方法文章

直接测量重建的活性微管束内部作用力

DOI：

10.3791/63819

⸱

2022年5月10日

 ,  , 
1Department of Biological Sciences and Center for Biotechnology and Interdisciplinary Studies, Rensselaer Polytechnic Institute

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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此处，我们介绍一种微管束的重建方案 体外 利用同步的光镊捕获与全内反射荧光显微镜技术，直接量化活性微管网络中蛋白质复合物所产生的力和位移。该检测方法可实现对活性微管网络内蛋白质群体所生成的力与位移在纳米尺度上的精确测量。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

微管网络在细胞中被用于执行多种任务，从作为囊泡运输的轨道，到在有丝分裂期间形成特化的阵列以调控染色体分离。与微管相互作用的蛋白质包括驱动蛋白和动力蛋白等马达蛋白，它们能够产生主动作用力和定向运动，也包括非马达蛋白，后者可将微丝交联成更高阶的网络结构或调控微丝动力学。迄今为止，针对微管相关蛋白的生物物理研究主要集中于单个马达蛋白在囊泡运输中的作用，关于驱动蛋白和动力蛋白的力生成特性及其机械化学调控机制已取得显著进展。然而，对于微管既作为货物又作为轨道的过程（如有丝分裂纺锤体内部微丝滑动），目前对参与其中的交联蛋白集合体的生物物理调控机制仍知之甚少。本文中，我们详细描述了一种直接探测由纯化微管和有丝分裂蛋白重建的最小化交联微管网络中力生成与响应的方法。将一对微管通过目标蛋白交联，其中一根微管固定于显微镜盖玻片上，另一根微管则由光镊操控。同时结合全内反射荧光显微镜技术，可在微丝滑动分离并产生作用力的过程中，实现对该微管网络所有组分的多通道可视化观察。我们还展示了如何利用这些技术探测由驱动蛋白-5集合体施加的推力，以及由有丝分裂微管相关蛋白PRC1交联的滑动微管对之间产生的黏滞制动阻力。这些检测方法为理解纺锤体组装与功能机制提供了重要见解，并可进一步推广应用于研究多种情境下致密微管网络的力学特性，例如神经元的轴突与树突，以及极化上皮细胞中的微管网络。

引言

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细胞利用微管网络执行多种机械任务，从囊泡运输1,2,3到有丝分裂过程中的染色体分离4,5,6。许多与微管相互作用的蛋白质，例如分子马达蛋白驱动蛋白（kinesin）和动力蛋白（dynein），能够产生作用力，并受到机械负荷的调控。为了更深入地理解这些关键分子的功能机制，研究人员已采用单分子生物物理方法，如光镊技术和全内反射荧光显微镜（TIRF），直接监测单个蛋白质的关键参数，包括无负载步进速率、持续运动性以及力-速度关系。最常用的实验构型是将马达蛋白直接连接到捕获微球上，微球的球形几何形状和尺寸可模拟由马达驱动运输的囊泡。已有大量驱动蛋白家族成员，包括kinesin-17,8,9、kinesin-210,11,

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方案

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1. 微管的制备

注意：使用GFP标记的交联蛋白时，微管的红色（例如罗丹明）和远红外（例如生物素化的HiLyte647，在本文其余部分称为生物素化的远红外）有机荧光染料标记效果良好。通过使用高质量的四通道全内反射荧光（TIRF）滤光片，可在成像过程中实现三个通道之间极小的串扰。

  1. 制备 GMPCPP 微管种子储备液
    1. 将 1 mg 未标记的冻干微管蛋白悬浮于 84 µL 冰冷的 1× BRB80（80 mM PIPES、1 mM MgCl2、1 mM EGTA；pH 6.8）中，并在使用前加入 DTT 至终浓度为 1 mM。将 60 µg 荧光标记的冻干微管蛋白悬浮于 6 µL 含 1 mM DTT 的冷 1× BRB80 中。将 60 µg 生物素标记的冻干微管蛋白悬浮于 6 µL 含 1 mM DTT 的冷 1× BRB80 中。
    2. 为制备荧光标记比例为 1:10 的非生物素化罗丹明标记微管蛋白种子储备液，向一个 0.5 mL 离心管中加入 84 µL 未标记微管蛋白、6 µL 荧光标记微管蛋白和 10 µL 10 mM GMPCPP 储备液。轻轻吹打混匀，并置于冰上保存。
      注意：本实验优先采用 GMPCPP 诱导聚合，因为由此生成的微管比使用 GTP 聚合或未添加紫杉醇时更稳定，更适合光镊直接操控。
    3. 为制备荧光标记....

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结果

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如果满足若干关键标准，则认为已成功制备出适用于生物物理分析的微管束。首先，三色成像应显示两条排列整齐的微管，且交联蛋白的浓度在重叠区域较高（图5B、C和 图6B）。理想情况下，罗丹明标记微管的重叠边缘与其游离末端之间的距离应至少为5 µm，以便在捕获光束与荧光标记蛋白之间提供足够的物理空间。其次，在缺乏生物素化远红微管的区域，背景荧光信号应尽可能低，尤其是与交联蛋白标记所用通道对应的信号。较高的背景荧光通常表明盖玻片钝化效果不佳，以及存在大量非特异性结合于玻璃表面的蛋白质，这些蛋白质可能与微管或捕获微珠发生非特异性相互作用。此外，若在任一微管成像通道中观察到微小的圆形斑点或短片段，则提示微管聚合和纯化过程不成功，或微管已老化或受损。

第三，用于捕获的微珠应呈现为单个微珠，而非聚集在含有多个微珠的团块中。尽管可能有少量微珠会不可逆地黏附于表面，但应观察到大部分微珠以单个颗粒的形式在样品腔内自由扩散。.......

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讨论

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多种细胞类型利用微管网络来完成大量本质上具有机械性质的任务。为了阐明细胞在健康和疾病状态下的功能，关键在于理解这些微米尺度的网络是如何由共同构建它们的纳米级蛋白质进行组织和调控的。诸如光镊等生物物理工具非常适合在该尺度上研究关键蛋白质的力化学特性。鉴于微管网络功能的多样性，研究人员已探索了多种采用光镊的复杂实验构型，包括对微管末端动力学的力依赖性分析67,68、着丝粒组分产生力学力的研究69,70,71，以及利用双光束哑铃陷阱构型探测微管丝状结构的力学特性72,73。在本实验方案中，我们描述了重建微管网络基本结构模式（如微管束）的新方法，并应用单分子荧光显微镜和光镊等生物物理工具，以获取有关细胞功能的关键信息。

.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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作者希望感谢以下资助的支持：R21 AG067436（资助对象：JP 和 SF）、T32 AG057464（资助对象：ET）以及伦斯勒理工学院理学院启动资金（资助对象：SF）。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10W 掺镱光纤激光器，1064nmIPG PhotonicsYLR-10-1064-LP
适用于TIRF应用的405/488/561/640nm四波段激光组合ChromaTRF89901v2
6x His标签抗体，生物素偶联物Invitrogen#MA1-21315-BTIN
丙酮，HPLC级Fisher Scientific18-608-395
牛乳α-酪蛋白Sigma1002484390
ATPFisher ScientificBP413-25
苯甲酸酶（Benzonase）Novagen70746-3
生物素-PEG-SVA-5000Laysan Bio, Inc.NC0479433
BL21 (DE3) Rosetta感受态细胞Millipore Sigma71-400-3
过氧化氢酶（Catalase）MP Biomedicals LLC190311
CFI Apo 100X/1.49NA油浸TIRF物镜NikonN/A
氯霉素（Chloramphenicol）ACROS Organics227920250
盖玻片迷你架，适用于8个盖玻片Fisher ScientificC14784
精密任务擦拭纸Kimberly-Clark34120
无水葡萄糖Fisher ScientificBP3501
D-蔗糖Fisher ScientificBP220-1
DTTFisher ScientificBP172-25
Ecoline浸入式恒温器E100配003浴槽LAUDA-Brinkmann27709
EDTAFisher ScientificBP118-500
EGTAMillipore Corporation32462-25GM
FIJI / Image Jhttps://fiji.sc/N/A
磨砂载玻片Corning12-553-1075mm×25mm，厚度0.9-1.1mm
葡萄糖氧化酶MP Biomedicals LLC195196Ⅶ型，不含额外氧气
GMPCPPJena BiosciencesJBS-NU-405S可在-20 °C下保存数月，在-80 °C下可保存长达一年
Gold Seal盖玻片Thermo Scientific3405
HEPESFisher ScientificBP310-500
咪唑（Imidazole）Fisher Scientific03196-500
IPTGFisher ScientificBP1755-10
实验室干燥器Bel-Art999320237190mm板尺寸
硫酸卡那霉素Fischer ScientificBP906-5
KIF5A K439（氨基酸：1-439）-6HisGilbert Lab, RPIN/Adoi.org/10.1074/jbc.RA118.002182
Kimwipe擦拭纸Kimberley ClarkZ188956无尘纸
浸油，B型Cargille16484
镜头纸ThorLabsMC-5
LuNA激光发射装置（四通道：405、488、561、640nm）NikonN/A
溶菌酶（Lysozyme）MP Biomedicals LLC100834
四水合乙酸镁Fisher ScientificBP215-500
Microfuge 18离心机Beckman Coulter367160
MPEG-SVA 分子量5000Laysan Bio, Inc.NC0107576
中性亲和素（Neutravadin）InvitrogenPI31000
Nikon Ti-E倒置显微镜NikonN/ANikon LuN4激光器
Ni-NTA树脂Thermo Scientific88221
寡核苷酸 - CACCTATTCTGAGTTTGCGCGA
GAACTTTCAAAGGC		IDTN/A
寡核苷酸 - GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA
ACTCAGAATAGGTG		IDTN/A
开放式厚壁聚碳酸酯管，0.2 mL，7 mm × 22 mmBeckman Coulter343755
Optima-TLX超速离心机Beckman Coulter361544
紫杉醇（Taxol等效物）Thermo Fisher ScientificP3456
PIPESACROS Organics172615000
PMSFMillipore7110-5GM
猪源微管蛋白，生物素标记Cytoskeleton, Inc.T333P
猪源微管蛋白，HiLyte 647荧光标记Cytoskeleton, Inc.TL670M远红荧光标记
猪源微管蛋白，罗丹明标记Cytoskeleton, Inc.TL590M
猪源微管蛋白，微管蛋白蛋白Cytoskeleton, Inc.T240
乙酸钾Fisher ScientificBP364-500
Prime 95B sCMOS相机PhotometricN/A
四象限探测器传感器头ThorLabsPDQ80A
Quikchange Lightning试剂盒Agilent Technologies210518
碳酸氢钠Fisher ScientificS233-500
无水磷酸氢二钠Fisher ScientificBP332-500
方形盖玻片Corning12-553-45018 mm × 18 mm，厚度0.13-0.17 mm
链霉亲和素微球Polysciences Inc.24162-1
Superose-6层析柱GE Healthcare29-0915--96
TCEPThermo Scientific77720
TLA-100固定角转子Beckman Coulter343840
超声波清洗机（超声破碎仪）VevorJPS-08A(DD)304不锈钢，40 kHz频率，60 W功率
Vectabond APTES溶液Vector LaboratoriesSP-1800-7
含氨-D的Windex强力玻璃清洁剂S.C. JohnsonSJN695237

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bentley, M., Banker, G. The cellular mechanisms that maintain neuronal polarity. Nature Reviews Neuroscience. 17 (10), 611-622 (2016).
  2. Yang, R., et al. A novel strategy to visualize vesicle-bound kinesins reveals the diversity of kinesin-m....

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5 PRC1

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