本文介绍了一种从细胞和组织中富集内源性磷酸化蛋白磷酸酶及其相互作用蛋白，并通过基于质谱的蛋白质组学方法对其进行鉴定和定量的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
大多数细胞过程受到蛋白质磷酸化的动态调控。超过四分之三的蛋白质会发生磷酸化，而磷酸蛋白磷酸酶（PPPs）介导了细胞内90%以上的丝氨酸/苏氨酸去磷酸化反应。蛋白质磷酸化失调已被证实与多种疾病的病理生理过程相关，包括癌症和神经退行性疾病。尽管PPPs具有广泛的功能，但调控PPPs的分子机制以及由PPPs所调控的下游通路仍缺乏充分表征。本文介绍了一种名为磷酸酶抑制剂珠粒结合质谱技术（PIB-MS）的蛋白质组学方法，可在仅12小时之内，利用任何细胞系或组织样本，实现对PPPs及其翻译后修饰和相互作用蛋白（统称为PPP组）的鉴定与定量。PIB-MS采用一种非选择性的PPP抑制剂——微囊藻毒素-LR（MCLR），将其固定于Sepharose珠粒上，以捕获并富集内源性PPPs及其相关蛋白。该方法无需外源表达带标签的PPPs，也不依赖特异性抗体。PIB-MS为研究进化上保守的PPPs提供了一种创新手段，并有助于拓展当前对去磷酸化信号通路的认知。
引言
蛋白质磷酸化调控大多数细胞过程，包括但不限于DNA损伤应答、生长因子信号传导以及有丝分裂的进程1,2,3。在哺乳动物细胞中，大多数蛋白质在某一时刻会于一个或多个丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上发生磷酸化，其中磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸约占所有磷酸化位点的98%2,3。尽管激酶在细胞信号传导中的作用已被广泛研究，蛋白磷酸酶（PPPs）在调控动态细胞过程中的功能仍处于逐步揭示之中。
磷酸化动态过程由激酶与磷酸酶之间的动态相互作用所调控。在哺乳动物细胞中，存在超过400种蛋白激酶，可催化丝氨酸/苏氨酸的磷酸化。其中超过90%的位点由磷酸化蛋白磷酸酶（PPPs）去磷酸化，PPPs是一类包含PP1、PP2A、PP2B、PP4-7、PPT和PPZ的小型酶家族。2,3. PP1 和 PP2A 负责细胞内大多数磷酸化丝氨酸和磷酸化苏氨酸的去磷酸化反应2,3,....
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方案
注意：PIB 的制备方法如 Moorhead 等所述，将 1 mg 微囊藻毒素与约 6 mL 葡聚糖凝胶偶联，以制备结合能力高达 5 mg/mL17 的 PIB。
1. 样品制备
注意：PIB-MS 实验通常每种条件起始使用 1 mg 总蛋白。本实验中，使用约 2.5 × 106 个 HeLa 细胞提取出 1 mg 蛋白质。针对实验中使用的每种细胞系或组织，均应进行此计算18。如果样本量有限且无法获得 1 mg 蛋白，可减少上样量，但会导致 PPP 亚基检测灵敏度略有下降。或者，可采用 TMT 标记技术，将所有条件的样本混合于同一样品中，从而提高检测灵敏度，如步骤 9 所示。
- 收集组织样本或细胞沉淀。对于细胞沉淀，将细胞在室温（RT）下以 277 × g 离心 2 分钟，弃去培养基，并用 5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。细胞沉淀可在 -80 °C 下保存数月。
- 配制裂解缓冲液（500 mM NaCl，50 mM Tris-HCl pH 7.5，0.5% Triton X-100（体积比），5 mM β-甘油磷酸二钠盐五水合物，1:500（体积比）蛋白酶抑制剂混合物 III），并置于冰上。配制足够量以用....
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结果
图 2：特异性 PIB 结合物的鉴定。（A）多种组织类型或细胞可通过 PIB-MS 进行分析。HeLa 细胞以生物学三复孔进行实验，分别用 DMSO 或 PPP 抑制剂 MCLR 处理后，与 PIBs 孵育，并通过 LC-MS/MS 进行分析。（B）DMSO 和 MCLR 处理的 HeLa 细胞裂解液中 PIB-MS 分析的火山图，特异性 PIB 结合物以红色显示。PPP 催化亚基标注并以蓝色显示。新的候选 PPP 亚基或相互作用蛋.......
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讨论
PIB-MS 是一种化学蛋白质组学方法，可用于在单次分析中对来自不同样本来源的PPPome进行定量分析。已有大量研究使用激酶抑制剂珠粒来研究激酶组及其在癌症和其他疾病状态下的变化10,11,12,13。然而，对PPPome的研究仍相对滞后。我们预计该方法能够填补这一空白，并揭示细胞去磷酸化调控的机制。在此，我们证明利用PIB可富集PP1、PP2A、PP4、PP5和PP6的催化组分及非催化组分。我们还能够在多种细胞系、组织类型和生物体中鉴定出新的PPP相互作用候选蛋白。
在PIB-MS实验流程中有若干关键步骤不容忽视，包括设置适当的对照和重复、所有样品间加入等量的蛋白质、样品制备过程中维持非变性条件、样品与PIB孵育以及PIB的洗涤。关于对照和重复，如果目标是鉴定新的PPP亚基及其相互作用蛋白，则每个样品应取一半加入PPP抑制剂，.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
A.N.K. 感谢 NIH R33 CA225458 和 R35 GM119455 项目的支持。我们感谢 Kettenbach 实验室和 Gerber 实验室的有益讨论。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙腈（ACN） | Honeywell | AH015-4 | 注意：ACN 易燃且有毒；操作时需佩戴手套，并在化学通风橱中进行。 |
| 无水乙腈 | Sigma-Aldrich | 271004-100ML | 注意：ACN 易燃且有毒；操作时需佩戴手套，并在化学通风橱中进行。 |
| 台式离心机 | Eppendorf | 型号 no. 5424 | |
| β-甘油磷酸二钠盐五水合物 | Acros Organics | 410991000 | |
| 离心机 | Eppendorf | 型号 no. 5810 R 15 安培版本 | |
| 蒸馏水 | |||
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Dounce 组织研磨器 | Fisherbrand Pellet Pestles | 12-141-363 | |
| Empore 固相萃取盘，C18 | CDS Analytical | 76333-132 | |
| Eppendorf 管，1.5 mL | Eppendorf | 22363204 | 关键：其他类型的离心管可能会向样品中浸出聚合物，造成分析污染。 |
| Eppendorf 管，2 mL | Eppendorf | 22363352 | 关键：其他类型的离心管可能会向样品中浸出聚合物，造成分析污染。 |
| 固相萃取板多通道装置 | Waters | WAT097944 | |
| Falcon 管，50 mL | VWR | 21008 | |
| 通用钝头针和推杆 | |||
| 通用磁性分离架 | |||
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| 盐酸（HCl） | VWR Chemicals BDH | BDH3028 | 注意：HCl 具有腐蚀性；操作时需佩戴手套，并在化学通风橱中进行。 |
| 50%（质量/体积）羟胺溶液 | Sigma-Aldrich | 467804 | |
| 65 °C 恒温培养箱 | VWR | 型号 no. 1380FM | |
| Koptec 纯乙醇，200 证明 | Decon Labs | V1001 | |
| 用于高效液相色谱的甲醇（MeOH） | Sigma-Aldrich | 34860-4L-R | 注意：MeOH 易燃且有毒；操作时需佩戴手套，并在化学通风橱中进行。 |
| 微囊藻毒素 LR（MCLR） | Cayman Chemical | 10007188 | 注意：MCLR 有毒；操作时需佩戴手套，避免皮肤接触。 |
| PBS，1×，不含钙和镁，pH 7.4 ± 0.1 | Corning | 21-040-CV | |
| pH 试纸，例如 MilliporeSigma MColorpHast pH 试纸和指示纸 | Fisher Scientific | M1095310001 | |
| PIBs | 有关 PIBs 的制备方案，请参见 Moorhead 等，2007。 | ||
| Pierce BCA 蛋白检测试剂盒 | Thermo Scientific | 23225 | |
| 移液器吸头，10 μL | Eppendorf | 22491504 | 关键：其他类型的吸头可能会向样品中浸出聚合物，造成分析污染。 |
| 移液器吸头，1000 μL | Eppendorf | 22491555 | 关键：其他类型的吸头可能会向样品中浸出聚合物，造成分析污染。 |
| 移液器吸头，200 μL | Eppendorf | 22491539 | 关键：其他类型的吸头可能会向样品中浸出聚合物，造成分析污染。 |
| 塑料注射器，10 mL | BD | 309604 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 III | Research Products International | P50700-1 | |
| Q Exactive Plus 杂合四极杆-Orbitrap 质谱仪、Orbitrap Fusion、Orbitrap Fusion Lumos 或 Orbitrap Eclipse Tribrid 质谱仪 | Thermo Scientific | ||
| 制冷型台式离心机 | Eppendorf | 型号 no. 5424 R | |
| 旋转混合仪（Labquake 摇床旋转器） | Thermo Scientific | 13-687-12Q | 8 rpm 转速 |
| 样品收集板，96 孔，1 mL | Waters | WAT058957 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP1311-1 | |
| 测序级修饰胰蛋白酶 | Promega | V511C | |
| 叠氮化钠 | EMD Chemicals | SX0299-1 | 注意：叠氮化钠具有爆炸性和毒性；操作时需佩戴手套，在化学通风橱中进行，并避免与金属接触。 |
| 氯化钠（NaCl） | Fisher Chemical | S27110 | |
| 超声波破碎仪（Branson 数字超声波破碎仪） | 型号 no. SFX 250 | ||
| SPE C18 脱盐板 | Waters | 186001828BA | |
| SpeedBeads 磁性羧基修饰微粒（SP3 珠） | Cytiva | 6.51521E+13 | |
| 恒温混匀仪 | Eppendorf | 型号 no. 5350 | |
| TMT10plex 同重同位素标记试剂组及 TMT11-131C 标记试剂，每种标签 3 × 0.8 mg | ThermoFisher | A37725 | |
| 三氟乙酸（TFA） | Honeywell | T6508-25ML | 注意：TFA 具有腐蚀性，接触皮肤会引起刺激。操作时需佩戴手套和眼部防护装备，并在化学通风橱中进行。 |
| Tris 碱 | Research Products International | T60040 | |
| 吐温 X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 真空离心浓缩仪及冷阱 | Thermo Scientific | 型号 nos. SpeedVac SPD120 和 RVT5105 | |
| 涡旋振荡器（Vortex-Genie 2） | Scientific Industries | ||
| 液相色谱-质谱用水 | Honeywell | LC365-4 |
参考文献
- Nilsson, J. Protein phosphatases in the regulation of mitosis. Journal of Cell Biology. 218 (2), 395-409 (2019).
- Brautigan, D. L. Protein Ser/Thr phosphatases--the ugly ducklings of cell signalling. The FEBS Journal. 280 (2), 324-345 (2013).
- Bra....
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