方法文章

直接测量重建的活性微管束内部作用力

DOI：

10.3791/63819

⸱

2022年5月10日

 ,  , 
1Department of Biological Sciences and Center for Biotechnology and Interdisciplinary Studies, Rensselaer Polytechnic Institute

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

此处，我们介绍一种微管束的重建方案 体外 利用同步的光镊捕获与全内反射荧光显微镜技术，直接量化活性微管网络中蛋白质复合物所产生的力和位移。该检测方法可实现对活性微管网络内蛋白质群体所生成的力与位移在纳米尺度上的精确测量。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

微管网络在细胞中被用于执行多种任务，从作为囊泡运输的轨道，到在有丝分裂期间形成特化的阵列以调控染色体分离。与微管相互作用的蛋白质包括驱动蛋白和动力蛋白等马达蛋白，它们能够产生主动作用力和定向运动，也包括非马达蛋白，后者可将微丝交联成更高阶的网络结构或调控微丝动力学。迄今为止，针对微管相关蛋白的生物物理研究主要集中于单个马达蛋白在囊泡运输中的作用，关于驱动蛋白和动力蛋白的力生成特性及其机械化学调控机制已取得显著进展。然而，对于微管既作为货物又作为轨道的过程（如有丝分裂纺锤体内部微丝滑动），目前对参与其中的交联蛋白集合体的生物物理调控机制仍知之甚少。本文中，我们详细描述了一种直接探测由纯化微管和有丝分裂蛋白重建的最小化交联微管网络中力生成与响应的方法。将一对微管通过目标蛋白交联，其中一根微管固定于显微镜盖玻片上，另一根微管则由光镊操控。同时结合全内反射荧光显微镜技术，可在微丝滑动分离并产生作用力的过程中，实现对该微管网络所有组分的多通道可视化观察。我们还展示了如何利用这些技术探测由驱动蛋白-5集合体施加的推力，以及由有丝分裂微管相关蛋白PRC1交联的滑动微管对之间产生的黏滞制动阻力。这些检测方法为理解纺锤体组装与功能机制提供了重要见解，并可进一步推广应用于研究多种情境下致密微管网络的力学特性，例如神经元的轴突与树突，以及极化上皮细胞中的微管网络。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

细胞利用微管网络执行多种机械任务，从囊泡运输1,2,3到有丝分裂过程中的染色体分离4,5,6。许多与微管相互作用的蛋白质，例如分子马达蛋白驱动蛋白（kinesin）和动力蛋白（dynein），能够产生作用力，并受到机械负荷的调控。为了更深入地理解这些关键分子的功能机制，研究人员已采用单分子生物物理方法，如光镊技术和全内反射荧光显微镜（TIRF），直接监测单个蛋白质的关键参数，包括无负载步进速率、持续运动性以及力-速度关系。最常用的实验构型是将马达蛋白直接连接到捕获微球上，微球的球形几何形状和尺寸可模拟由马达驱动运输的囊泡。已有大量驱动蛋白家族成员，包括kinesin-17,8,9、kinesin-210,11,12、kinesin-313,14,15,16、kinesin-517,18、kinesin-819,20，以及动力蛋白及其复合物21,22,23,24,25，通过这些方法得到了研究。

然而，在许多细胞过程中，马达蛋白和非马达蛋白均利用微管作为轨道和货物26,27。此外，在微管纤维被交联成更高级束状结构的这些情况下，这些蛋白质以复合体形式发挥作用，而非单个独立单元。例如，在分裂的体细胞中，致密的纤维网络可自我组织形成有丝分裂纺锤体装置28,29,30。纺锤体的极间微管网络具有高度动态性，其结构主要表现为负端指向纺锤体两极，正端则在纺锤体赤道区域附近相互重叠。纺锤体内的纤维通过马达蛋白（如 kinesin-531,32,33、kinesin-1234,35,36 和 kinesin-1437,38,39）或非马达蛋白（如 PRC140,41,42,43 或 NuMA44,45,46）进行交联。在诸如极向流动、中期染色体居中调控或后期染色体分离等过程中，这些纤维经常发生移动或承受机械应力47,48,49,50,51,52。因此，有丝分裂过程中微米尺度纺锤体结构的完整性，依赖于该相互作用纤维网络所产生的推力与拉力之间精细调控的平衡。然而，用于探究这种力学调控机制并阐明蛋白质复合体如何协同作用以协调微管运动、产生正确组装纺锤体所需作用力的工具，直到最近才得以发展，我们目前才刚刚开始理解定义动态微管网络的生物物理规律。

本文的目标是展示重建交联微管对所需的步骤 体外，将这些束固定在一种显微镜腔室中，该腔室可同时实现对微管和交联蛋白的荧光成像以及纳米级力的测量，并对这些数据进行稳健处理。我们详细描述了稳定聚合荧光标记微管所需的步骤、显微镜盖玻片的制备、用于光镊实验的聚苯乙烯微球的准备，以及构建能够保持其完整性的交联丝状网络的方法 体内 在允许直接进行生物物理操控的同时保持其功能特性。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 微管的制备

注意：使用GFP标记的交联蛋白时，微管的红色（例如罗丹明）和远红外（例如生物素化的HiLyte647，在本文其余部分称为生物素化的远红外）有机荧光染料标记效果良好。通过使用高质量的四通道全内反射荧光（TIRF）滤光片，可在成像过程中实现三个通道之间极小的串扰。

  1. 制备 GMPCPP 微管种子储备液
    1. 将 1 mg 未标记的冻干微管蛋白悬浮于 84 µL 冰冷的 1× BRB80（80 mM PIPES、1 mM MgCl2、1 mM EGTA；pH 6.8）中，并在使用前加入 DTT 至终浓度为 1 mM。将 60 µg 荧光标记的冻干微管蛋白悬浮于 6 µL 含 1 mM DTT 的冷 1× BRB80 中。将 60 µg 生物素标记的冻干微管蛋白悬浮于 6 µL 含 1 mM DTT 的冷 1× BRB80 中。
    2. 为制备荧光标记比例为 1:10 的非生物素化罗丹明标记微管蛋白种子储备液，向一个 0.5 mL 离心管中加入 84 µL 未标记微管蛋白、6 µL 荧光标记微管蛋白和 10 µL 10 mM GMPCPP 储备液。轻轻吹打混匀，并置于冰上保存。
      注意：本实验优先采用 GMPCPP 诱导聚合，因为由此生成的微管比使用 GTP 聚合或未添加紫杉醇时更稳定，更适合光镊直接操控。
    3. 为制备荧光标记比例为 1:10 的生物素化远红荧光标记微管蛋白种子储备液，向一个 0.5 mL 离心管中加入 80 µL 未标记微管蛋白、6 µL 荧光标记微管蛋白、4 µL 生物素标记微管蛋白和 10 µL 10 mM GMPCPP 储备液。轻轻吹打混匀，并置于冰上。将种子储备液在冰上孵育 5 分钟。
    4. 将微管蛋白溶液转移至适用于高速离心的聚碳酸酯离心管中。在约 350,000 × g 条件下于 2 °C 离心 5 分钟，以防止微管聚合，并收集上清液用于分装。此阶段微管蛋白的最终估计浓度约为 50 µM。
    5. 使用 0.2 mL PCR 管，将种子储备液分装为每管 2 µL，并用液氮速冻。分装样品可在 -80 °C 下保存长达 6 个月。
  2. 微管聚合
    1. 准备 500 µL 1× BRB80 并置于冰上。将一份生物素化远红标记和一份非生物素化罗丹明标记的种子储备液分装样品置于冰上解冻。
    2. 将种子储备液在冰上孵育 5 分钟。孵育结束后，立即向每管中加入 26 µL 1× BRB80。若需更长的微管，可将 BRB80 体积增加 5–10 µL；若需更短的微管，则减少 5 µL 聚合体积。
    3. 将微管种子储备液在 37 °C 水浴中孵育 1 小时。将 298.5 µL 室温 1× BRB80 与 1.5 µL 4 mM 紫杉醇储备液混合，配制成 20 µM 紫杉醇溶液。另准备 300 µL 1× BRB80，将两管均置于室温下保存。
    4. 将合适的高速转子预热至 30 °C，可在设定为 30 °C 的台式超速离心机中完成。从水浴中取出微管样品，于实验台室温下静置 10–15 分钟。
  3. 微管澄清
    1. 向微管生长溶液中加入 100 µL 室温 1× BRB80，通过轻弹离心管约 10 次或轻轻吹打混匀。将微管生长溶液转移至聚碳酸酯离心管中。
    2. 在聚碳酸酯管的一侧做标记，使其在离心时朝向外侧。该标记有助于定位微管沉淀，因沉淀体积极小，肉眼几乎不可见。
    3. 在约 350,000 × g 条件下于 30 °C 离心 10 分钟。离心后，尽可能检查管内微管样品是否存在沉淀。小心移除上清液，仅保留最后几微升，避免扰动沉淀。若沉淀不明显，可依据标记位置作为参考，避免触碰沉淀所在区域。
    4. 立即向微管管中加入 100 µL 含 20 µM 紫杉醇的 1× BRB80。可直接将溶液加至沉淀上；此阶段沉淀的扰动对澄清过程无显著影响。
    5. 再次在约 350,000 × g 条件下离心 10 分钟，注意确保管上的标记区域再次朝向外侧。
    6. 同前法小心移除上清液，仅保留少量液体，避免破坏微管沉淀。重复步骤 1.3.4–1.3.5，然后将微管沉淀重悬于 20–50 µL 含 20 µM 紫杉醇的 1× BRB80 中。
    7. 通过移液器吸取大部分重悬液体并轻轻吹打至沉淀上，重复 20–30 次，直至沉淀完全重悬。操作应轻柔，避免因剧烈吹打造成微管剪切损伤。剪切移液器吸头以增大开口，也有助于减少微管剪切。
    8. 将微管样品用铝箔包裹以避光，并置于实验台上室温保存。微管在澄清后通常可在 2–3 天内使用。
  4. 通过显微镜评估微管
    1. 取 1 µL 澄清后的微管溶液与 9 µL 室温 1× BRB80 混合，制备 1:10 稀释液。立即吸取 10 µL 该溶液滴加至显微镜载玻片上，盖上盖玻片压平后进行成像。
    2. 使用荧光显微镜和 100 倍物镜，聚焦于盖玻片与微管稀释液接触的表面，应观察到长度在 8–25 µm 范围内、高密度分布的微管（在完整视野中可见数百根，呈致密网状排列）。

2. 钝化盖玻片的制备

  1. 清洗盖玻片
    1. 将 18 mm × 18 mm 的盖玻片放入非反应性塑料架中，然后将每个架放入一个 100 mL 烧杯中。每个架的槽位中放置一片盖玻片，因为需要清洁盖玻片的两面。
    2. 使用水浴超声仪进行超声处理 5 分钟，每次超声循环依次使用 50 mL 下列溶液：（1）去离子水（电阻率为 18.3 MΩ·cm），（2）2% Micro-90 溶液，（3）去离子水，（4）新配制的 0.1 M KOH，（5）去离子水（图 1A）。确保盖玻片完全浸没在液体中。在每次超声循环之间，使用镊子将盖玻片架在去离子水中上下浸入 10–20 次进行冲洗，更换水后重复冲洗过程 2 次。
    3. 用去离子水冲洗盖玻片 3 次，然后将烧杯中加满 100% 乙醇，并将架放回烧杯中。将烧杯移入通风橱，并铺足够多的无尘纸巾以容纳所有盖玻片架。然后用镊子取出架并放置在纸巾上。
    4. 使用干燥氮气流吹干盖玻片及其架，直至完全干燥。倒掉烧杯中剩余的乙醇，并同样使用干燥氮气流吹干烧杯（图 1A）。
  2. 盖玻片表面的氨基硅烷功能化
    1. 通过向一个 50 mL 锥形管中加入 40 mL 丙酮和 400 µL APTES 试剂，盖紧管盖，并通过倒置混合 10 次，制备 (3-氨基丙基)三乙氧基硅烷（APTES）试剂溶液。
    2. 将一个盖玻片架移入对应的干燥烧杯中，然后完全浸入 APTES 溶液中。孵育 5 分钟（图 1A）。将经 APTES 处理的架转移到一个新的干燥烧杯中，并将另一个新架放入 APTES 溶液中孵育 5 分钟。
    3. 如步骤 2.1.2 所述，通过将架在去离子水中浸入 10–20 次并更换水 5 次，对处理后的架进行冲洗。重复此过程，直至所有盖玻片均完成处理和清洗。
  3. 氨基硅烷表面的聚乙二醇化（PEGylation）
    1. 配制两种 PEG 溶液：一种为约 100 µL 的 25% w/v PEG 溶液，另一种为约 10 µL 的 10% w/v 生物素-PEG 溶液，均溶于新配制的 0.1 M NaHCO3 中，足以包被 24 片盖玻片。在加入 0.1 M NaHCO3 后，将 25% PEG 溶液在 3,000 × g 离心 20 秒以充分溶解 PEG；溶液可能仍呈浑浊。通过轻柔吹打混合生物素-PEG 溶液（图 1B）。
    2. 配制 PEG 与生物素-PEG 溶液的混合液，按体积比 33.3 : 1 混合（例如，100 µL PEG 溶液与 3 µL 生物素-PEG 溶液）。
    3. 在通风橱中铺若干无菌无绒纸巾。将盖玻片架移至纸巾上，并如前所述用干燥氮气流吹干。在若干新的干燥纸巾上，将已完全干燥的盖玻片成对摆放，并在每片盖玻片的右下角用不对称符号（如 "b"）标记。该标记将位于盖玻片样品面的反面，不会干扰实验（图 1B）。
    4. 用镊子翻转每对中的一片盖玻片。在每片翻转的盖玻片上加入 6 µL PEG/生物素-PEG 混合液，然后将另一片盖玻片盖在上面，使两片上的 "b" 标记均朝外。
    5. 对齐盖玻片边缘，并将其放入加湿且密封的孵育盒中以防止干燥。在室温下于湿化盒中孵育 3 小时。
    6. 孵育结束后，从湿化盒中取出盖玻片，小心分离成对的盖玻片，并将其放回各自的架中。如前所述，用去离子水清洗每个架，使用镊子将架上下浸入 10–20 次，并总共更换水 5 次。
    7. 将所有 PEG 化表面的盖玻片朝向同一方向放置，确保任意两个 PEG 化表面不相对。PEG 化表面在完全干燥前会非常粘，因此需格外小心防止盖玻片相互接触。如前所述，使用干燥氮气流吹干每个架和盖玻片（图 1B）。
    8. 盖玻片及其架完全干燥后，储存于真空干燥器中，以防止表面涂层降解。在真空条件下并使用干燥剂妥善保存，防止湿气破坏 PEG 涂层；盖玻片可在约 1 周内使用。

3. 驱动蛋白包被微珠的制备

  1. 严谨态驱动蛋白构建体的选择与制备
    1. 根据已发表的方案表达并纯化严谨态驱动蛋白构建体53,54。将浓度为 0.02 mg/mL 的驱动蛋白溶液以每份 5 µL 分装，快速冷冻，并于 -80 °C 保存，最长可保存 1 年。
      注意：严谨态驱动蛋白蛋白含有 G234A 点突变，可阻止 ATP 水解。当与微珠偶联时，其与微管之间的高亲和力相互作用可使微珠在数分钟内承受 10–20 pN 的载荷。在这些实验中，已成功使用了两种常见的驱动蛋白-1 同源二聚体 K56053 和进一步优化的 K439 构建体55 的严谨态突变形式54。该优化后的 K439 构建体包含一个 EB1 二聚化结构域以增强稳定性，以及一个 C 末端 6-His 标签，用于特异性结合 6-His 抗体，如下所述。
  2. 将 6-His 抗体结合至链霉亲和素包被的微珠
    1. 将 50 µL 直径为 1 µm 的链霉亲和素包被聚苯乙烯微珠加入 0.5 mL 离心管中，超声处理 30 秒。
    2. 将 10 µL 200 mM DTT 加入 790 µL 1x BRB80 缓冲液中。取 10 µL 经超声处理的微珠加入 40 µL 上述含 2.5 mM DTT 的 1x BRB80 缓冲液中。
    3. 将 1 µL 生物素化的 6-His 抗体与 49 µL 含 2.5 mM DTT 的 1x BRB80 缓冲液混合，短暂涡旋以混匀。
    4. 在新管中混合 50 µL 稀释后的微珠混合液与 50 µL 抗体稀释液。将该管置于 4 °C 旋转仪上，旋转孵育 1 小时。在 4 °C 下以 3,000 x g 离心 10 分钟，沉淀微珠。
    5. 吸除上清液，将沉淀重悬于 100 µL 含 2 mg/mL 酪蛋白的 1x BRB80 溶液中。重复离心和重悬步骤两次。
  3. 添加严谨态驱动蛋白
    1. 将最终沉淀重悬于 100 µL 含 2 mg/mL 酪蛋白的溶液中。在 0.5 mL 离心管中，加入 5 µL 浓度为 0.02 mg/mL 的严谨态驱动蛋白与 5 µL 微珠，通过轻轻弹击管壁约 10 次进行轻柔混匀。
    2. 当不使用时，将 K439 G234A 微珠悬液和剩余的 6-His 微珠置于 4 °C 旋转仪上保存。微珠需当日新鲜制备并使用，因长时间放置易发生聚集并丧失活性。

4. 显微镜腔室的组装

  1. 玻片制备与腔室构建
    1. 先用超纯水冲洗75 mm × 25 mm的显微镜玻片，再用无条痕的氨水玻璃清洁剂清洗，最后再用超纯水冲洗一次。轻轻摇晃以去除多余的水滴，然后用氮气流吹干玻片，确保无条痕残留，并将玻片平放在纸巾上（图2A）。
    2. 用剪刀将双面胶带剪成约2–3 mm × 2.5 cm的条状（每个单腔室使用2条，双腔室使用3条）。
    3. 使用镊子将两条胶带贴在一块玻片上，两条胶带之间留出约0.5 cm的间距，以构建单腔室。对于双腔室，使用相同的间距，但放置三条胶带（图2B）。采用此方法构建的样品通道体积约为10 µL。
      注意：腔室越宽，在溶液流动时越容易产生气泡；然而，腔室宽度小于0.5 cm时，由于成像区域减小，操作难度会增加。
    4. 用镊子沿每条胶带的长度方向刮压，使胶带牢固粘附在玻片上。
    5. 释放干燥器内的压力，用镊子从储存架上取出一片生物素化盖玻片。用镊子将一片生物素化盖玻片放置在玻片上方，确保生物素化面朝内，面向玻片。
    6. 用镊子的平坦背面轻轻按压盖玻片与胶带接触的区域，以确保腔室密封牢固。施加的压力应轻柔，以避免盖玻片破裂（图2C）。
    7. 将制备完成的显微镜腔室存放在密闭容器中，避免直射光，直至使用（图2D）。
      注意：建议在制备当天使用腔室，因为生物素化盖玻片暴露在空气中会逐渐降解。
  2. 显微镜试剂的灌注
    1. 通过在空的移液枪吸头盒底部放置一块用超纯水润湿的折叠无尘纸巾，构建一个湿度腔室。在灌注步骤之间，应将样品腔室置于该盒中，以减少通道内溶液的蒸发。
    2. 通过在通道一端加入液体，并在另一端用纸巾吸液的方式引入所有试剂。吸液时，将纸巾一端捻成细条，轻轻接触腔室出口侧，利用毛细作用使试剂均匀分布（图3A）。所有试剂在灌注前应恢复至室温，以防止微管解聚。
    3. 使用20 µL斜尖移液枪头，使其接触一个腔室的入口端，缓慢加入10 µL浓度为0.5 mg/mL的链霉亲和素（streptavidin）或中性亲和素（Neutravidin）。使用较小的移液枪头，并以缓慢、恒定的速度加入试剂，以降低腔室内产生气泡的可能性（图3B）。
    4. 将玻片放入湿度腔室中孵育4分钟，腔室的盖玻片面朝下。此方向可使较大的物体（如微管或微珠）沉降到PEG化表面附近。
    5. 用20 µL 1x BRB80缓冲液冲洗腔室，并用无尘纸巾吸出液体。若腔室存在泄漏，应丢弃该玻片并更换新的玻片；腔室内出现的小气泡不会对成像造成显著影响。
    6. 用10 µL浓度为0.5 mg/mL的酪蛋白封闭液重复灌注、孵育和冲洗步骤（图3C）。将生物素化的远红荧光微管按约1:20稀释后，灌入10 µL至腔室中，孵育5分钟，再用20 µL 1x BRB80缓冲液冲洗腔室（图3D）。在100 µm × 100 µm的成像视野内，微管的最佳密度应为10–20条；此步骤的稀释比例应根据需要调整，以达到理想的表面结合比例。
    7. 用10 µL适当浓度（通常为1–10 nM）的目标交联马达蛋白或非马达蛋白重复灌注、孵育和冲洗步骤（图3E）。
    8. 灌入10 µL罗丹明标记的微管，其稀释浓度应与前述生物素化远红荧光微管相近。重复孵育和冲洗步骤（图3F）。
    9. 将1 µL rigor状态的驱动蛋白包被微珠与19 µL优化用于交联蛋白活性的反应缓冲液混合。例如，在分析驱动蛋白-5（kinesin-5）活性时，反应缓冲液组成为：1 mM TCEP还原剂、0.2 mg/mL α-酪蛋白、70 mM KCl、氧清除系统（4.5 mg/mL葡萄糖、350 units/mL葡萄糖氧化酶、34 units/mL过氧化氢酶）、1 mM DTT，以及所需浓度的ATP（例如，为获得最大驱动蛋白速度，使用1 mM ATP），溶于1x BRB80缓冲液中（图3G）。在分析非马达蛋白时，省略ATP，并通过调节KCl浓度来调控蛋白与微管之间的相互作用强度。
    10. 用透明指甲油密封腔室的两端，待指甲油完全干燥后再进行成像（图3H）。成功构建的腔室应无泄漏且气泡极少。

使用三色全内反射荧光显微镜成像微管束

  1. 使用一台具备全内反射荧光（TIRF）成像功能的倒置显微镜，并已集成单光束光镊系统（图4）。
    注：在本研究所描述的实验中，使用了配备100倍/数值孔径1.49油镜、TIRF模块以及三种激光器（分别为488 nm、561 nm和640 nm）的倒置显微镜，用于检测GFP标记的蛋白质、罗丹明标记的微管以及生物素化远红标记的微管。
    1. 在样品腔的盖玻片上滴加一滴浸油。过量的油可能损坏显微镜物镜。将样品腔的盖玻片面朝下，放置于显微镜载物台上以进行成像。
    2. 缓慢提升物镜，使物镜通过浸油与盖玻片接触。调节物镜高度，使样品腔的盖玻片表面处于焦点位置。
    3. 在三个通道中分别采集样品的单帧图像。在本实验中，建议三个通道均采用100–200 ms的曝光时间作为最佳成像时长；更长的曝光时间可能导致光漂白加剧。
    4. 调节激光功率，在保证样品信噪比的同时，尽量减少在单个束状结构检测期间（2–5分钟）的光漂白。对于本实验所用的激光器（图4 和 图5），建议GFP通道使用5 mW，两个微管通道均使用3 mW作为最佳激光功率。
      注：成功组装的束状结构应包含一个在远红通道中固定于表面的微管、一段数微米长且GFP-蛋白信号显著的共延伸区域，以及一段与上述区域重叠并从束状结构延伸出数微米的罗丹明标记微管（图5B、C 和 图6）。对罗丹明微管进行活体成像时，应观察到非交联端存在轻微波动，表明该微丝未与表面或其他腔内蛋白连接。
    5. 观察每个视野中微管束的出现频率。对于制备成功的样品，每个腔室中每100 µL × 100 µL视野应存在约3–4个微管束。

6. 在微管束上进行光镊实验

  1. 实验前条件校准
    1. 进行这些实验时，使用刚度为 0.05–0.1 pN/nm 的单光束光镊。通过在物镜下方和聚光镜上方分别引入短通滤光片，将光镊光学系统和位置敏感光电探测器集成到具备全内反射荧光（TIRF）功能的倒置显微镜中（图4）。
    2. 此外，在样品所放置的平台上增加纳米级定位载物台，以便在实验过程中以纳米级精度受控地移动微管。本研究中用于获取代表性数据的系统已在已发表的研究中描述27,53,54,56,57。
      注：尽管超出本方案的范围，但已有多种资源详细介绍了单光束光镊的构建与校准方法58,59,60。
    3. 使用显微镜的明场或微分干涉差（DIC）通道以及100倍物镜观察样品中微珠的密度。仅使用明场显微镜识别和操控微珠，不得同时进行荧光图像采集。微珠之间的平均间距应至少为10 µm，并确保微珠未受到任何表面限制或附着，彼此之间无连接或聚集现象。
    4. 确保生物素标记的远红光微管牢固附着在盖玻片表面，无可见的布朗运动，例如沿微管轴向的移动或微管自由端在溶液中的波动。
    5. 确保罗丹明标记的微管通过交联微管相关蛋白（MAP）连接至生物素化微管，并在其自由端可见明显波动。非生物素化微管直接附着于表面通常表明聚乙二醇化（PEGylation）可能失败，或PEG涂层已降解。
  2. 马达驱动微管滑动测量
    1. 按照已发表的方案表达并纯化目标马达蛋白。例如，全长GFP标记的驱动蛋白-5（kinesin-5）已成功纯化并应用于此类实验53,61，未标记的驱动蛋白-12（kinesin-12）62 和驱动蛋白-14（kinesin-14）63 也已成功应用。按照上述第4和第5步所述方法组装并观察由马达蛋白交联形成的微管束。
    2. 使用光镊捕获溶液中正在进行布朗运动的单个游离微珠。根据需要调节光镊光学系统，将微珠移至视野中央。确保光镊光束的反射干涉图样对称，并调节光镊光学系统以消除任何光束不对称性。
    3. 移动样品载物台，使微管束中罗丹明微管的自由端正好位于微珠正下方，且微珠距离含有交联蛋白的重叠区域数微米，以尽量减少光镊光束引起的光漂白。沿Z轴缓慢降低微珠，直至其与微管发生碰撞。降低微珠时应轻柔操作，切勿将微珠压向盖玻片表面，以免造成微珠粘附于盖玻片。
    4. 短暂关闭光镊，使用明场通道观察附着于滑动微管上的微珠的运动情况。在进行马达蛋白实验时，附着的微珠会随着微管相互滑动而产生定向移动。随后重新激活光镊，再次捕获微珠。
    5. 以每秒1–2帧的速度开始记录三个通道（488 nm、561 nm、640 nm）的荧光数据，激光功率和曝光时间应采用上述第5步中优化的参数。
    6. 使用光镊计算机软件记录来自位置敏感光电探测器（X、Y方向及总和强度信号）、纳米定位载物台（X、Y、Z坐标）以及TIRF相机快门状态的数据。使用由适当软件（如自编的LabView程序）控制的专用电压输入数据采集板，以1–10 kHz的采样率开始对这些光镊电压值进行数字化采集，具体速率根据实验需求设定。
    7. 在数据采集过程中监控力信号，并密切关注可能干扰成功数据采集的任何异常情况。
      注：异常情况包括但不限于（1）其他微珠进入光镊区域，（2）微珠过早脱离光镊，（3）力信号突然骤降且无法重新对光镊产生阻力，表明微珠表面的 rigor 状态驱动蛋白分子存在问题。
    8. 测量完成后，关闭光镊释放微珠，并更换新的微珠和微管重复实验，直至达到所需的实验重复次数。
  3. 被动交联抗性测量
    1. 按照已发表的方案表达并纯化目标非马达交联蛋白。例如，全长GFP标记的PRC143,54,57 和二聚体NuMA截短构建体56 已成功应用于此类实验。按照上述第4和第5步所述方法组装并观察交联微管束。
    2. 选择一个合适的仅包含两条微管的微管束：其中一条为完全附着于表面的生物素化微管，另一条为部分游离于溶液中的非生物素化微管；该结构提供一个自由端用于连接微珠，并确保微珠不会附着于表面固定的微管上，且微管束沿X轴或Y轴对齐，从而使载物台运动仅沿单一轴向进行。
    3. 使用光镊捕获一个正在进行布朗运动的游离微珠。一旦微珠被捕获，小心将其移动至选定的微管束上方，确保此过程中无其他微珠被拉入光镊。保持微珠与含有交联蛋白的重叠区域相距数微米，以尽量减少GFP标签的光漂白。
    4. 沿Z轴小心降低微珠，直至其接触罗丹明微管游离段的边缘。轻柔上提并沿垂直于微管轴的方向移动，通过观察罗丹明微管是否弯曲并跟随微珠位置来判断是否成功连接。若未连接，重复轻柔碰撞微珠与微管的操作，直至实现稳定连接。
    5. 通过移动纳米定位载物台，仔细将罗丹明微管沿表面固定微管的轴向对齐，并设置微管束自动拉伸的参数。设定沿微管平行轴方向的拉伸方向，选择合适的拉伸速度（25–200 nm/s为有效速度范围），并根据重叠长度设定所需的拉伸时间（约30秒至2分钟）。
    6. 以每秒1–2帧的速度开始记录三个通道（488 nm、561 nm、640 nm）的荧光数据。使用上述第5步中优化的激光功率和曝光时间。
    7. 启动自动载物台运动，并记录来自位置敏感探测器、载物台及TIRF相机状态的光镊数据。监控可能干扰数据采集的因素，包括但不限于（1）其他微珠进入光镊区域，（2）微管交联过早解离，或（3）微珠从罗丹明微管上脱落。
    8. 关闭光镊释放微珠，并根据需要重复实验。典型的样品腔室可在微管束降解和蛋白活性丧失前使用约30分钟。
      ​注：降解效应因所用交联蛋白而异，可能表现为微管或表面出现静态斑点、微管波动消失（提示非特异性结合），或无法稳定地将微珠连接至微管。

7. 数据分析及荧光图像与光镊记录的相关性

注意：为了优化数据采集，建议使用两个独立的计算机控制系统：一个用于光镊软件，另一个用于荧光成像。该配置可实现两种实验模式下的高速数据采集，并避免因使用单个中央处理器而导致操作执行中引入纳秒至微秒级的时间延迟。

  1. 以针对所使用的运动蛋白或非运动交联蛋白及其预期步进速率优化的采样率对光镊数据进行数字化（例如，通常在 1–10 kHz 之间）。
  2. 使用专用软件控制光镊系统并采集来自各组件的数字电压信号，记录位置敏感光电探测器的 X、Y 和 SUM 电压信号，以及纳米定位平台的 X、Y 和 Z 位置数据。
  3. 通过光镊数据采集板上的额外电压输入通道，记录相机快门开启状态的数字信号。这可实现荧光成像数据与光镊时间轨迹的关联。在启动成像之前即开始光镊数据采集，以确保正确记录第一帧图像对应的相机信号。
  4. 根据需要，采用适当的滤波方法（如滑动窗口平均、中值滤波或高斯滤波）对高采样率下获取的原始时间序列数据进行平均处理。
  5. 使用线扫描分析等方法对荧光图像时间序列数据进行量化，计算沿微管区域长度方向的像素强度值。根据这些线扫描轨迹确定微管边缘，从而识别出重叠区域。此外，利用交联蛋白通道的荧光强度计算蛋白的定位、浓度和密度。
  6. 力信号与图像数据的关联是该实验系统的关键输出。例如，选取并平均特定相机曝光区间内（由相机通道中相应的数字信号峰指示）的所有力数据点，以直接与对应的荧光图像帧进行比较。随后，提取力的大小与交联蛋白数量、重叠长度或交联蛋白分布之间的关系。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

如果满足若干关键标准，则认为已成功制备出适用于生物物理分析的微管束。首先，三色成像应显示两条排列整齐的微管，且交联蛋白的浓度在重叠区域较高（图5B、C和 图6B）。理想情况下，罗丹明标记微管的重叠边缘与其游离末端之间的距离应至少为5 µm，以便在捕获光束与荧光标记蛋白之间提供足够的物理空间。其次，在缺乏生物素化远红微管的区域，背景荧光信号应尽可能低，尤其是与交联蛋白标记所用通道对应的信号。较高的背景荧光通常表明盖玻片钝化效果不佳，以及存在大量非特异性结合于玻璃表面的蛋白质，这些蛋白质可能与微管或捕获微珠发生非特异性相互作用。此外，若在任一微管成像通道中观察到微小的圆形斑点或短片段，则提示微管聚合和纯化过程不成功，或微管已老化或受损。

第三，用于捕获的微珠应呈现为单个微珠，而非聚集在含有多个微珠的团块中。尽管可能有少量微珠会不可逆地黏附于表面，但应观察到大部分微珠以单个颗粒的形式在样品腔内自由扩散。...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

多种细胞类型利用微管网络来完成大量本质上具有机械性质的任务。为了阐明细胞在健康和疾病状态下的功能，关键在于理解这些微米尺度的网络是如何由共同构建它们的纳米级蛋白质进行组织和调控的。诸如光镊等生物物理工具非常适合在该尺度上研究关键蛋白质的力化学特性。鉴于微管网络功能的多样性，研究人员已探索了多种采用光镊的复杂实验构型，包括对微管末端动力学的力依赖性分析67,68、着丝粒组分产生力学力的研究69,70,71，以及利用双光束哑铃陷阱构型探测微管丝状结构的力学特性72,73。在本实验方案中，我们描述了重建微管网络基本结构模式（如微管束）的新方法，并应用单分子荧光显微镜和光镊等生物物理工具，以获取有关细胞功能的关键信息。

...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者希望感谢以下资助的支持：R21 AG067436（资助对象：JP 和 SF）、T32 AG057464（资助对象：ET）以及伦斯勒理工学院理学院启动资金（资助对象：SF）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10W 掺镱光纤激光器，1064nmIPG PhotonicsYLR-10-1064-LP
适用于TIRF应用的405/488/561/640nm四波段激光组合ChromaTRF89901v2
6x His标签抗体，生物素偶联物Invitrogen#MA1-21315-BTIN
丙酮，HPLC级Fisher Scientific18-608-395
牛乳α-酪蛋白Sigma1002484390
ATPFisher ScientificBP413-25
苯甲酸酶（Benzonase）Novagen70746-3
生物素-PEG-SVA-5000Laysan Bio, Inc.NC0479433
BL21 (DE3) Rosetta感受态细胞Millipore Sigma71-400-3
过氧化氢酶（Catalase）MP Biomedicals LLC190311
CFI Apo 100X/1.49NA油浸TIRF物镜NikonN/A
氯霉素（Chloramphenicol）ACROS Organics227920250
盖玻片迷你架，适用于8个盖玻片Fisher ScientificC14784
精密任务擦拭纸Kimberly-Clark34120
无水葡萄糖Fisher ScientificBP3501
D-蔗糖Fisher ScientificBP220-1
DTTFisher ScientificBP172-25
Ecoline浸入式恒温器E100配003浴槽LAUDA-Brinkmann27709
EDTAFisher ScientificBP118-500
EGTAMillipore Corporation32462-25GM
FIJI / Image Jhttps://fiji.sc/N/A
磨砂载玻片Corning12-553-1075mm×25mm，厚度0.9-1.1mm
葡萄糖氧化酶MP Biomedicals LLC195196Ⅶ型，不含额外氧气
GMPCPPJena BiosciencesJBS-NU-405S可在-20 °C下保存数月，在-80 °C下可保存长达一年
Gold Seal盖玻片Thermo Scientific3405
HEPESFisher ScientificBP310-500
咪唑（Imidazole）Fisher Scientific03196-500
IPTGFisher ScientificBP1755-10
实验室干燥器Bel-Art999320237190mm板尺寸
硫酸卡那霉素Fischer ScientificBP906-5
KIF5A K439（氨基酸：1-439）-6HisGilbert Lab, RPIN/Adoi.org/10.1074/jbc.RA118.002182
Kimwipe擦拭纸Kimberley ClarkZ188956无尘纸
浸油，B型Cargille16484
镜头纸ThorLabsMC-5
LuNA激光发射装置（四通道：405、488、561、640nm）NikonN/A
溶菌酶（Lysozyme）MP Biomedicals LLC100834
四水合乙酸镁Fisher ScientificBP215-500
Microfuge 18离心机Beckman Coulter367160
MPEG-SVA 分子量5000Laysan Bio, Inc.NC0107576
中性亲和素（Neutravadin）InvitrogenPI31000
Nikon Ti-E倒置显微镜NikonN/ANikon LuN4激光器
Ni-NTA树脂Thermo Scientific88221
寡核苷酸 - CACCTATTCTGAGTTTGCGCGA
GAACTTTCAAAGGC		IDTN/A
寡核苷酸 - GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA
ACTCAGAATAGGTG		IDTN/A
开放式厚壁聚碳酸酯管，0.2 mL，7 mm × 22 mmBeckman Coulter343755
Optima-TLX超速离心机Beckman Coulter361544
紫杉醇（Taxol等效物）Thermo Fisher ScientificP3456
PIPESACROS Organics172615000
PMSFMillipore7110-5GM
猪源微管蛋白，生物素标记Cytoskeleton, Inc.T333P
猪源微管蛋白，HiLyte 647荧光标记Cytoskeleton, Inc.TL670M远红荧光标记
猪源微管蛋白，罗丹明标记Cytoskeleton, Inc.TL590M
猪源微管蛋白，微管蛋白蛋白Cytoskeleton, Inc.T240
乙酸钾Fisher ScientificBP364-500
Prime 95B sCMOS相机PhotometricN/A
四象限探测器传感器头ThorLabsPDQ80A
Quikchange Lightning试剂盒Agilent Technologies210518
碳酸氢钠Fisher ScientificS233-500
无水磷酸氢二钠Fisher ScientificBP332-500
方形盖玻片Corning12-553-45018 mm × 18 mm，厚度0.13-0.17 mm
链霉亲和素微球Polysciences Inc.24162-1
Superose-6层析柱GE Healthcare29-0915--96
TCEPThermo Scientific77720
TLA-100固定角转子Beckman Coulter343840
超声波清洗机（超声破碎仪）VevorJPS-08A(DD)304不锈钢，40 kHz频率，60 W功率
Vectabond APTES溶液Vector LaboratoriesSP-1800-7
含氨-D的Windex强力玻璃清洁剂S.C. JohnsonSJN695237

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bentley, M., Banker, G. The cellular mechanisms that maintain neuronal polarity. Nature Reviews Neuroscience. 17 (10), 611-622 (2016).
  2. Yang, R., et al. A novel strategy to visualize vesicle-bound kinesins reveals the diversity of kinesin-mediated transport. Traffic. 20 (11), 851-866 (2019).
  3. Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: Transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
  4. Helmke, K. J., Heald, R., Wilbur, J. D. Interplay between spindle architecture and function. International Review of Cell and Molecular Biology. 306, (2013).
  5. Elting, M. W., Suresh, P., Dumont, S. The spindle: integrating architecture and mechanics across scales. Trends in Cell Biology. 28 (11), 896-910 (2018).
  6. Kapoor, T. Metaphase spindle assembly. Biology. 6 (1), 8(2017).
  7. Svoboda, K., Block, S. M. Force and velocity measured for single kinesin molecules. Cell. 77 (5), 773-784 (1994).
  8. Svoboda, K., Schmidt, C. F., Schnapp, B. J., Block, S. M. Direct observation of kinesin stepping by optical trapping interferometry. Nature. 365 (6448), 721-727 (1993).
  9. Schnitzer, M. J., Visscher, K., Block, S. M. Force production by single kinesin motors. Nature Cell Biology. 2 (10), 718-723 (2000).
  10. Andreasson, J. O. L., Shastry, S., Hancock, W. O., Block, S. M. The mechanochemical cycle of mammalian kinesin-2 KIF3A/B under load. Current Biology. 25 (9), 1166-1175 (2015).
  11. Bensel, B. M. The mechanochemistry of the kinesin-2 kif3ac heterodimer is related to strain-dependent kinetic properties of kif3a and kif3c. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (27), 15632-15641 (2020).
  12. Gilbert, S. P., Guzik-Lendrun, S., Rayment, I. Kinesin-2 motors: kinetics and biophysics. Journal of Biological Chemistry. 293 (12), 4510-4518 (2018).
  13. Okada, Y., Higuchi, H., Hirokawa, N. Processivity of the single-headed kinesin KIF1A through binding to tubulin. Nature. 424 (6948), 574-577 (2003).
  14. Budaitis, B. G., et al. Pathogenic mutations in the kinesin-3 motor KIF1A diminish force generation and movement through allosteric mechanisms. Journal of Cell Biology. 220 (4), 202004227(2021).
  15. Tomishige, M., Klopfenstein, D. R., Vale, R. D. Conversion of Unc104/KIF1A kinesin into a processive motor after dimerization. Science. 297 (5590), 2263-2267 (2002).
  16. Siddiqui, N., et al. Force generation of KIF1C is impaired by pathogenic mutations. bioRxiv. , (2021).
  17. Valentine, M. T., Fordyce, P. M., Krzysiak, T. C., Gilbert, S. P., Block, S. M. Individual dimers of the mitotic kinesin motor Eg5 step processively and support substantial loads in vitro. Nature Cell Biology. 8 (5), 470-476 (2006).
  18. Valentine, M. T., Gilbert, S. P. To step or not to step? How biochemistry and mechanics influence processivity in Kinesin and Eg5. Current Opinion in Cell Biology. 19 (1), 75-81 (2007).
  19. Jannasch, A., Bormuth, V., Storch, M., Howard, J., Schäffer, E. Kinesin-8 is a low-force motor protein with a weakly bound slip state. Biophysical Journal. 104 (11), 2456-2464 (2013).
  20. Bormuth, V., Varga, V., Howard, J., Schäffer, E. Protein friction limits diffusive and directed movements of kinesin motors on microtubules. Science. 325 (5942), 870-873 (2009).
  21. Gennerich, A., Carter, A. P., Reck-Peterson, S. L., Vale, R. D. Force-induced bidirectional stepping of cytoplasmic dynein. Cell. 131 (5), 952-965 (2007).
  22. Mallik, R., Carter, B. C., Lex, S. A., King, S. J., Gross, S. P. Cytoplasmic dynein functions as a gear in response to load. Nature. 427 (6975), 649-652 (2004).
  23. Redwine, W. B., et al. The human cytoplasmic dynein interactome reveals novel activators of motility. eLife. 6, 28257(2017).
  24. Belyy, V., Hendel, N. L., Chien, A., Yildiz, A. Cytoplasmic dynein transports cargos via load-sharing between the heads. Nature Communications. 5 (1), 5544(2014).
  25. Belyy, V., et al. The mammalian dynein-dynactin complex is a strong opponent to kinesin in a tug-of-war competition. Nature Cell Biology. 18 (9), 1018-1024 (2016).
  26. Subramanian, R., Kapoor, T. M. Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures. Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).
  27. Forth, S., Kapoor, T. M. The mechanics of microtubule networks in cell division. Journal of Cell Biology. 216 (6), 1525-1531 (2017).
  28. Dumont, S., Mitchison, T. J. Force and length in the mitotic spindle. Current Biology. 19 (17), 749-761 (2009).
  29. McIntosh, J. R., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I. Biophysics of mitosis. Quarterly Reviews of Biophysics. 45 (2), 147-207 (2012).
  30. McIntosh, J., Hays, T. A brief history of research on mitotic mechanisms. Biology. 5 (4), 55(2016).
  31. Ferenz, N. P., Gable, A., Wadsworth, P. Mitotic functions of kinesin-5. Seminars in Cell and Developmental Biology. 21 (3), 255-259 (2010).
  32. Kapitein, L. C., et al. The bipolar mitotic kinesin Eg5 moves on both microtubules that it crosslinks. Nature. 435 (7038), 114-118 (2005).
  33. Vukušić, K., Ponjavić, I., Buđa, R., Risteski, P., Tolić, I. M. Microtubule-sliding modules based on kinesins EG5 and PRC1-dependent KIF4A drive human spindle elongation. Developmental Cell. 56 (9), 1253-1267 (2021).
  34. Sturgill, E. G., Ohi, R. Kinesin-12 differentially affects spindle assembly depending on its microtubule substrate. Current Biology. 23 (14), 1280-1290 (2013).
  35. Drechsler, H., McHugh, T., Singleton, M. R., Carter, N. J., McAinsh, A. D. The Kinesin-12 Kif15 is a processive track-switching tetramer. eLife. 3, 01724(2014).
  36. Tanenbaum, M. E., et al. Kif15 Cooperates with Eg5 to promote bipolar spindle assembly. Current Biology. 19 (20), 1703-1711 (2009).
  37. Mountain, V., et al. Cross-links microtubules in the mammalian mitotic spindle. Journal of Cell Biology. 147 (2), 351-365 (1999).
  38. Norris, S. R., et al. Microtubule minus-end aster organization is driven by processive HSET-tubulin clusters. Nature Communications. 9 (1), 2659(2018).
  39. Cai, S., Weaver, L. N., Ems-McClung, S. C., Walczak, C. E. Proper organization of microtubule minus ends is needed for midzone stability and cytokinesis. Current Biology. 20 (9), 880-885 (2010).
  40. Pamula, M. C., et al. High-resolution imaging reveals how the spindle midzone impacts chromosome movement. Journal of Cell Biology. 218 (8), 2529-2544 (2019).
  41. Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
  42. Zhu, C., Lau, E., Schwarzenbacher, R., Bossy-Wetzel, E., Jiang, W. Spatiotemporal control of spindle midzone formation by PRC1 in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6196-6201 (2006).
  43. Subramanian, R., et al. Insights into antiparallel microtubule crosslinking by PRC1, a conserved nonmotor microtubule binding protein. Cell. 142 (3), 433-443 (2010).
  44. Elting, M. W., Prakash, M., Udy, D. B., Dumont, S. Mapping load-bearing in the mammalian spindle reveals local kinetochore fiber anchorage that provides mechanical isolation and redundancy. Current Biology. 27 (14), 2112-2122 (2017).
  45. Fant, X., Merdes, A., Haren, L. Cell and molecular biology of spindle poles and NuMA. International Review of Cytology. 238, 1-57 (2004).
  46. Merdes, A., Heald, R., Samejima, K., Earnshaw, W. C., Cleveland, D. W. Formation of spindle poles by dynein/dynactin-dependent transport of NuMA). Journal of Cell Biology. 149 (4), 851-861 (2000).
  47. Maddox, P., Straight, A., Coughlin, P., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Direct observation of microtubule dynamics at kinetochores in Xenopus extract spindles: Implications for spindle mechanics. Journal of Cell Biology. 162 (3), 377-382 (2003).
  48. Maddox, P., Desai, A., Oegema, K., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Poleward microtubule flux is a major component of spindle dynamics and anaphase A in mitotic Drosophila embryos. Current Biology. 12 (19), 1670-1674 (2002).
  49. LaFountain, J. R., Cohan, C. S., Siegel, A. J., LaFountain, D. J. Direct visualization of microtubule flux during metaphase and anaphase in crane-fly spermatocytes. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5724-5732 (2004).
  50. Pavin, N., Tolić, I. M. Mechanobiology of the mitotic spindle. Developmental Cell. 56 (2), 192-201 (2021).
  51. Vukušić, K., Tolić, I. M. Anaphase B: Long-standing models meet new concepts. Seminars in Cell and Developmental Biology. 117, 127-139 (2021).
  52. Vukušić, K., et al. Microtubule sliding within the bridging fiber pushes kinetochore fibers apart to segregate chromosomes. Developmental Cell. 43 (1), 11-23 (2017).
  53. Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
  54. Gaska, I., Armstrong, M. E., Alfieri, A., Forth, S. The mitotic crosslinking protein PRC1 acts like a mechanical dashpot to resist microtubule sliding. Developmental Cell. 54 (3), 367-378 (2020).
  55. Woll, K. A., et al. An allosteric propofol-binding site in kinesin disrupts kinesin-mediated processive movement on microtubules. Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11283-11295 (2018).
  56. Forth, S., Hsia, K. C., Shimamoto, Y., Kapoor, T. M. Asymmetric friction of nonmotor MAPs can lead to their directional motion in active microtubule networks. Cell. 157 (2), 420-432 (2014).
  57. Alfieri, A., Gaska, I., Forth, S. Two modes of PRC1-mediated mechanical resistance to kinesin-driven microtubule network disruption. Current Biology. 31 (12), 2495-2506 (2021).
  58. Koch, M. D., Shaevitz, J. W. Introduction to optical tweezers. Methods in Molecular Biology. 1486, 3-24 (2017).
  59. Sarshar, M., Wong, W. T., Anvari, B. Comparative study of methods to calibrate the stiffness of a single-beam gradient-force optical tweezers over various laser trapping powers. Journal of Biomedical Optics. 19 (11), 115001(2014).
  60. Van Mameren, J., Wuite, G. J. L., Heller, I. Introduction to optical tweezers: Background, system designs, and commercial solutions. Methods in Molecular Biology. 783, 1-20 (2011).
  61. Bodrug, T., et al. The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding. eLife. 9, 51131(2020).
  62. Reinemann, D. N., et al. Collective force regulation in anti-parallel microtubule gliding by dimeric Kif15 kinesin motors. Current Biology. 27 (18), 2810-2820 (2017).
  63. Reinemann, D. N., Norris, S. R., Ohi, R., Lang, M. J. Processive kinesin-14 HSET exhibits directional flexibility depending on motor traffic. Current Biology:CB. 28 (14), 2356-2362 (2018).
  64. Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
  65. SMART - Servier Medical ART. , Available from: https://smart.servier.com/ (2022).
  66. Gaska, I., Armstrong, M., Alfieri, A., Forth, S. The mitotic crosslinking protein PRC1 acts as a mechanical dashpot to resist microtubule sliding. Developmental Cell. 54 (3), 1-14 (2020).
  67. Janson, M. E., De Dood, M. E., Dogterom, M. Dynamic instability of microtubules is regulated by force. Journal of Cell Biology. 161 (6), 1029-1034 (2003).
  68. Kerssemakers, J. W. J., et al. Assembly dynamics of microtubules at molecular resolution. Nature. 442 (7103), 709-712 (2006).
  69. Powers, A. F., et al. The Ndc80 kinetochore complex forms load-bearing attachments to dynamic microtubule tips via biased diffusion. Cell. 136 (5), 865-875 (2009).
  70. Akiyoshi, B., et al. Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments. Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).
  71. Fong, K. K., et al. Direct measurement of the strength of microtubule attachment to yeast centrosomes. Molecular Biology of the Cell. 28 (14), 1853-1861 (2017).
  72. Kikumoto, M., Kurachi, M., Tosa, V., Tashiro, H. Flexural rigidity of individual microtubules measured by a buckling force with optical traps. Biophysical Journal. 90 (5), 1687-1696 (2006).
  73. Memet, E., et al. Microtubules soften due to cross-sectional flattening. eLife. 7, 34695(2018).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

5 PRC1

相关文章