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方法文章

用于心血管疾病研究的大型动物模型中心脏的解剖技术与组织学取样

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DOI：

10.3791/63809

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2022年6月16日

 , 
1Department of Pathology, University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine Cluj-Napoca

本文内容

摘要

由于心脏解剖结构复杂，要实施一种可稳定重复的心脏样本分离与采集方案具有挑战性。本文介绍了几种标准心脏解剖方案的关键要素，重点说明常用于组织病理学检查的大体检查方法及取样部位。

摘要

标准的大体检查与取样是开展大动物心血管疾病实验研究可重复性和成功的关键要素。鉴于心脏结构的复杂性、物种间的差异以及代偿性和病理性反应的类型，制定一致的实验操作规程具有挑战性。目前常采用多种解剖方案，通常根据解剖者的经验进行调整，而个人偏好仍是导致实验结果和观察者间差异的重要来源。本文旨在介绍几种常用实验动物（包括犬、猪、反刍动物和猫）作为心血管疾病模型时，心脏的主要解剖特征与解剖标志、解剖操作规程以及组织学取样标准。

本文介绍了两种标准的大体检查方案。第一种是流入-流出法，该方法沿心脏和大血管的生理血流方向进行（常用于犬、反刍动物和猪）；第二种是四腔解剖技术（以猫为例说明）。在特定实验条件下，这两种技术均可适用于任何物种。取样方案涵盖了所有感兴趣区域（窦房结、心室、室间隔、心房、瓣膜和主动脉），若操作得当，可提高实验研究的可重复性和可靠性。

引言

由于心脏解剖结构复杂且死后早期即出现尸僵，可能干扰对心壁厚度的评估，因此心脏的大体检查具有挑战性，并容易产生多种与技术操作或结果判读相关的误差。这一问题因不同物种间的心脏形态学差异而加剧，而且许多临床上重要的主要心脏病变（包括冠心病早期、纤维化、动脉炎和淀粉样变性等）并不伴随明显的大体改变，本质上属于组织病理学范畴的疾病。采用标准化的心脏解剖及组织样本采集流程，可在观察者之间提高一致性，同时增强心血管疾病实验研究的可比性和可重复性。

样本采集自两只狗（Canis lupus familiaris）（一只3岁雄性法国斗牛犬和一只8岁雌性混种犬）、一只猫（Felis catus）（一只6岁雄性欧洲短毛猫）、一只家猪（Sus scrofa domesticus）（一只1岁雄性大白猪）和一头牛（Bos taurus）（一只2月龄雌性荷斯坦牛）。 所选的每一种物种均作为不同心血管疾病的模型具有特定用途；例如，狗是心律失常建模的首选模型；猫因其肥厚型心肌病（HCM）发病率最高，是HCM研究的首选模型；猪被用作急性心肌梗死的模型；而反刍动物由于在草地上易接触毒素，常被用作中毒研究的模型11。

本文提供了一种尸体剖检方案和两种心脏解剖方案，旨在改进实验性心血管疾病中心脏的大体和组织学检查。所述方案基于兽医教科书1,2,4,5,6,7,8,9,10,11,12、期刊文献3,13,14、官方文件15以及网络研讨会16,17中的信息而制定。本研究中所用样本来自提交至克卢日-纳波卡大学兽医科学与动物科学国立大学（USAMV Cluj-Napoca）病理学系进行常规尸体剖检诊断的动物尸体。

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方案

本实验方案已获得农业科学与兽医学大学克卢日-纳波卡分校生物伦理委员会的伦理批准（编号：311/2022），符合国家（2014年第43号法律）和欧洲（2010年欧盟第63号指令）相关法规要求。有关本方案中使用的所有材料和仪器的详细信息，请参见材料表。

1. 尸检方案

注意：建议对所有物种采用相同的剖检方案，因为这样操作更简便，易于实施2,12。以下步骤为对一只中型犬实施的剖检过程。在对不同对象进行剖检时，应相应调整这些步骤。

  1. 称重受试对象，并将其置于解剖台上，左侧朝下（图1A）。继续对受检者进行外部检查（通过视诊和触诊皮肤及黏膜，记录颜色、质地和体积的所有变化）。
  2. 使用刀片（或手术刀）在右侧腋窝处做一个7 cm的切口图1A).
  3. 定位髋股关节图1A，B）。用刀切开胶囊，切断股骨头韧带（图1B).
  4. 使用手术刀将腋窝处的皮肤切口向前延伸至下颌联合，向后延伸至会阴部图1B).
  5. 用手术刀去除皮肤，暴露从腹侧正中线至椎体横突水平的胸腹壁图1B).
  6. 使用手术刀和镊子，在右侧肋弓腹侧尾端处切开腹壁形成一个皮瓣。用剪刀打开腹腔——沿右侧季肋区的尾侧进行剪开图1B).
  7. 沿右侧腰旁区域向尾侧延伸切口，直至髂外嵴。随后，继续延伸切口至腹白线的耻骨附着处。
  8. 简要地检查腹部器官 原位 （记录器官颜色、质地、体积和位置的任何变化）).
  9. 使用手术刀和镊子，在膈肌最高点处穿刺（图1B).
  10. 使用骨剪沿两条纵向切口切除右侧肋骨，进入胸腔。切断肋骨的胸骨旁软骨部分。接着，在靠近肋椎关节处切断肋骨的背侧部分。图1C).
  11. 检查心脏 原位 (图1C）。注意其大小、位置、颜色、与邻近组织的连接关系，并通过触诊评估质地的任何变化9.
    注意：如果存在血栓形成或先天性心脏病，必须对心脏进行解剖 原位 （该方法可对大血管进行完整检查）。
  12. 使用剪刀沿心脏基底部至心尖部做纵向切口，检查并打开心包腔。观察心包腔和心外膜（注意颜色、质地和液体量的任何变化）。12.
  13. 用剪刀松解心脏，获取主动脉、肺动脉干和上下腔静脉的横切面。上腔静脉应在距离其进入右心房入口至少1厘米以上的部位进行切断，以保留 终嵴11,13.
  14. 观察器官的外部轮廓、心外膜的外观、透过心外膜所见心肌的外观，以及大血管的外部形态。图2A).
    注意：通常情况下，不同物种间心包的切开与检查存在一些差异。心包腔的检查首先通过心包膜的透明部分对外部进行视诊和评估，以观察心包腔的整体内容物1,2在猫或狗中，心包通常含有约0.25 mL/kg的稀薄、清澈、半透明至淡黄色液体9若有病理性积液，应使用无菌注射器或真空采血管收集。

2. 解剖方案

注意：心脏尸检有多种技术，每种均有若干优势。本方案选用其中两种最常用的技术：1） "流入-流出法，" 可更清晰地观察瓣膜和心内膜，是多数物种常用的检查方案2,11,12,16，以及 2） "四腔解剖"/"超声心动图切面" 技术，通常用于猫或小型犬1,17.

  1. 心脏解剖的"流入-流出法"2,11,12,16
    1. 将心脏置于心房面向上的位置（图2A）。
    2. 使用剪刀和无齿镊子，从后腔静脉沿右心房方向广泛剪开（图2B）。继续剪开至右心耳，以暴露crista terminalis/窦房结（SA结）。从背侧观察三尖瓣。
    3. 从右心房剪开至右心室与室间隔的连接处（图2C）。显露右房室瓣。
    4. 沿室间隔方向切开右心室游离壁。继续切开直至肺动脉干起始部（图2C,D）。
    5. 仔细检查右房室瓣，包括chordae tendineae（腱索）和乳头肌（图2D）。剪断chordae tendineae（腱索）。
    6. 将镊子插入肺动脉干，并沿其纵轴剪开肺动脉干（图2E）。检查肺动脉流出道、肺动脉干起始部及半月瓣。
    7. 从肺静脉处剪开左心房，直至左心耳尖端（图2F）。从背侧观察二尖瓣（又称二尖瓣或僧帽瓣）。
    8. 将心脏置于室间隔朝下的位置（图2F）。从心室基底部至心尖处，在心室游离壁上做一个大切口。完全显露左房室瓣。
    9. 剪断左房室瓣瓣叶的chordae tendineae（腱索）。
    10. 将镊子插入左心室流出道，并以此为引导切开主动脉（图2G）。
    11. 使用生理盐水彻底清除所有血栓。待所有血栓清除后，评估心脏重量，并与体重或标准心脏重量表进行比较（表1）11,13。
    12. 称量心脏重量。
    13. 若仅以窦房结为观察重点，在完成左心室检查后，将整个心脏完全浸入10%中性缓冲福尔马林（NBF）中固定24小时，随后修剪右心房以取材crista terminalis区域。
      注：通过该技术可清晰观察左、右心室。左、右心室壁厚度之比通常为3:1，不同物种和品种间略有差异；在胎儿心脏中，该比例为1:112。

组织学取样方案16

  1. 使用手术刀，在右心房、三尖瓣和右心室游离壁区域做两条纵向平行切口（间距约 5 mm）（图 2I）。
  2. 在左心房、二尖瓣、背侧乳头肌和左心室区域做两条纵向平行切口（间距约 5 mm）（图 2H）。
  3. 在心脏背侧上三分之一区域，沿包含室间隔、右心房、主动脉、主动脉瓣和三尖瓣的切线横向切断心脏基底部（图 2J）。
  4. 在主动脉基底部和室间隔区域做两条纵向平行切口（图 2J）。
  5. 在crista terminalis周围修剪右心房，并沿crista的长轴方向进行若干条横向平行切片（间距约 3–4 mm），以获得六个窦房结组织块（图 3、图 4I 和 图 5H）。
  6. 将获取的组织修剪后放入组织学包埋盒中。
    注：推荐包埋方案：步骤 3.1——组织学包埋块 1（图 6 显示该包埋块所得切片），步骤 3.2——组织学包埋块 2（图 7 显示该包埋块所得切片），步骤 3.4——组织学包埋块 3（图 8 显示该包埋块所得切片），步骤 3.5——组织学包埋块 4（图 9 显示该包埋块所得切片）。
  7. 将组织浸入 10% 中性缓冲福尔马林（NBF）中固定至少 48 小时。

4. 冠状动脉取样3,10,14

  1. 使用镊子和手术刀从心脏的冠状沟中解剖出冠状动脉（图4K）。将冠状动脉在10%中性缓冲福尔马林（NBF）中固定过夜。
  2. 如有需要，用8%甲酸与盐酸按1:1比例配制的混合液充分脱钙。
  3. 每隔3 mm进行多次横向切割。将切下的组织放入包埋盒中，随后将包埋盒置于10% NBF中，直至包埋。
    注意：猪可作为人类心脏的模型，尤其是在冠心病研究方面。因此，建议额外采集冠状动脉的补充样本并制备组织学切片3,10,14。

5. 该 "四个腔室"/"超声心动图切面" 心脏解剖技术1,17

注意：四腔切开技术包括从心脏基底部至心尖进行切开，以获得标准视图1。该"四腔"技术最适用于固定组织。

  1. 将整个心脏放入10%中性缓冲福尔马林（NBF）中固定至少48小时。
  2. 心脏在10% NBF中固定至少48小时后（图10A），使用两把无齿直解剖镊，一把经上腔静脉-右心房-三尖瓣-右心室插入，另一把经肺静脉-左心房-二尖瓣-左心室插入（图10B）。
  3. 以镊子臂之间的空隙为引导，从心脏基底部至心尖进行切割（图10C）。在包含主动脉的心脏节段上，距上述切面约5 mm处，再做一个额外的纵向切面。
  4. 通过横向切口，将心脏基底部与心尖完全分离。将每一块组织片段放入组织学包埋盒中。
    注：推荐的包埋方案：心尖部分对应组织学包埋块5（图11A显示该包埋块制得的切片），心脏基底部对应组织学包埋块6（图11B显示该包埋块制得的切片）。
  5. 将包埋盒置于10% NBF中直至包埋。所有心脏样本均用10% NBF固定（固定液体积应超过组织体积10倍以上），常规进行石蜡包埋处理，切片厚度为4 µm，并按照先前描述的方案进行苏木精-伊红染色（H&E染色）10。
    注：若怀疑心肌炎，"应使用无菌手术器械和无菌样本容器，在无菌条件下保留一份新鲜心脏组织，用于微生物学和病毒学研究"13。

6. 摄影记录

注意：摄影记录是尸检检查中的可选步骤。然而，摄影和视频记录对于"正常与异常解剖结构的准确记录"3至关重要。

  1. 为获得准确的摄影记录，在进行"心脏组织逐层解剖"13时应拍摄数字图像。请参照摄影记录与拍照的指南15 ，拍摄心脏的整体观——前侧与后侧视图、心脏切片以及任何可疑病灶。

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结果

本方案用于在四种不同物种（狗、猫、猪和牛）中可视化心脏的解剖结构并采集样本以进行组织学检查。上述每种物种均重复执行了尸检方案，但仅以狗为例进行图示说明。尸检方案首先对尸体进行广泛的外部检查（图1A）（包括皮肤、可探查的淋巴结和体表黏膜），测量总体重，并评估动物的一般状态。完成外部检查后，尸检继续进行部分剥皮（以便彻底检查皮下组织和浅层肌肉），并打开主要体腔（图1B-D）。

腹腔通常是首先被检查的部位（图1C），随后进行广泛的 原位 腹腔及腹部器官的检查，随后切开膈肌，最后移除右侧胸腔半部（图1D）。通过该技术，可获得良好的 原位 胸腹部器官（包括心包腔和心脏）的检查可同时进行，从而能够准确评估这些器官与局部血管、淋巴管、韧带及神经之间的连接关系...

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讨论

在执行本方案时，有几个关键步骤需要仔细考虑，以确保结果的一致性。在年轻动物中，心脏测量值与成年动物不同（包括心室壁厚度），通常心脏占体重的比例更大11,12。心室肥厚的程度可通过一个通用的重量公式进行量化，即左心室加室间隔重量与游离右心室重量的比值，在正常情况下，成年动物该比值应为2.8–4.0（表 1）。若该比值超过4.0，提示存在左心室肥厚；若低于2.8，则提示存在右心室肥厚4,11,12。为获得各心腔的重量，需沿室间隔和冠状沟将右心室游离壁解剖分离，使之与右心房分开。左心室与左心房的分离则在房室环处进行4。

心脏通过切断大血管与身体分离。若大血管的切断位置过于靠...

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披露

作者声明无利益冲突。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.9% 氯化钠溶液B. BRAUN MELSUNGEN AGW04479004用于冲洗心脏中的全部血液及血凝块。
10% 中性缓冲福尔马林（NBF） Q Path11699404用于采集组织病理学样本的材料。
骨组织剪HELEN SRLLS109HV坚固的骨切割器械。
切割板Ambition86304便于操作及器官切割。
脱钙液Thermo Scientific TBD-267640048% 甲酸与盐酸按 1:1 比例混合的溶液。
数码相机Canon Inc.PowerShot SX540 HS用于摄影及录像记录。
镊子MKD-Medicale15-430解剖器械。
组织学包埋盒 Q Path720-2215用于采集组织病理学样本。
尺寸：3 × 2.5 × 0.4 cm
刀具TEHNO FOOD COM SERV SRLD2006/15用于切割软组织的锋利刀片。
乳胶手套MKD-MedicaleSANTEX-S防护设备。
口罩MKD-Medicale21221防护设备。
培养皿MKD-Medicale0598-1V用于采集辅助检测样本的材料。
塑料容器Corning GosselinTP200-02用于采集组织病理学样本的材料。
天平ESPERANZAMEEKS008用于称量器官。
体重秤White Deals72用于称量实验对象。
手术刀MKD-Medicale10322E用于切割软组织的锋利刀片。
剪刀MKD-Medicale13-260解剖器械。
手术刷MKD-Medicale410100-52防护设备。
注射器MKD-Medicale10573EU用于采集辅助检测样本的材料。

参考文献

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  13. Autopsypathology.net. , Available from: http://autopsypathology.net/wpcontent/uploads/2016/02/rcpath_cardiacdeath_jul2015.pdf (2021).
  14. Pathology.ucla.edu. , Available from: http://pathology.ucla.edu/workfiles/Education/Residency%20Program/Gross%20Manual/Endomyocardial%20Biopsy%20(EMB).pdf (2021).
  15. Arbeitsgruppen Sudden Cardiac Death. , Available from: http://www.sgrm.ch/medizin/arbeitsgruppen/sudden-cardiac-death.html (2021).
  16. Toxpath.org. , Available from: https://www.toxpath.org/Trimming-N-Collection-Training.asp (2021).
  17. YouTube.com. , Available from: httpswwwyoutubecomwatchvxkJ2WGqi2Qw&t2494s (2021).

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