本方案描述了一种利用3D打印的印章式装置，以低成本大规模制备组织球体的技术。
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摘要
摘要
三维细胞培养技术的进步已开发出更具生理相关性的体外（in vitro）模型，例如组织类球体。以类球体形式培养的细胞具有更接近体内（in vivo）环境的真实生物学反应。由于其优势，组织类球体正成为一种新兴趋势，代表着更优越、更可靠且更具预测性的研究模型，在生物技术领域具有广泛的应用前景。然而，能够实现组织类球体大规模生产的可重复性平台，已成为充分挖掘和提升其潜力尚未满足的需求。本文报道了一种低成本且省时的方法，用于实现均一组织类球体的大规模生产。开发了一种3D打印的印章式装置，可在每块6孔板中生成多达4,716个类球体。该装置采用光固化树脂通过立体光刻技术制造而成，最终装置由圆柱形微针组成，高度为1.3 mm，宽度为650 µm。该方法可快速生成形态和大小均一的均一类球体以及共培养类球体，且细胞存活率超过>95%。此外，该印章式装置可适配不同规格的孔板和培养皿。其易于灭菌，并可长期重复使用。均一组织类球体的高效大规模生产对于推动其在多个工业领域的转化应用至关重要，例如组织工程、药物开发、疾病建模以及按需个性化医疗。
引言
组织球体是由细胞悬液在无外力作用下通过自组装形成的三维微组织1。由于其结构特征与人体生理系统的关键特性相似，这些球体已在生物制造方案中得到广泛应用2,3。与传统的单层细胞培养相比，组织球体在代谢、细胞骨架动态、细胞活力以及代谢和分泌活性方面更为接近体内真实情况1。由于其具有融合能力，还可作为构建单元（例如用于生物打印方案），用于构建具有更高生物学相关性的复杂组织工程结构4,5。
由于组织类球体具有重要的生物学意义，已被用作生物技术工具，广泛应用于组织工程、药物开发、疾病建模以及纳米毒理学评估等多种实验方案中，有效减少了实验时间、空间成本以及动物实验的使用3,6,7,8。然而，为了充分挖掘并利用组织类球体的潜力，亟需建立可靠且可重复的大规模制备方法，而这一目标仍是当前面临的重要挑战。
生成球形体的方法有多种，例如悬滴法、包被的U型底孔板、微流控技术以及使用聚合物基质9,10。尽管这些方法为球形体生产领域奠定了基础，但它们仍然存在操作复杂、耗时长、劳动强度大或成本高昂等问题10。
本方案介绍了一种低成本且省时的方法，用于大规模制备均一的组织类球体。我们开发了一种3D打印的印章式装置，可在6孔板中一次性生成多达4,716个类球体。此外，该印章式装置可根据需要进行调整，以在每个孔中产生更多类球体，适用于不同规格的细胞培养板。该装置易于灭菌，可长期重复使用。均一组织类球体的高效大规模生产对于推动其在临床中的应用至关重要，将有助于组织工程、药物开发、疾病建模以及按需个性化医疗等多个产业领域的发展。
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方案
本研究使用了L929细胞系（小鼠成纤维细胞）。印章状的3D打印可降解装置购自商业来源（见材料表）。整个实验过程均遵循良好的细胞培养规范和无菌操作技术。制备好的装置通过70%酒精擦拭并暴露于紫外线下照射15分钟进行灭菌。细胞培养基和溶液在接触细胞或组织球体前均预热至37 °C。本实验方案的示意图见图1。
1. 从印章状装置制备非粘附性模具
- 按照以下步骤制备2% (w/v) 琼脂糖凝胶。
- 将琼脂糖粉末溶于磷酸盐缓冲液（1× PBS）中，并通过环形搅拌使所得悬浮液均匀混合。
注意：该溶液可置于玻璃瓶中。此步骤中，琼脂糖溶液不会呈透明状态。 - 将玻璃瓶放入微波炉中，设定加热30秒。每隔5秒暂停微波炉，取出玻璃瓶，并通过环形搅拌手动均质化溶液。需持续加热直至溶液达到液态且清澈透明的状态。
注意：也可使用电热板代替微波炉。加热完成后，溶液必须呈透明/澄清状态。 - 向实验所用的6孔板中每个孔加入1 mL琼脂糖溶液。
- 静置约15分钟，或直至琼脂糖完全凝固。
注意：可使用冷却板以缩短凝固时间。 - 加入1–2 mL琼脂糖溶液，并将装置轻轻放置于液态琼脂糖上方。
注意：装置的放置必须小心进行，以防止琼脂糖与装置界面处产生气泡。 - 静置约30分钟，或直至琼脂糖完全凝固。
注意：可使用冷却板以缩短凝固时间。 - 小心地将装置从琼脂糖中轻轻取出。
注意：取出过程至关重要，必须谨慎操作以保持琼脂糖结构完整；否则可能导致琼脂糖破损。 - 加入2 mL DMEM培养基，静置10分钟，弃去培养基后更换新鲜DMEM培养基。重复此步骤三次，以充分清洗孔内环境。
- 加入2 mL DMEM培养基，将6孔板置于培养箱中（37 °C，5% CO2 和80%湿度），直至进行细胞接种（图2A–F，补充视频1）。
- 将琼脂糖粉末溶于磷酸盐缓冲液（1× PBS）中，并通过环形搅拌使所得悬浮液均匀混合。
2. 组织球体的生成
注意：不同细胞系具有不同的黏附特性。因此，采用本方法时，某些类型的细胞可能无法正常形成组织球状体。
- 按照传统的单层培养方法培养细胞（即在细胞培养瓶中使用添加了10%胎牛血清（FBS）、100 µg/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的低糖DMEM培养基）（参见材料表）。将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养，并持续观察直至细胞融合度达到80%。
- 当细胞达到理想的融合度后，用1× PBS洗涤细胞。
注：建议对25 cm2培养瓶使用5 mL PBS，对75 cm2培养瓶使用10 mL PBS，对150 cm2培养瓶使用15 mL PBS。 - 加入消化酶，在37 °C、5% CO2及80%湿度条件下孵育2–5分钟。
注：本研究使用含0.78 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的0.125%胰蛋白酶作为消化酶（参见材料表）。 - 观察细胞从培养瓶表面脱落的情况，随后加入含FBS的完全培养基以中和细胞消化酶的作用。
注：本研究中使用的培养基为添加了10% FBS的低糖DMEM（参见材料表）。 - 将细胞悬液在室温下以400 × g离心5分钟，然后手动计数细胞。
- 每管取50 × 105个细胞，加入5 mL 1× PBS。
注：接种的细胞数量会影响最终组织球体的直径。因此，可通过增加细胞数量来生成直径更大的组织球体。 - 将细胞悬液在室温下以400 × g离心5分钟。
- 用移液器吸除上清液，加入1 mL细胞培养基，并混匀溶液。
注：本研究使用完全培养基，即低糖DMEM培养基添加10% FBS、100 µg/mL青霉素和100 µg/mL链霉素。 - 从6孔板（步骤1.1.9）中移除2 mL培养基，将1 mL细胞悬液加至由3D打印可降解装置形成的琼脂糖模具中央（步骤1.1.7）。等待细胞沉降到微孔中（约20–30分钟），然后小心地向孔中加入1 mL细胞培养基。
注：此步骤需格外小心。建议缓慢加入培养基，将移液器枪头靠近孔壁，并分次少量加入。 - 将6孔板放入培养箱（37 °C、5% CO2、80%湿度）中，使组织球体形成（约需24–48小时，具体时间取决于细胞类型）（图3）。
注：不同类型的细胞（如癌细胞、原代细胞）具有不同的自组装动力学特征11。
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结果
使用3D打印的印章样装置生成均一的微组织切片
通过光固化立体成型技术（stereolithography）12，使用光固化树脂成功制备了3D打印的印章样装置（图2A）。最终装置由圆柱形微针组成，微针高度为1.3 mm，宽度为650 µm（图2A）。该装置作为主模具用于制备非黏附性微组织切片时，能够保持其几何结构（图2B–F 及 补充视频1）。该装置使用简便、易于灭菌，并可长期重复使用。此外，该装置还可适配不同规格的多孔板（如6孔、12孔、24孔、96孔板）和培养皿（如30 mm、50 mm、90 mm、150 mm）。本文展示的是适用于6孔板的装置数据。该装置每孔可生成750个均一的微组织切片，整个6孔板共可生成4,716个微组织切片（
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讨论
本方案描述了一种简单、快速且低成本的大规模生产组织球体的方法。使用一种类似印章的3D打印装置作为主模具，每个6孔板可生成多达4,716个球体。研究表明，以球体形式培养的细胞具有更接近体内真实情况的生物学反应，其行为更接近于 体内 环境1由于其优势，组织类球体正成为一种新兴趋势，代表着更优越、更可靠且更具预测性的研究模型13,14因此，开发新的方法以实现大规模生产对于推动其应用至关重要。
采用本方法成功生成组织球体时，需谨慎执行若干关键步骤，例如将装置插入液态琼脂糖中，以避免产生气泡。气泡的存在可能影响微组织切片区的正确成型。相应地，在琼脂糖完全凝固前移除装置，可能导致琼脂糖模具破裂。这些步骤对于制备适用于组织球体形成的琼脂糖模具至关重要。所生成的一批球体在形态和大小上的变异应尽可能小。因此，细胞接种至琼脂糖模具后，缓慢加入培养基是决定性环节之一。此过程需轻柔加液，以免扰动已进入微组织切片区的细胞。否则...
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披露
这种3D打印的印章式装置由初创公司Bioedtech提供，Janaína Dernovsek是该公司的联合创始人兼创新总监。作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本研究得到了里约热内卢州研究支持基金会（FAPERJ，巴西）、高等教育人员改进协调机构（CAPES，巴西）以及巴西国家科学技术发展理事会（CNPq，巴西）的支持。我们感谢Bioedtech提供本研究中使用的印章状装置，并感谢免疫药理学实验室的Bartira Bergmann教授提供细胞培养设施的使用。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 6孔板 | 默克 | CLS3516 | |
| 琼脂糖 | Promega | V3121 | |
| 生物装置 | Bioedtech | ||
| 生物安全柜 | 赛默飞世尔科技 | 51029701 | |
| 离心 | ThermoFisher | 75004031 | |
| Corning 50 mL 离心管 | 默克 | CLS430829-500EA | |
| Corning 细胞培养瓶 表面积 75 cm²2 | 默克 | CLS430641 | |
| 预混树脂 | FormLabs | FLDRBL01 | |
| 杜尔贝科′s 改良伊格尔′s 中等-低葡萄糖培养基 | 默克 | D6046 | |
| 胎牛血清（FBS） | 赛默飞世尔科技 | 16000044 | |
| 表 2 | FormLabs | ||
| 培养箱 | 赛默飞世尔科技 | 51033782 | |
| L929 细胞系 | 在实验室中建立 | ||
| 青霉素和链霉素（PS） | 赛默飞世尔科技 | 15140122 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | 默克 | 806552 | |
| 含EDTA的胰蛋白酶 | 默克 | T3924 |
参考文献
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