Method Article

由人诱导多能干细胞改造的同基因肾小球芯片

DOI:

10.3791/63821

⸱

November 4th, 2022

 , 
1Department of Biomedical Engineering, Pratt School of Engineering, Duke University, 2Department of Medicine, Division of Nephrology, Duke University School of Medicine, 3Department of Cell Biology, Duke University, 4Center for Biomolecular and Tissue Engineering, Duke University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这里介绍的是一种设计个性化器官芯片系统的协议，该系统通过整合与人类诱导的多能干细胞分化的遗传匹配的上皮和血管内皮细胞来概括肾小球过滤屏障的结构和功能。这种生物工程系统可以推进肾脏精准医疗和相关应用。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

慢性肾病（CKD）影响了15%的美国成年人口，但由于缺乏能够准确预测人类生物反应和肾毒性的功能模型，靶向治疗的建立受到限制。肾脏精准医学的进步可以帮助克服这些限制。然而，先前建立的人肾小球体 外 模型 - 血液过滤的主要部位和许多疾病和药物毒性的关键靶标 - 通常采用功能特征有限和不匹配的遗传背景的异质细胞群。这些特征极大地限制了它们在患者特异性疾病建模和治疗发现中的应用。

本文提出了一种方案，该方案整合了来自单个患者的人诱导多能干（iPS）细胞来源的肾小球上皮（足细胞）和血管内皮，以设计同基因和血管化的微流体肾小球芯片。由此产生的肾小球芯片由干细胞衍生的内皮和上皮细胞层组成，它们表达谱系特异性标志物，产生基底膜蛋白，并形成类似于肾脏肾小球滤过屏障的组织 - 组织界面。工程化的肾小球芯片选择性地过滤分子并概括药物引起的肾损伤。使用同基因细胞类型重建肾小球结构和功能的能力为具有患者特异性的肾脏疾病建模创造了机会，并推进了器官芯片在肾脏精准医学和相关应用中的实用性。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

器官芯片设备是动态3D体外模型，采用分子和机械刺激以及血管化来形成组织 - 组织界面，模拟特定器官的结构和功能。先前建立的旨在概括肾脏肾小球（肾小球芯片）的器官芯片装置由动物细胞系1或异质来源的人类原代和永生化细胞系2，3组成。遗传异质细胞来源的使用呈现出差异，显着限制了对患者特异性反应和遗传学或疾病机制的研究4，5。应对这一挑战取决于来自具有保留分子和遗传谱的特定个体的同基因细胞系的可用性，以便为体外模型工程提供更准确的微环境2，3，6。由于人类iPS细胞培养的进步，现在可以很容易地产生人类来源的同基因细胞系。由于人iPS细胞通常是非侵入性来源的，可以无限期地自我更新，并分化成几乎任何细胞类型，因此它们可以作为建立体外模型（例如肾小球芯片7，8）的有吸引力的细胞来源。肾小球滤过屏障是血液滤过的主要部位。血液首先通过血管内皮，肾小球基底膜过滤，最后通过称为足细胞的特殊上皮。过滤屏障的所有三个组成部分都有助于分子的选择性过滤。这里介绍的是一种建立器官芯片装置的方案，该装置与来自单个人iPS细胞源的血管内皮和肾小球上皮连接。虽然该协议对于设计同基因和血管化芯片以概括肾小球滤过屏障特别有用，但它也为开发其他类型的个性化器官芯片和多器官平台（如同基因"身体芯片"系统）提供了蓝图。

本文描述的方案始于将人iPS细胞分化为两个独立的谱系 - 外中胚层和中胚层细胞，随后分别分化为血管内皮和肾小球上皮。为了产生侧中胚层细胞，将人iPS细胞接种在基底膜基质1包被板上，并在补充有Wnt激活剂CHIR 99021和有效的中胚层诱导剂骨形态发生4（BMP4）的N2B27培养基中培养3天（无培养基交换）。所得的外侧中胚层细胞先前通过短吻（T），混合配对样同源盒（MIXL）和子宫真皮素（EOMES）的表达来表征9。随后，将侧中胚层细胞在补充有VEGF165和佛司可林的培养基中培养4天，以诱导基于VE-钙粘蛋白和/或PECAM-1表达使用磁激活细胞分选（MACS）分选的血管内皮细胞。通过将所得血管内皮细胞（viEC）培养在基底膜基质3包被烧瓶上进行扩增，直到准备在微流体装置中接种。

为了产生中胚层细胞，将人iPS细胞接种在基底膜基质2包被板上，并在含有Activin A和CHIR99021的培养基中培养2天。所得中胚层细胞的特征在于HAND1，鹅肌和短肠（T）的表达，如前所述2，10，11。为了诱导中间中胚层（IM）细胞分化，将中胚层细胞在补充有BMP-7和CHIR99021的培养基中培养14天。由此产生的IM细胞表达Wilm肿瘤1（WT1），配对盒基因2（PAX2）和奇数跳跃相关蛋白1（OSR-1）2，10，11。

设计了一种基于双通道聚二甲基硅氧烷（PDMS）的微流控芯片，以概括 体外肾小球滤过屏障的结构。尿道为 1，000 μm x 1，000 μm（宽 x 高），毛细血管通道尺寸为 1，000 μm x 200 μm（宽 x 高）。流体通道两侧的空心室促进了循环拉伸和松弛循环。将细胞接种到分离尿路和毛细血管通道的柔性PDMS膜（50μm厚）上。该膜配备有六角形孔（直径7μm，相距40μm），以帮助促进细胞间信号传导（图1A）2，12。在IM诱导完成前两天，微流控芯片涂覆基底膜基质2。在IM诱导完成前1天，使用内皮维持培养基将viEC接种到微流控芯片的毛细血管通道中，并将芯片倒置以使细胞粘附在ECM涂层的PDMS膜的基底侧。在IM诱导完成的当天，使用补充有BMP7，Activin A，CHIR99021，VEGF165和 所有反式 维甲酸的培养基将细胞接种到微流控芯片的尿通道中，以诱导芯片内的足细胞分化。第二天，将足细胞诱导培养基和内皮维持培养基填充培养基，并将0.4 Hz和流体流量（60 μL / h）下的10%机械应变施加到芯片上。

使用足细胞诱导培养基（在尿通道中）和内皮维持培养基（在血管通道中）将细胞化微流控芯片再培养5天。将所得肾小球芯片在足细胞和内皮细胞的维持培养基中再培养长达7天。分化的足细胞正表达谱系特异性蛋白，包括鬼臼素和肾单位13，14，而viECs正表达谱系鉴定蛋白PECAM-1和VE-钙粘蛋白，所有这些都是维持肾小球滤过屏障完整性的重要分子15，16.足细胞和viEC都被发现分泌最丰富的肾小球基底膜蛋白，胶原蛋白IV，这对组织的成熟和功能也很重要。

发现肾小球芯片中的过滤屏障的三组分系统 - 内皮，基底膜和上皮 - 选择性过滤分子并对化疗，肾毒性药物治疗作出反应。药物治疗结果表明，肾小球芯片可用于肾毒性研究和疾病建模。该协议为从同基因iPS细胞衍生物工程功能性微流控肾小球芯片提供了一般指南。研究人员可以根据需要进行工程芯片的下游分析。有关使用肾小球芯片模拟药物性肾小球损伤的更多信息，请参阅以前的出版物2，12。

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 制备基底膜基质溶液和涂层基材

  1. 解冻基底膜基质1在4°C冰上过夜。 根据制造商建议的稀释比例等分。使用 50 mL 锥形管和移液器，将适量的基底膜基质 1 与 25 mL 冷 DMEM/F12 充分混合，直至完全解冻并溶解。
    1. 要溶解冷冻等分试样，请从 25 mL 冷 DMEM/F12 中取出 ~200 μL，并将其转移到冷冻等分试样管中。上下移液，直到基质彻底解冻并溶解。将基底膜基质 1 的全部管内容物转移到冷 DMEM/F12 的其余部分。
  2. 将 1 mL 基底膜基质 1 溶液移液到 6 孔板的每个孔中。为了在同一天使用包被板，在37°C下孵育2小时。
    1. 或者，涂层板可以用封口膜包裹并在4°C下储存长达2周。当准备使用储存的板时，在37°C下孵育30分钟。
  3. 在 9 mL 无菌蒸馏水中稀释基底膜基质 2，以达到 5 μg/mL 的最终浓度。将 700 μL 基底膜基质 2 溶液移液到 12 孔板的每个孔中。用封口膜包裹基底膜基质2涂层板，并在4°C下储存长达2周。
  4. 按照制造商的建议，重建冻干基底膜基质 3，以在磷酸盐缓冲盐水（不含 PBS、Ca+2 和 Mg+2）中达到 1 mg/mL 的最终浓度。在 9.75 mL PBS（不含 Ca+2 和 Mg+2 ）中将一个 250 μL 等分试样稀释至 25 μg/mL 的终浓度。使用该溶液的6 mL涂覆一个T75烧瓶（终浓度为2μg/ cm2）。将基质包被的烧瓶在4°C下储存长达1周。

2. 人iPS细胞培养

注意:本协议中使用的DU11系经过测试，发现没有支原体和核型异常。

  1. 将基底膜基质1包被板在37°C孵育1-2小时。
  2. 用 1 mL 温热 （37 °C） DMEM/F12 洗涤 6 孔板的每个孔 3x。向 6 孔板的每个孔中加入 2 mL 人 iPS 细胞培养基 （CCM）（补充表 S1）。将板在37°C孵育，同时准备细胞进行如下所述的接种。
  3. 用 1 mL 温热的 DMEM/F12 洗涤含有人 iPS 细胞的 6 孔板的每个孔。
  4. 吸出 DMEM/F12。向 6 孔板的每个孔中加入 1 mL 温热的细胞分离缓冲液。在37°C孵育1分钟。
  5. 在显微镜下目视检查每个孔，以确定细胞集落边缘周围的解离情况。小心地从细胞中吸出细胞分离缓冲液。用 1 mL 温热的 DMEM/F12 轻轻清洗每个孔。
  6. 在显微镜下检查板，以确保细胞没有完全从板上分离或被意外吸出。
  7. 向带有细胞的 6 孔板的每个孔中加入 3 mL 温热的人 iPS CCM。使用细胞升降机，轻轻刮除菌落。使用 5 mL 血清移液器，在每个孔中轻轻上下混合一次细胞悬液。
  8. 从培养箱中取出新的基底膜基质1涂层板。将0.5mL细胞悬液转移到新基底膜基质1包被板的每个孔中。以八字形运动移动板以均匀分布细胞。在37°C的5%CO2 培养箱中孵育。
  9. 吸出用过的培养基，并在培养后每天用 3 mL 人 iPS CCM 替换，直到细胞融合 70%（传代后约 4 天）。

3. 第0-16天:人iPSCs分化为中间中胚层细胞

  1. 第 0-2 天:中胚层诱导
    1. 将基底膜基质2包被板从4°C移至室温2小时以在储存后平衡。
    2. 从含有约70%汇合人iPS细胞的6孔板的每个孔中吸出用过的培养基。用 1 mL 温热的 DMEM/F12 轻轻洗涤细胞 3 次。
    3. 吸出 DMEM/F12。向人 iPS 细胞 6 孔板的每个孔中加入 1 mL 细胞分离缓冲液。在37°C孵育5-7分钟。
    4. 在显微镜下目视检查每个孔，以确定细胞集落边缘周围的解离情况。使用细胞升降机，轻轻刮除菌落。
    5. 将细胞悬液从 6 孔板的所有孔转移到 15 mL 锥形管中，并使用 P1000 上下移液数次以获得 iPS 细胞的单细胞悬液。
    6. 用 DMEM/F12 将锥形管中的细胞悬液填充至 14 mL。在室温下以200× g 离心5分钟。
    7. 吸出上清液。将细胞沉淀重悬于 14 mL 温热的 DMEM/F12 中。在室温下以200× g 重复离心5分钟。
    8. 吸出上清液。将细胞重悬于1mL中胚层诱导培养基中（补充表S1）。使用血细胞计数器计数细胞。在中胚层诱导培养基中稀释，以达到 1 × 105 个细胞/mL 的最终浓度。
    9. 从基底膜基质2涂层板吸出涂层。用 1 mL 温热的 DMEM/F12 冲洗基底膜基质 2 包被板 2x 的每个孔。
    10. 轻轻上下移液细胞悬液 2 次。将1mL细胞悬液转移到基底膜基质2包被板的每个孔中。以八字形的动作轻轻移动板以均匀分布细胞。
    11. 将板在37°C孵育过夜。第二天（第1天），从12孔板的每个孔中吸出用过的培养基。用 1 mL 温热的中胚层诱导培养基替换。在37°C孵育过夜。
  2. 第 2-16 天:中间中胚层诱导
    1. 吸出用过的中胚层诱导培养基。用1m L温热的中间中胚层诱导培养基（补充表S1）替换。吸出用过的培养基，每天用 1 mL 温热的中间中胚层诱导培养基替换，持续 14 天。

4. 第0-15天:人iPSCs分化并扩增为血管内皮细胞

  1. 第 0 天:人 iPS 细胞接种
    1. 用 ROCK 抑制剂制备 15 mL 人 iPS CCM（补充表 S1）。在37°C保温。
    2. 将一个基底膜基质1涂层板在37°C孵育1-2小时。 吸出基底膜基质1.用 1 mL 温热的 DMEM/F12 洗涤 3 次。
    3. 吸出 DMEM/F12。向 6 孔板的每个孔中加入 2 mL 含有 ROCK 抑制剂的人 iPS CCM。将板在37°C下孵育，同时准备细胞进行接种，如下所述。
    4. 从含有约70%汇合人iPS细胞的6孔板的每个孔中吸出用过的培养基。用 1 mL 温热的 DMEM/F12 轻轻洗涤细胞 3 次。
    5. 吸出 DMEM/F12。向人 iPS 细胞 6 孔板的每个孔中加入 1 mL 细胞分离缓冲液。在37°C孵育5-7分钟，将细胞解离成单个细胞。
      注意:由于iPS细胞系之间的固有差异，用户需要在5分钟后目视检查细胞以确定最佳孵育时间。
    6. 将细胞转移到 15 mL 锥形管中。用温热的 DMEM/F12 将细胞悬液升至 14 mL，以中和分离缓冲液。在室温下以200×g 离心5分钟。
    7. 轻轻吸出上清液。将细胞重悬于 1 mL 人 iPS CCM 中，含 ROCK 抑制剂。使用血细胞计数器计数细胞总数。
    8. 接种37，000至47，000个细胞/ cm2 （6孔板的355，200至451，200个细胞/孔）之间的细胞。在37°C孵育过夜。
      注意:由于iPS细胞系之间的固有差异，用户需要确定最佳接种密度。
  2. 第 1-3 天:侧中胚层诱导
    1. 第二天（第1天），从人iPS细胞的6孔板的每个孔中吸出用过的培养基。用 5 mL 侧中胚层诱导培养基替换 6 孔板的每个孔（补充表 S1）。当放大培养皿（例如，烧瓶）时，通常用培养皿中工作体积的3倍替换。
    2. 3天内不要更换此培养基。
      注意:孔中的侧向中胚层诱导培养基通常会随着细胞耗尽营养物质而从红色变为黄色。但是，混浊的培养基或细菌生长的培养基是不正常的，应进行净化并丢弃。
  3. 第 4-6 天:内皮细胞诱导
    1. 从6孔板的每个孔中吸出用过的培养基。用 3 mL 温热的内皮诱导培养基替换 6 孔板的每个孔（补充表 S1）。将板在37°C孵育过夜。
    2. 在接下来的 2 天（第 5 天和第 6 天）中，将所有孔中的用过的培养基收集到 50 mL 锥形管中。将锥形管储存在4°C。 用 3 mL 温热的内皮诱导培养基补充细胞。将板在37°C孵育。
  4. 第 7 天:内皮细胞 （viEC） 分选
    1. 取出基底膜基质3烧瓶，在室温下放置1小时。
    2. 准备 50 mL MACS 缓冲液（补充表 S1）。
    3. 将细胞分离缓冲液、MACS 缓冲液、内皮 CCM 和 PBS（不含 Ca 2+ 和 Mg2+）放在组织培养罩中的冰上。
    4. 将磁铁放在 MACS 支架上。将两个 50 mL 锥形管和一个 15 mL 锥形管放入锥形管支架中。
    5. 将MACS支架（连接磁铁）和一个LS柱放入组织培养罩中。将锥形管支架（内部有锥形管）安装在磁铁下方的MACS支架上（补充图S1A）。
    6. 从步骤4.3.2中将6孔板每个孔中的用过的培养基收集到50 mL锥形管中。用PBS（Ca 2 +和Mg2 +游离）洗涤6孔板的每个孔。
    7. 吸出 PBS。加入 1 mL 细胞分离缓冲液。在37°C孵育5-7分钟以完全解离细胞。
    8. 将细胞转移到 50 mL 锥形管中。用冷内皮CCM将细胞悬液带到15mL。在室温下以200× g 离心5分钟。
    9. 吸出上清液。将细胞重悬于 1 mL 冷 MACS 缓冲液中。用血细胞计数器计数细胞。
    10. 向细胞悬液中加入 10 mL MACS 缓冲液。在室温下以200× g 离心5分钟。
    11. 吸出上清液。将细胞重悬于每 1000 万个细胞 80 μL MACS 缓冲液中。每 1000 万个细胞添加 20 μL 的 FcR 封闭试剂、CD31 微珠和 CD144 微珠。在冰上孵育15分钟。
    12. 当细胞悬液孵育时，将从内皮诱导（步骤4.3.2）收集的培养基以200× g 离心10分钟。
    13. 将上清液收集在500mL 0.22μm真空过滤器中。准备内皮条件培养基（补充表S1）。在无菌条件下过滤培养基，并将培养基保持在37°C。
      注意:第3代后内皮细胞增殖率将开始下降。为了在传代3后实现指数增长，从第1代开始，可以补充10μM TGF-Beta抑制剂（SB431542）的内皮条件和维持培养基。
    14. 在步骤4.4.11中孵育15分钟后，每1000万个细胞（最大30mL MACS缓冲液）向细胞悬液中加入10mL MACS缓冲液。以200× g 离心5分钟。
    15. 吸出上清液。重悬于 1 mL MACS 缓冲液中。
    16. 取出LS柱并将柱塞从注射器中拉出。将柱塞放回塑料套管中。将立柱放在磁铁上。
    17. 将第一个 50 mL 锥形管放在色谱柱下方。向色谱柱中加入 1 mL MACS 缓冲液。收集在下面的 50 mL 锥形管中。
    18. 让液体流过，虽然不能完全防止色谱柱干燥。当液滴开始缓慢滴落时，将细胞悬液添加到色谱柱中。将流水收集在同一个 50 mL 锥形管中。
    19. 当液滴开始缓慢滴落时，将下一个 50 mL 锥形管放在色谱柱下方。将初始流通（步骤4.4.18）添加到列中。收集在下面的 50 mL 锥形管中。
    20. 当液滴开始缓慢滴落时，加入 500 μL MACS 缓冲液 3 倍以洗涤色谱柱。
    21. 从磁铁上取下立柱。将色谱柱放在 15 mL 锥形管上。向色谱柱中加入 1 mL 冷 PBS。
    22. 要收集细胞，请从塑料套筒中取出柱塞并将其牢固地推入色谱柱中。
    23. 使用血细胞计数器计数细胞。用PBS将细胞悬液带到5mL。以200× g离心5分钟。
    24. 当细胞进行离心时，用5mL PBS洗涤基底膜基质3包被烧瓶3x以准备细胞接种。吸出 PBS 并将 20 mL 内皮条件培养基加入基底膜基质 3 包被烧瓶中。
    25. 从离心机中取出细胞并吸出上清液。将细胞重悬于内皮条件培养基中，以26，000个细胞/ cm2 （1.95×10个6个 细胞/ T75烧瓶）接种。播种细胞。
    26. 要计算分选效率和细胞产量，请将步骤4.4.23中的细胞计数除以步骤4.4.9中的细胞计数。
  5. 第 8-15 天:VIC 的扩展
    1. 第二天（第8天），从烧瓶中吸出用过的培养基。用 10 mL 内皮条件培养基替换。每隔一天更换一次内皮条件培养基，直到烧瓶90%汇合或直到内皮条件培养基瓶完全使用。
    2. 吸出用过的培养基，每隔一天用 10 mL 内皮维持培养基（补充表 S1）替换一次，以继续扩增。
    3. 为了传代viEC，准备两个基底膜基质3包被的T75烧瓶。将烧瓶在室温下放置1小时。用 5 mL PBS 彻底清洗新鲜制备的烧瓶 3 倍。
    4. 吸出 PBS。向每个新鲜制备的烧瓶中加入 10 mL 温热的内皮维持培养基。将板在37°C下孵育，同时准备细胞进行接种，如下所述。
    5. 将 5 mL 细胞分离缓冲液加入 90% 汇合的 T75 viEC 烧瓶中。在37°C孵育5-7分钟。将细胞转移到 15 mL 锥形管中。加入 5 mL 温热的 DMEM/F12。以200 ×g 离心5分钟。
    6. 吸出上清液。重悬于1 mL温热的内皮维持培养基中。向每个新鲜制备的T75烧瓶中加入500μL细胞悬液。
    7. 第二天，吸出用过的培养基。用 10 mL 内皮维持培养基替换。吸出用过的培养基，每隔一天用 10 mL 内皮维持培养基替换，直到烧瓶汇合 90%。

5. 第14天:制备用于细胞培养的微流控器官芯片装置

  1. 等离子体处理及基底膜基质2涂层
    1. 制备基底膜基质2溶液（步骤1.3）。把它放在一边。
    2. 在无菌组织培养罩中，打开无菌的100 mm x 15 mm圆形培养皿的包装。将培养皿顶部朝下放置在培养皿底部下方（补充图S1B）。
    3. 使用镊子从包装中取出微流体芯片并将它们放入培养皿中。用培养皿下方的盖子关闭培养皿。
    4. 在血浆测定机上，将培养皿盖放在培养皿下方，顶部朝下，将它们作为一个单元放在一起。将培养皿单元置于血浆测定室中。在100 W，15 SCCM，30 s下用氧气启动等离子体测定机。
    5. 时间敏感:治疗完成后，从血浆测定机中取出培养皿单元。用喷洒在实验室湿巾上的 70% 乙醇快速轻轻擦拭培养皿盖。用盖子盖住培养皿。
    6. 将培养皿带到无菌组织培养罩中。将 25 μL 基底膜基质 2 溶液轻轻加入芯片的尿（顶部）通道中。将 20 μL 基底膜基质 2 溶液加入芯片的毛细管（底部）通道中。
    7. 取两个无菌 15 mL 锥形管盖，并用无菌蒸馏水 （~500 μL） 填充它们。将盖子放在培养皿中，以防止芯片通道和膜变干。将盖子放在盘子上。在37°C孵育过夜。

6. 将viEC和中间中胚层细胞接种到微流体装置中

  1. 第15天:viec
    1. 从含有 90% 汇合 viEC 的 T75 烧瓶中吸出培养基。加入5mL细胞分离缓冲液，并在37°C下孵育5-7分钟。
    2. 将细胞转移到 15 mL 锥形管中。加入 5 mL DMEM/F12。以200× g 离心5分钟。
      注意:每个具有约90%汇合viEC的T75烧瓶将产生~300万个细胞。
    3. 吸出上清液。将细胞重悬于300μL内皮维持培养基中，以获得约200万个细胞/ 300μL。 用血细胞计数器计数细胞。将细胞悬液放在一边。
    4. 将含有微流控芯片的培养皿转移到组织培养罩中。将 P200 屏障尖端连接到吸气器的尖端。
    5. 用 200 μL DMEM/F12 冲洗微流控芯片的顶部和底部通道，同时吸出出口的外围。
    6. 将 P200 屏障尖端连接到吸气器，远离底部通道的出口，牢固地握住芯片。将 20 μL 的 viEC 悬浮液与大约 134，000 个细胞牢固地注入芯片的毛细管（底部）通道中。小心地从出口外围吸出培养基。
    7. 在显微镜下检查气泡或不均匀的viEC种子密度。
    8. 轻轻地将芯片翻转过来反转，以便viEC可以粘附在柔性PDMS膜的基底侧。将芯片放入支架盒中。将 3 mL PBS 加入芯片支架盒中，以防止膜干燥。将芯片在37°C孵育3小时。
    9. 检查显微镜下的底部通道，以确定附着在柔性PDMS膜上的viEC汇合层。将 200 μL 内皮维持培养基滴在底部通道的入口处，使其流过通道以洗涤未连接的内皮细胞的通道，同时小心地从毛细血管（底部）通道出口的外围吸出。
    10. 将芯片装回支架盒中。在37°C孵育过夜。
  2. 第16天:中间中胚层（IM）细胞
    1. 用 200 μL 内皮维持培养基轻轻冲洗毛细管（底部）通道，同时小心地吸出出口的外围。
    2. 用 200 μL DMEM/F12 冲洗尿（顶部）通道，同时小心吸出出口的外围。在入口和出口端滴入 ~50 μL DMEM/F12。
    3. 从 12 孔板的每个孔中吸出中间中胚层诱导培养基。
      注意:分化结束时的每个孔提供大约 150 万个 IM 细胞。
    4. 向12孔板的每个孔中加入1mL胰蛋白酶-EDTA，并在37°C下孵育5分钟。
    5. 使用细胞提升器轻轻刮取细胞，并使用P1000上下移液以解离细胞。向每个孔中加入 2 mL 胰蛋白酶中和溶液（补充表 S1）。将细胞转移到 50 mL 锥形管中。用 DMEM/F12 将细胞悬液体积降至 50 mL，并以 200 × g 离心 5 分钟。
    6. 吸出上清液。将细胞重悬于 500 μL 中间中胚层诱导培养基中，以获得约 300 万个细胞/500 μL。 用血细胞计数器计数细胞。
    7. 将 P200 屏障尖端连接到吸气器上，远离尿（顶部）通道的出口，牢固地握住芯片。将含有约 112，500 个 IM 细胞的 25 μL 细胞悬液牢固地注入芯片的尿（顶部）通道中，并小心地从出口外围吸出培养基。
    8. 在显微镜下检查气泡或不均匀的IM细胞接种密度。将 3 mL PBS 加入芯片支架盒中。在37°C孵育3小时。
    9. 用 200 μL 各自的细胞培养基冲洗两个通道，同时小心吸出芯片出口的外围，以帮助防止用过的培养基和细胞碎片向后流动。
    10. 将空的 P200 屏障尖端连接到尿道和毛细血管通道的两个出口。移取 200 μL 内皮维持培养基，并将其一半注入毛细管通道入口。释放入口内的移液器吸头，使通道的入口和出口现在都连接到充满介质的移液器吸头上。
    11. 移液 200 μL IM 维持培养基，并将一半注入尿道入口。释放入口内的移液器吸头，使通道的入口和出口现在都连接到充满介质的移液器吸头上。将芯片与嵌入的尖端在37°C孵育过夜。
  3. 将芯片连接到器官芯片生物反应器以施加流体流动和机械应变。
    1. 从尿道和毛细血管中取出 P200 吸头。将相应介质的液滴添加到尿道和毛细血管通道的入口和出口处，以防止干燥。
    2. 向尿入口储液器中加入 3 mL 温热的足细胞诱导培养基（补充表 S1）。向毛细管入口储液槽中加入 3 mL 温热的内皮维持培养基。
    3. 将 300 μL 温热的足细胞诱导培养基直接添加到尿道出口储液器中，直接通过出口口。将 300 μL 温热的内皮维持培养基直接添加到出口上方的毛细管通道出口储液槽中。
    4. 将豆荚滑到托盘上并进入器官芯片生物反应器。
    5. 使用器官芯片生物反应器上的 旋转拨盘 选择并启动 素数周期 （2 分钟）。目视检查吊舱底部是否有所有四个流体端口上的小液滴。
    6. 要实现 Pod 底部和微流控芯片端口之间的流-液接触，请将芯片载体轻轻滑入 Pod。轻轻向上按切屑托架卡舌。从芯片表面吸出多余的介质。
    7. 将器官芯片生物反应器的流速设置为 60 μL/h。在 0.4 Hz 时将循环应变设置为 10%。使用器官芯片生物反应器上的 旋转拨盘 选择 调节循环 并运行 2小时。
    8. 目视检查出口储液罐是否增加介质液位。
    9. 使用器官芯片生物反应器上的 旋转拨盘 选择 调节循环。

7. 第 17-21 天及以后:足细胞诱导和芯片维护

  1. 从远离端口的尿道出口储液器吸出培养基，但每天培养在储液器中保留一些培养基。每 2 天用最多 3 mL 的足细胞诱导培养基补充尿道入口储液器，持续 5 天。
    1. 5 天后，从尿道吸出培养基，但在储液器中保留一些培养基。每天用 3 mL 足细胞维持培养基补充尿道入口储液器。
  2. 从远离端口斜对角线的毛细管通道出口储液器中吸出培养基，但每天在储液器中保留一些培养基。每天用最多 3 mL 的内皮维持培养基补充毛细血管通道入口储液器。

8. 功能测定和免疫荧光成像

注意:有关流式细胞术分析、芯片流出物的 ELISA 和 mRNA 分离的详细信息，请参阅 补充文件 1 。

  1. 使用菊粉和白蛋白的功能测定（分子过滤）
    1. 从毛细管通道出口储液器中吸出培养基，斜着远离端口，但将一些培养基保留在储液器中。用补充有菊粉和白蛋白的3mL内皮维持培养基（补充表S1）替换6小时。
    2. 使用 5 mL 血清移液器，测量来自尿道的培养基体积（以 mL 为单位），并转移到 15 mL 锥形管中。用铝箔包裹试管以防止光线照射，并尽量减少荧光团偶联菊粉和白蛋白的光漂白。用 3 mL 足细胞维持培养基补充储液器。
    3. 在足细胞维持培养基中制备菊粉储备溶液。从 25 μg/mL 菊粉开始，通过在足细胞维持培养基中通过 2 倍连续稀释 制备 八种标准菊粉。
    4. 同样，在足细胞维持培养基中制备白蛋白储备溶液。从 150 μg/mL 白蛋白开始，在足细胞维持培养基中通过 2 倍连续稀释 液制备 8 种标准品白蛋白。
    5. 将 100 μL 每种标准菊粉浓度一式两份移液到黑色 96 孔板（或总共 16 个菊粉孔）的每个孔中。将 100 μL 每种标准白蛋白浓度一式两份移液到同一 96 孔板的每个孔中（总共 16 个白蛋白孔）。将移液器一式两份 100 μL 足细胞维持培养基作为空白（或足细胞维持培养基的总两个孔）。
    6. 将 100 μL 流出培养基从尿道移液到同一 96 孔板的每个孔中，一式两份。从毛细管通道吸取 100 μL 流出培养基一式两份。
    7. 将板插入读板器，并在激发550nm和发射615nm处测量白蛋白的荧光。在激发 513 nm 和发射 577 nm 处测量菊粉的同一板。
    8. 从生成的数据中，平均重复测量值（每个芯片）。从工作表上的其余数据中减去对应于该板读数的空白值。
    9. 绘制与白蛋白标准品对应的值，以创建x轴上浓度[μg/ mL]和y轴上荧光的标准曲线。绘制与菊粉标准品对应的值，以创建x轴上浓度[μg/mL]，y轴上具有荧光的标准曲线。
    10. 使用统计分析软件包和线性插值法分别确定芯片流出介质中菊粉和白蛋白的尿浓度。
    11. 使用公式（1）2确定芯片中菊粉/白蛋白的尿清除率:
      尿清除率 = （[U] × 紫外线） / [P] （1）
      其中[U]是步骤8.1.10的尿浓度，UV是步骤8.1.2收集的尿道流出物的体积，[P]是菊粉或白蛋白（10μg/mL菊粉或100μg/mL白蛋白）的毛细管浓度。
  2. 免疫荧光成像
    1. 将空的P200尖端注入尿道和毛细血管通道的出口。要固定细胞，请移液 200 μL 4% 甲醛并将其一半注入底部通道入口。松开入口内的移液器吸头。
    2. 吸取 200 μL 4% 甲醛并将其一半注入尿道入口。释放入口内的移液器吸头，使通道的入口和出口现在都连接到装有固定剂的移液器吸头上。
    3. 将芯片在室温下孵育20分钟。
    4. 20分钟后，丢弃所有移液器吸头。将干净、空的 P200 吸头注入泌尿和毛细血管通道的出口。为了透化细胞，移液 200 μL 的 0.125% Triton X-100/PBS 并将其一半注入毛细管通道入口。松开入口内的移液器吸头。
    5. 移液 200 μL 0.125% Triton X-100/PBS，并将其一半注入尿道入口。松开入口内的移液器吸头。将芯片在室温下孵育5分钟。
    6. 丢弃所有移液器吸头。将干净、空的 P200 吸头注入泌尿和毛细血管通道的出口。为了封闭细胞，将 200 μL 1% 牛血清白蛋白 （BSA） 移液到 0.125% Triton X-100/PBS 中，并将其一半注入毛细血管通道入口。松开入口内的移液器吸头。
    7. 在0.125%Triton X-100 / PBS中吸取200μL 1%BSA，并将其一半注射到尿道入口。松开入口内的移液器吸头。在室温下孵育30分钟。
    8. 丢弃所有移液器吸头。将 200 μL 0.125% Triton X-100/PBS 移液到每个通道中并在室温下孵育 5 分钟，将两个通道洗涤 3 次。
    9. 每个通道制备 100 μL 一抗，制造商推荐的稀释度在 0.125% Triton X-100/PBS 中。将干净、空的 P200 吸头注入泌尿和毛细血管通道的出口。移取 100 μL 一抗，将一半注入相应的通道中。松开入口内的移液器吸头。
    10. 在室温下孵育1小时，或者为了获得更好的结果，在4°C孵育过夜。
      注意:可以一次应用多种一抗;但是，一抗溶液必须按照制造商的说明进行稀释。
    11. 按照步骤8.2.8中所述洗涤通道3 x 10分钟。
    12. 使用制造商推荐的稀释因子在 0.125% Triton X-100/PBS 中制备每个通道 100 μL 二抗。将干净、空的 P200 吸头注入泌尿和毛细血管通道的出口。移液 100 μL 二抗并将一半注入相应的通道中。松开入口内的移液器吸头。在室温下孵育1小时。
      注意:每种二抗必须单独应用。根据步骤8.2.8在每次应用之间至少洗涤3×10分钟。
    13. 按照步骤8.2.8中所述洗涤通道3 x 10分钟。
    14. 用 200 μL 蒸馏水冲洗两个通道一次，同时从芯片出口口外围吸出残留液体。
    15. 将干净的空P200注入尿道和毛细血管通道的出口。为了对细胞进行复染，移液 200 μL 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，蒸馏水中 1:1，000 稀释），并将其一半注入毛细管通道入口。将移液器吸头释放到入口内，移液 200 μL DAPI 并将其一半注入尿道入口。将移液器吸头释放到入口内，并在室温下孵育5分钟。
    16. 丢弃所有移液器吸头。将干净、空的 P200 吸头注入泌尿和毛细血管通道的出口。为了对细胞进行复染，移液 200 μL 鬼笔环肽（在不含 Ca 2+ 和 Mg2+ 的 PBS 中以 1:1，000 稀释度）并将其一半注入毛细管通道入口，并在入口内释放移液器吸头。移取 200 μL 鬼笔环肽（在不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS 中以 1:1，000 稀释度）并将其一半注入尿道入口并在入口内释放移液器吸头。在室温下孵育15分钟。
    17. 用不含Ca 2+ 和 Mg 2+ 的200 μL PBS 冲洗通道 3 倍，并从出口口外围吸出多余的液体。
    18. 可视化芯片。

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在这里，我们表明肾小球的功能3D体外模型可以从人iPS细胞的等基因来源血管化和上皮化。具体来说，该协议提供了有关如何应用人类iPS细胞技术的说明，特别是它们分化成特殊细胞类型的能力，以产生肾小球上皮（足细胞）和血管内皮（viEC），可以与微流体装置集成以模拟患者特定水平的人肾的结构和功能。该协议和时间表的示意图（图1A）描述了如何培养有丝分裂活性的人iPS细胞（图1B），然后（平行）分化为中胚层和外中胚层细胞谱系（图1C，D）。发现所得中胚层细胞表达短皮细胞（T），而外中胚层细胞表达短胚层（T），MIXL和EOMES2，9，10，11。

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在本报告中，我们概述了从同基因人iPS细胞系中获得血管内皮和肾小球上皮（足细胞）的方案，并使用这些细胞来设计3D器官芯片系统，该系统模拟肾小球的结构，组织 - 组织界面和分子过滤功能。这种肾小球芯片配备了内皮和肾小球上皮，它们共同为选择性过滤分子提供了屏障。

有兴趣适应该协议的研究人员应考虑以下因素:首先，根据所用干细胞系的固有生长特性，可能需要优化细胞接种。细胞接种密度可能因人iPS细胞增殖速率的内在差异而变化。建议研究人员从协议建议的中胚层接种密度开始，然后在必要时进行调整。同样，建议横向中胚层分化从建议的细胞接种密度开始，然后根据需要进行调整，以实现 50% 或更高的 viEC 产量和分选效率。如果分选后没有足够的细胞分化，可以使用TGF-Beta抑制剂（SB431542）来防止静止并帮助成倍扩增viEC（过去传代3）。然而，一些细胞过程或信号通路依赖于TGF-Beta（例如，高血糖/糖尿病的发病机制，免疫稳态）;因此，建议研究人员考虑TGF-Beta抑制对下游分析的影响，或确保进行充分的测试以避免意外的实验结果。

...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.M.是与人iPS细胞足细胞分化相关的专利的发明者。另一位作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作得到了杜克大学普拉特工程学院、杜克大学医学系肾脏病学系、怀特黑德生物医学研究奖学金和S. Musah基因泰克研究奖的支持。Y. Roye是杜克大学-阿尔弗雷德·P·斯隆基金会奖学金和杜克大学生物医学工程系William M. "Monty" Reichert研究生奖学金的获得者。DU11（杜克大学克隆#11）iPS细胞系在杜克大学iPSC核心设施中产生，并由杜克大学的Bursac实验室提供给我们。作者感谢N. Abutaleb，J. Holmes，R. Bhattacharya和Y. Zhou的技术援助和有益的讨论。作者还要感谢Musah实验室的成员对手稿的有益评论。作者感谢Segura实验室赠送的Acuri C6流式细胞仪。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
抗体
Alexa Fluor 488 和 Alexa Fluor 594 偶联二抗Thermo/Life TechnologiesA32744;编号 A32754;A-11076;编号 A32790;编号 A21203;A11015
胶原蛋白 IVThermo/Life Technologies14-9871-82
肾素ProgenGP-N2
PECAM-1R&D SystemsAF806
PodocinAbcamab50339
VE-钙粘蛋白Santa Cruzsc-9989
基底膜基质
Corning 纤连蛋白、人康宁356008基底膜 （3）
iMatrix-511 层粘连蛋白-E8 （LM-E8） 片段Iwai 北美N8922012基底膜基质 （2）
经 hESC 验证的基质胶基质，5 mL 小瓶BD Biosciences354277基底膜基质 （1）;可能显示批次间差异
Cells
DU11 人 iPS 细胞DU11（杜克大学克隆 #11）iPS 细胞系是在杜克 iPSC 核心设施生成的，由杜克大学的 Bursac 实验室提供。该细胞系已经过测试，发现不含支原体（最后一次测试于 2021 年 11 月）和核型异常（2019 年 7 月）
培养基生长因子和培养基补充剂
0.5M EDTA，pH 值 8.0Invitrogen15575020
2-巯基乙醇Thermo/Life Technologies21985023
来自牛血清的白蛋白，德克萨斯州红偶联物Thermo/Life TechnologiesA23017
全反式维甲酸 （500 毫克）Stem Cell Technologies72262
B27 无血清添加剂Thermo/Life Technologies17504044
不含维生素 A 的 B-27 添加剂 （50x）Thermo/Life Technologies12587010
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA9418
CHIR99021Stemgent04-0004可能显示批次间差异
含 CultureBoost-RCell Systems4Z0-500-R足细胞维持培养基
DMEM/F12Thermo/Life Technologies12634028
含 GlutaMAX 添加剂的 DMEM/F12
的 Thermo/Life Technologies 10565042 DMEM/F12毛喉素（腺苷酸环化酶激活剂）Abcamab120058
GlutaMAX 添加剂Thermo/Life Technologies35050061谷氨酰胺添加剂
热灭活的 FBSThermo/Life Technologies10082147
肝素溶液干细胞技术7980
Human Activin AThermo/Life TechnologiesPHC9544
人 BMP4Preprotech120-05ET
人 BMP7Thermo/Life 技术PHC9544
人 VEGFThermo/Life 技术PHC9394
菊粉-FITCSigma-AldrichF3272
mTeSR1 培养基干细胞技术05850人 iPS 细胞培养基 （CCM）。根据制造商添加 5 倍补充剂。人 iPS CCM 可在 -20 °C 下储存长达 6 个月。
N-2 添加剂 （100x）Thermo/Life Technologies17502048
Neurobasal 培养基Thermo/Life Technologies21103049外侧中胚层基础培养基
PBS（磷酸盐缓冲盐水）Thermo/Life Technologies14190-250
青霉素-链霉素，液体 （100x）Thermo/Life Technologies15140-163
ROCK抑制剂 （Y27632）Tocris1254
StemPro-34 SFMThermo/Life Technologies10639011内皮细胞培养基 （CCM）。根据制造商添加补充剂。内皮 CCM 可以在 4 °C 或 -20 °C 长达 6 个月。
TGF-β 抑制剂 （SB431542）Stem Cell Technologies72234
酶和其他试剂
AccutaseThermo/Life TechnologiesA1110501细胞分离缓冲液
二甲基亚砜 （DMSO）Sigma-AldrichD2438
乙醇溶液，70%（体积/体积），生物技术级VWR97065-058
多聚甲醛 （PFA）Thermo/Life Technologies28906
无菌蒸馏水Thermo/Life Technologies15230162
Triton X-100VWR97062-208
设备
胰蛋白酶 EDTA，0.05%Thermo/Life Technologies25300-120
（Orb） 集线器模块模拟ORB-HM1
100 mm x 15 mm 圆形培养皿FisherbrandFB087579B
120 x 120 mm 方形细胞培养皿VWR688161
Accuri C6BD Biosciences
吸液管，独立包装康宁29442-462
吸液装置SP Bel-ArtF19917-0150
Avanti J-15R 离心Beckman CoulterB99516
锥形离心管，15 mLCorning352097
锥形离心管，50 mLCorning352098
EVOS M7000Thermo/Life TechnologiesAMF7000荧光显微镜拍摄固定和染色的图像细胞。
血球计数器VWR100503-092
Heracell VIOS 160i CO2 培养箱Thermo/Life Technologies51030403
配备 AxioCam 503 相机的倒置蔡司 Axio Observer卡尔蔡司显微镜491916-0001-000（显微镜）;426558-0000-000（相机）
Kimberly-Clark 丁腈手套VWR40101-346
Kimwipes，大号VWR21905-049
Leoca SP8 正置共聚焦显微镜
培养基储液器（POD 便携式模块）模拟POD-1
微孔板摇床VWR12620-926
器官芯片模拟S-1 芯片
芯片支架AK-CCR
P10精密屏障移液器吸头Denville ScientificP1096-FR
P100 屏障式移液器吸头Denville ScientificP1125
P1000 屏障式移液器吸头Denville ScientificP1121
P20 屏障式移液器吸头Denville ScientificP1122
P200 屏障式移液器吸头Denville ScientificP1122
等离子体 AsherQuorum 技术K1050X RF这款等离子体蚀刻机/Asher/清洁器被用作杜克大学共享材料仪器设施 （SMiF） 的一部分。
圆底聚苯乙烯试管，带细胞过滤器卡口盖康宁352235
移液管，10 mL，单独包装康宁356551
血清移液管，25 mL，单独包装的康宁356525
移液管，5 mL，单独包装康宁356543
Steriflip，0.22 &微量;m， PESEMD MilliporeSCGP00525
无菌微量离心管Thomas Scientific1138W14
T75cm2 带通气盖的细胞培养瓶康宁430641U
组织培养处理的 12 孔板康宁353043
组织培养处理的 6 孔板康宁353046
真空调节剂和蠕动泵（Zoe 培养模块）模拟ZOE-CM1器官芯片生物反应器
VE-钙粘蛋白 CD144 抗人抗体 - APC 偶联Miltenyi Biotec130-126-010
宽斜面细胞提升器康宁3008
MACS
CD144 微珠，人Miltenyi Biotec130-097-857
CD31 微珠试剂盒，人Miltenyi Biotec130-091-935
LS 色谱柱Miltenyi Biotec130-042-401
含谷氨酰胺机 器官模拟 血清 血清的

References

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