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方法文章

利用多重荧光染色与组织透明化技术展示三维模式下有毛与无毛皮肤的神经支配

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DOI：

10.3791/63807

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2022年5月20日

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1Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

组织切片的厚度限制了对皮肤神经支配的形态学研究。本方案描述了一种独特的组织透明化技术，可在共聚焦显微镜下观察厚达300 µm组织切片中的皮肤神经纤维。

摘要

皮肤神经支配是周围神经系统的重要组成部分。尽管对皮肤神经纤维的研究进展迅速，但目前对其分布特征和化学特性的大部分认识仍主要来源于对薄组织切片进行的传统组织化学和免疫组织化学染色。随着组织透明化技术的发展，现已能够在较厚的组织切片中观察皮肤神经纤维。本实验方案描述了对大鼠后足掌侧和背侧皮肤——两种典型的有毛和无毛皮肤区域——制备成300 µm厚的组织切片进行多荧光标记的方法。其中，降钙素基因相关肽用于标记感觉神经纤维，鬼笔环肽和淋巴管内皮透明质酸受体1分别标记血管和淋巴管。在共聚焦显微镜下，标记的感觉神经纤维可被连续追踪较长距离，在皮肤深层以束状走行，在浅层则呈自由形态分布。这些神经纤维与血管平行走行或包绕血管，而淋巴管则在有毛和无毛皮肤中形成三维（3D）网络结构。从方法学角度来看，本方案相较于现有的传统方法，为研究皮肤神经支配提供了更为有效的技术途径。

引言

皮肤是人体最大的器官，作为与外界环境相互作用的关键界面，其内密集分布着大量神经纤维1,2,3。尽管既往已采用多种组织学方法对皮肤神经支配进行了广泛研究，例如对完整皮肤组织及组织切片进行染色4,5,6，但如何清晰有效地展示皮肤神经纤维的细节仍是一项挑战7,8。鉴于此，本实验方案开发了一种独特技术，可更清晰地在厚组织切片中展示皮肤神经纤维。

由于切片厚度的限制，对皮肤内神经纤维的观察不够精确，难以从所获得的图像信息中准确描述降钙素基因相关肽（CGRP）神经纤维与局部组织和器官之间的关系。三维组织透明技术的出现为解决这一问题提供了可行的方法9,10。近年来，组织透明技术的快速发展为研究组织结构、完整器官、神经投射乃至整体动物提供了多种工具11。透明化的皮肤组织可通过共聚焦显微镜在更厚的切片中成像，从而获取用于可视化皮肤神经纤维的数据。

在本研究中，选择大鼠后足的足底和背侧皮肤作为有毛皮肤和无毛皮肤的两个目标区域3,4,7。为了在更长距离上追踪皮肤神经纤维，将皮肤组织切成300 µm厚的切片，进行免疫组织化学和组织化学染色，随后进行组织透明化处理。使用CGRP标记感觉神经纤维12,13。此外，为了在组织背景下突出显示皮肤神经纤维，进一步使用鬼笔环肽（phalloidin）和淋巴管内皮透明质酸受体1（LYVE1）分别标记血管和淋巴管14,15。

这些方法提供了一种简便的途径，可用于展示皮肤神经纤维的高分辨率图像，同时可视化皮肤中神经纤维、血管和淋巴管之间的空间关系，从而为理解正常皮肤的稳态以及病理条件下的皮肤改变提供更为丰富的信息。

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方案

本研究经中国中医科学院针灸研究所伦理委员会批准（批准编号：D2018-04-13-1）。所有实验操作均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》（国家科学院出版社，华盛顿特区，1996年）。本研究使用三只成年雄性大鼠（Sprague-Dawley品系，体重230 ± 15 g）。所有动物均饲养在12小时光照/12小时黑暗循环条件下，环境温度与湿度受控，并可自由获取食物和水。

1. 灌注与样本制备

  1. 注射250 mg/kg的三溴乙醇溶液（参见 材料表通过腹腔注射使大鼠安乐死。
  2. 一旦呼吸停止，使用不锈钢手术剪打开大鼠的胸腔。用20 G针头进行灌注 通过 左心室13 以3 mL/min的速度先灌注100 mL 0.9%生理盐水，随后灌注250–300 mL 4%多聚甲醛（溶于0.1 M磷酸盐缓冲液PB，pH 7.4）图1A，B).
  3. 灌注后，使用手术刀去除后肢足背和足底的皮肤。
    1. 对于需要进行冰冻切片的样品，将组织在0.1 M PB中的4%多聚甲醛中后固定2小时；然后在4 °C下，用0.1 M PB中的25%蔗糖溶液对组织进行 cryoprotection（冷冻保护），时间超过24小时。
    2. 对于需要进行组织透明化的厚切片样本，先在4%多聚甲醛的1×磷酸盐缓冲液（1× PBS）中4 °C下后固定2小时，然后在4 °C下用1× PBS对组织进行冷冻保护处理图1C–E).

2. 使用CGRP、鬼笔环肽和LYVE1进行三重荧光染色，随后进行组织透明化处理

注意：对组织透明化处理后的300 µm厚组织切片，采用CGRP、鬼笔环肽和LYVE1三重荧光染色，以显示有毛和无毛皮肤中的神经纤维、血管和淋巴管。

  1. 将琼脂糖加入1x PBS中，配制成2%的溶液，放入微波炉加热2分钟，直至琼脂糖完全溶解（参见 材料表）。
  2. 洗涤后，将皮肤组织置于37 °C的2%琼脂糖溶液中包埋，随后放入冰盒中冷却（图1F，G）。
  3. 用冰水将固定在振动切片机上的组织固定，沿横向切成500 µm厚的切片。使用以下参数设置振动切片机并完成切片：速度为0.50 mm/s，振幅为1.5 mm（图1H-K）。
  4. 切片完成后，从组织切片中去除琼脂糖，并将其置于六孔板中，用1x PBS（pH 7.4）保存（图1L）。
  5. 将组织切片在含2% Triton X-100的1x PBS溶液（TriX-PB）中4 °C孵育过夜。后续步骤见图2。
  6. 将组织切片放入封闭缓冲液中，在摇床上以72 rpm于4 °C旋转孵育过夜。
    注：封闭缓冲液的组成为10%正常驴血清、1% Triton-X 100和0.2%叠氮化钠溶于1x PBS中（参见材料表）。
  7. 将组织切片转移至微量离心管中的稀释缓冲液内，加入小鼠单克隆抗CGRP抗体（1:500）和绵羊多克隆抗LYVE1抗体（1:500），在摇床上4 °C旋转孵育2天（参见材料表）。
    注：稀释缓冲液的组成为1%正常驴血清、0.2% Triton-X 100和0.2%叠氮化钠溶于1x PBS中。
  8. 室温下用洗涤缓冲液清洗组织切片两次，然后在洗涤缓冲液中4 °C于摇床上继续孵育过夜。
    注：洗涤缓冲液的组成为0.2% Triton-X 100溶于0.1 M PB（pH 7.4）中。
  9. 次日，将组织切片转移至微量离心管中的混合溶液中，其中包含驴抗小鼠IgG H&L Alexa-Flour488（1:500）、驴抗绵羊IgG H&L Alexa-Flour405（1:500）以及Alexa-Flour594鬼笔环肽（1:1000）（参见材料表），在摇床上以72 rpm于4 °C旋转孵育5小时。
  10. 在六孔板中用洗涤缓冲液于室温清洗组织切片，每次1小时，共清洗两次。随后将组织切片在洗涤缓冲液中4 °C于摇床上继续孵育过夜。
  11. 将组织切片转移至组织透明试剂中（参见材料表，试剂体积为样品体积的五倍），在室温下于摇床上以60 rpm轻柔旋转1小时。
    注：经此处理后，组织切片变得透明（图2B）。
  12. 将透明后的组织切片置于载玻片上，用间隔垫圈围绕组织，再用新鲜的组织透明试剂填充间隙并加盖盖玻片。

3. 采用传统方法进行CGRP、鬼笔环肽和LYVE1的三重荧光染色

注意：作为对照，采用传统技术对厚度为 30 µm 的组织切片进行了相同的染色。

  1. 使用切片机将组织在横断面方向上切成30 µm厚的切片，并将其贴附在载玻片上。
  2. 加入含3%正常驴血清和0.3% Triton X-100的0.1 M PB封闭液，在室温下孵育30分钟。
  3. 去除封闭液，加入含有小鼠单克隆抗CGRP抗体（1:500）和绵羊多克隆抗LYVE1抗体（1:500）的稀释缓冲液，4 °C孵育过夜。
  4. 次日，用0.1 M PB（pH 7.4）洗涤组织切片三次，然后在切片上加入含驴抗小鼠IgG H&L Alexa-Flour488（1:500）和驴抗绵羊IgG H&L Alexa-Flour405（1:500）的混合二抗溶液，以及Alexa-Flour594鬼笔环肽（1:1000），室温孵育1小时。
  5. 显微镜观察前，用0.1 M PB（pH 7.4）洗涤切片三次，然后用50%甘油封片。

4. 成像与分析

  1. 在荧光显微镜下观察染色样本，然后使用共聚焦显微镜拍摄图像。
  2. 从每张300 µm厚的切片中，以10 µm为步长采集30张图像（Z-stack），并利用共聚焦显微镜系统的图像处理器整合成一张聚焦清晰的图像（参见材料表）。
    1. 在共聚焦系统的图像处理软件中执行以下三维（3D）分析步骤：设置起始焦平面 | 设置终止焦平面 | 设置步长 | 选择深度模式 | 图像采集 | Z序列。
      注：蓝色荧光信号的激发波长和发射波长分别为401 nm和421 nm；绿色荧光信号的激发波长和发射波长分别为499 nm和519 nm；红色荧光信号的激发波长和发射波长分别为591 nm和618 nm。共聚焦针孔直径为152 µm（10倍物镜，NA：0.4）。图像采集分辨率为1024 × 1024像素。
  3. 对于常规样本（步骤3），从每张30 µm厚的切片中以1 µm为步长采集30张图像（Z-stack），并按上述方法进一步处理这些图像（步骤4.1–4.2）。
  4. 利用图像处理系统以三维重建模式展示图像。
  5. 将Z-stack共聚焦图像导入Imaris 9.0（细胞成像软件，参见材料表）进行三维重建，并根据染色强度生成表面渲染图像：添加新表面 | 选择源通道 | 在表面细节的平滑选项中设定参数 | 在绝对强度的阈值选项中设定参数 | 分类表面 | 完成。
  6. 使用细胞成像软件获取阳性神经纤维表面区域的数据：选择渲染图像 | 统计 | 详细 | 特定值 | 体积。

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结果

经三重荧光染色后，CGRP、鬼笔环肽（phalloidin）和LYVE1分别对有毛和无毛皮肤中的神经纤维、血管和淋巴管进行了清晰标记（图3、4）。经过组织透明处理后，可对CGRP阳性神经纤维、鬼笔环肽阳性血管以及LYVE1阳性淋巴管进行更深层的成像，从而获取皮肤完整的结构信息（图3）。当这些组织结构进一步以三维模式重建时，其分布更易于追踪。结果显示，CGRP阳性神经纤维穿过皮下组织和真皮层延伸至表皮层。这些神经纤维在皮下组织中成束走行，在真皮层内分支，并终止于表皮层（图3）。相比之下，鬼笔环肽阳性血管和LYVE1阳性淋巴管主要分布于皮下组织和真皮层（图3）。通常情况下，CGRP阳性神经纤维与血管和淋巴管平行走行或包绕其周围，共同在有毛和无毛皮肤中形成三维网络结构。

采用传统方法时，尽管在薄切片中神经纤维、血管和淋...

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讨论

本研究通过使用免疫荧光技术对经透明处理的较厚组织切片进行观察，并结合三维视角，详细展示了有毛和无毛皮肤中的皮下神经纤维，以更好地理解皮肤的神经支配情况。抗体孵育时间长达1-2天，以及过夜的透明处理过程，是两个关键步骤，直接影响厚切片的免疫荧光染色效果。另一个问题来自抗体的选择，并非所有抗体均适用于厚切片。我们推测，分子量较小的抗体可能更适用于厚切片的免疫荧光染色。因此，抗体选择的困难是该方法的主要局限性之一。本研究观察到大鼠有毛与无毛皮肤中血管、淋巴管及神经分布的差异。对于人类而言，皮肤结构与啮齿类动物存在显著不同；我们期待在下一步工作中利用组织透明技术对人类皮肤进行观察与研究。

既往研究已做出诸多努力以揭示皮肤神经纤维4,5,6,7,8。与传统的组织切片研究...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由中医科学院创新基金（项目编号：CI2021A03404）和国家中医药多学科交叉创新基金（项目编号：ZYYCXTD-D-202202）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1×磷酸盐缓冲液Solarbio Life SciencesP1020pH 7.2–7.4，0.01 mol
2,2,2-三溴乙醇Sigma生命科学T48402-5G
共聚焦荧光显微镜奥林巴斯公司Fluoview FV1200
驴抗小鼠IgG H&L Alexa-Fluor488Abcam plcab150105
驴抗羊IgG H&L Alexa-Fluor405Abcam plcab175676
EP管中国台湾无锡巢生物技术有限公司6150011.5 mL
冷冻切片滑动式切片机系统Leica BiosystemsCM1860
Imaris 软件Oxford Instrumentsv.9.0.1
IRIS 标准剪刀WPI（World Precision Instruments Inc.）503242
iSpacerSunJin Lab 公司IS005
微型镊子-Str真实世界数据F11020-11
小鼠单克隆抗CGRP抗体Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-57053
中性缓冲福尔马林Solarbio Life SciencesG216110%
正常驴血清杰克逊免疫研究实验室017-000-1210 mL
蠕动泵Longer Precision Pump Co., LtdBT300-2J
鬼笔环肽Alexa Fluor 594赛默飞世尔科技A12381
RapiClear 1.52 溶液SunJin Lab 公司RC15200110 mL
常规琼脂糖基因有限公司G-10
SEMKEN 1 x 2 齿组织镊-直真实世界数据F13038-12
羊多克隆抗LYVE1抗体R&D Systems, Inc.AF7939
六孔板康宁公司3335
叠氮化钠Sigma生命科学S200225 g
蔗糖Sigma生命科学V900116500 g
超级胶水Henkel AG & 公司Pattex 502
手术刀柄真实世界数据S32003-12
Triton X-100Solarbio Life Sciences9002-93-1100 mL
乌拉坦Sigma生命科学U2500500 g
VANNAS弹簧剪真实世界数据S1014-12
振动切片机Leica BiosystemsVT1200S

参考文献

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