体积的测量方法来计算星形胶质细胞占据区域的重叠体积，从而评估星形胶质细胞的拼接行为。最后，本方案详细讨论了可能影响星形胶质细胞占据体积及数据采集的潜在变量，包括封片条件、样本储存条件，以及成像与分析中的纳入与排除标准。除了这些独特特点外，本方案的许多部分——包括灌注、冷冻切片以及游离切片的免疫染色...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
#5 镊子	Roboz	RS-5045
1 mL TB 注射器	Becton Dickinson (BD)	309623
10x TBS（Tris 缓冲盐水）			30 g Tris，80 g NaCl，2 g KCl，用 HCl 调至 pH 7.4，加 dH2O 定容至 1 L；室温（RT）保存
1x TBS			100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O；室温保存
1x TBS + 肝素			28.2 mg 肝素 + 250 mL 1x TBS；4 °C 保存
12 孔板	Genesee Scientific	25-106MP
24 孔板	Genesee Scientific	25-107MP
TBS 中含 30% 蔗糖			15 g 蔗糖，用 1x TBS 定容至 50 mL；4 °C 保存
TBS 中含 4% PFA（多聚甲醛）			40 g PFA，4–6 粒 NaOH 小球，100 mL 10x TBS，加 dH2O 定容至 1 L；4 °C 保存
Avertin			0.3125 g 三溴乙醇，0.625 mL 甲基丁醇，加 dH2O 定容至 25 mL；4 °C 保存；配制后 2 周内弃用
封闭和抗体缓冲液			含 10% 山羊血清的 TBST；4 °C 保存
CD1 小鼠	Charles River	022
脑组织收集管	Fisher Scientific	03-337-20
共聚焦图像采集软件	Olympus	FV31S-SW
共聚焦显微镜	Olympus	FV3000RS
盖玻片	Fisher Scientific	12544E
冷冻切片机	Thermo Scientific	CryoStar NX50
冷冻切片机刀片	Thermo Scientific	3052835
DAPI	Invitrogen	D1306
包埋模具	Polysciences	18646A-1
冷冻介质			30% 蔗糖:OCT 按 2:1 混合；室温保存
GFP 抗体	Aves Labs	GFP1010
甘油	Thermo Scientific	158920010
山羊抗鸡 IgG 488	Invitrogen	A-11039
山羊抗兔 IgG 594	Invitrogen	A11037
山羊血清	Gibco	16210064
肝素	Sigma-Aldrich	H3149
盐酸	Sigma-Aldrich	258148
Imaris	Bitplane	N/A	版本 9.8.0
MATLAB	MathWorks	N/A
金属便当盒	AQUARIUS	N/A	来自 Amazon，"DIY 大型趣味盒"
甲基丁醇	Sigma-Aldrich	152463
显微解剖剪	Roboz	RS-5921
封片介质			20 mM Tris（pH 8.0），90% 甘油，0.5% N-丙基没食子酸酯；4 °C 保存；有效期最长 2 个月
指甲油	VWR	100491-940
N-丙基没食子酸酯	Sigma-Aldrich	02370-100G
O.C.T.	Fisher Scientific	23-730-571
镜油	Olympus	IMMOIL-F30CC	与显微镜/物镜配套使用
6" 手术剪	Roboz	RS-6820
轨道摇床	Fisher Scientific	88861043	最低所需转速：25 rpm
画笔	Bogrinuo	N/A	来自 Amazon，"细节画笔 - 微型画笔"
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148
巴斯德吸管（5.75"）	VWR	14672-608
巴斯德吸管（9"）	VWR	14672-380
氯化钾	Sigma-Aldrich	P9541-500G
剃须刀片	Fisher Scientific	12-640
RFP 抗体	Rockland	600-401-379
切片介质			甘油:1x TBS 按 1:1 混合；室温保存
载玻片	VWR	48311-703
氯化钠	Fisher Scientific	BP358-212
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	S5881
蔗糖	Sigma-Aldrich	S0389
TBST（TBS + Triton X-100）			含 0.2% Triton 的 1x TBS；室温保存
移液管	VWR	414004-002
三溴乙醇	Sigma-Aldrich	T48402
三（羟甲基）氨基甲烷	Thermo Scientific	424570025
Triton X-100	Sigma-Aldrich	93443
Triton X-100（高纯度）	Fisher Scientific	50-489-120
XTSpotsConvexHull	N/A	N/A	作为补充材料提供的自定义 XTension 插件