本文介绍了一种构建个性化器官芯片系统的方案，该系统通过整合由人诱导多能干细胞分化而来的基因匹配的上皮细胞和血管内皮细胞，模拟肾脏肾小球滤过屏障的结构与功能。这种生物工程系统可推动肾脏精准医学及相关应用的发展。
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本文内容
摘要
摘要
慢性肾病（CKD）影响着美国15%的成年人口，但由于缺乏能够准确预测人类生物学反应和肾毒性的功能性模型，靶向治疗的发展受到限制。肾脏精准医学的进步有望克服这些局限。然而，以往建立的 体外 人肾小球（血液滤过的主要部位，也是多种疾病和药物毒性的关键靶点）的模型通常采用功能特性有限且遗传背景不一致的异质性细胞群体，这些局限性显著制约了其在患者特异性疾病建模和治疗发现中的应用。
本文介绍了一种将来自同一患者的诱导性多能干细胞（iPS细胞）来源的肾小球上皮细胞（足细胞）与血管内皮细胞整合的实验方案，用于构建具有同基因型且带血管化的微流控肾小球芯片。所构建的肾小球芯片包含来源于干细胞的内皮细胞层和上皮细胞层，这些细胞表达谱系特异性标志物，产生基底膜蛋白，并形成类似于肾脏肾小球滤过屏障的组织-组织界面。该工程化肾小球芯片可选择性地过滤分子，并重现药物诱导的肾损伤。利用同基因型细胞重建肾小球结构与功能的能力，为实现患者特异性的肾病建模提供了可能，并推动了器官芯片在肾脏精准医学及相关应用中的实用性。
引言
器官芯片设备是利用分子和机械刺激以及血管化来形成组织-组织界面的动态三维体外模型，可模拟特定器官的结构与功能。以往建立的旨在模拟肾脏肾小球（肾小球芯片）的器官芯片设备，主要采用动物细胞系1或来源异质的人原代细胞系和永生化细胞系2,3。使用遗传背景异质的细胞来源会带来显著变异，严重限制了对患者特异性反应、疾病遗传学或发病机制的研究4,5。解决这一挑战的关键在于能否获得来自特定个体、具有相同遗传背景（同基因型）且保留了完整分子与遗传特征的细胞系，从而为构建更精确的体外模型提供理想的微环境2,3,6。 近年来，随着人类诱导多能干细胞（iPS细胞）培养技术的进步，现已可便捷地获得人源同基因型细胞系。由于人类iPS细胞通常可通过非侵入方式获取，具有无限自我更新能力，并能分化为几乎所有类型的细胞，因此成为构建体外模型（如肾小球芯片）的理想细胞来源7,
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方案
1. 准备基底膜基质溶液及包被基质
- 将基底膜基质1在4 °C的冰上过夜解冻。根据制造商建议的稀释比例进行分装。使用50 mL锥形管和移液器，将适量的基底膜基质1加入25 mL冷的DMEM/F12中，彻底混匀，直至完全解冻并溶解。
- 为溶解冷冻的分装样品，从25 mL冷的DMEM/F12中取出约200 µL，转移至冷冻的分装管中。反复吹打，直至基质完全解冻并溶解。将基底膜基质1的全部内容物转移至剩余的冷DMEM/F12中。
- 将1 mL基底膜基质1溶液加入6孔板的每孔中。若需当天使用包被的板，于37 °C孵育2小时。
- 或者，包被后的板可用封口膜包裹，在4 °C保存最多2周。使用储存的板时，于37 °C孵育30分钟。
- 将基底膜基质2用9 mL无菌蒸馏水稀释，使其终浓度为5 µg/mL。将700 µL基底膜基质2溶液加入12孔板的每孔中。用封口膜包裹基底膜基质2包被的板，在4 °C保存最多2周。
- 根据制造商建议，用磷酸盐缓冲液（PBS，无Ca+2和Mg+2）将冻干的基底膜基质3重悬，使其终浓度为1 mg/mL。将一份250 µL的分装样品用9.75 mL PBS（无Ca+2和Mg+2）稀释至终浓度25 µg/mL。取6 mL该溶液包被一....
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结果
在此，我们展示了功能性3D 体外 由同基因来源的人诱导多能干细胞（iPS细胞）构建的肾小球模型可实现血管化和上皮化。具体而言，本方案提供了如何应用人iPS细胞技术（尤其是其分化为特定细胞类型的能力）的详细说明，以生成肾脏肾小球上皮细胞（足细胞）和血管内皮细胞（viECs），并将其整合至微流控装置中，从而在患者特异性水平上模拟人肾脏的结构与功能。本方案的示意图及时间线概述（图1A) 描述了如何培养有丝分裂活跃的人类诱导多能干细胞（iPS细胞）图1B）然后将它们（平行地）分化为中胚层和侧中胚层细胞系（图1C，D). 结果发现，所产生的中胚层细胞表达brachyury（T），而侧中胚层细胞表达brachyury（T）、MIXL和EOMES2,9,
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讨论
本报告中，我们概述了一种从同基因型人诱导多能干细胞系中分化出血管内皮细胞和肾小球上皮细胞（足细胞）的实验方案，并介绍了利用这些细胞构建三维“器官芯片”系统的方法，该系统可模拟肾脏肾小球的结构、组织-组织界面以及分子滤过功能。该肾小球芯片包含内皮细胞和肾小球上皮细胞，二者共同形成一道选择性滤过分子的屏障。
有意采用本方案的研究人员应考虑以下事项：首先，根据所用干细胞系固有的生长特性，可能需要对细胞接种条件进行优化。由于不同人源iPS细胞增殖速率存在内在差异，细胞接种密度可能需要调整。建议研究人员初始采用本方案推荐的中胚层细胞接种密度，之后根据需要进行调整。同样，建议侧中胚层分化也从推荐的细胞接种密度开始，再根据需要调整，以实现静脉内皮样细胞（viEC）产量和分选效率达到50%或更高。若分选后获得的细胞数量不足，可使用TGF-β抑制剂（SB431542）以防止细胞进入静息状态，并促进viEC呈指数扩增（传代3次以后）。然而，多个细胞过程或信号通路依赖于TGF-β（例如高血糖/糖尿病的发病机制、免疫稳态）；因此，建议研究人员在下游分析中充分考虑TGF-β抑制可能带来的影响，或进行充分验证.......
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披露
S.M. 是一项与人iPS细胞分化为足细胞相关的专利的发明人。另一位作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了杜克大学普拉特工程学院、杜克大学医学院肾病科、生物医学研究怀特海德奖学金以及S. Musah获得的基因泰克研究奖的支持。Y. Roye获得了杜克大学与阿尔弗雷德·P·斯隆基金会联合设立的奖学金，以及杜克大学生物医学工程系颁发的威廉·M. "蒙蒂"·赖希特研究生奖学金。DU11（杜克大学克隆#11）诱导多能干细胞系由杜克大学iPSC核心实验室制备，并由杜克大学Bursac实验室提供。作者感谢N. Abutaleb、J. Holmes、R. Bhattacharya和Y. Zhou在技术方面提供的协助和有益的讨论。作者还感谢Musah实验室成员对稿件提出的宝贵意见。作者感谢Segura实验室赠送Acuri C6流式细胞仪。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗体 | |||
| Alexa Fluor 488 和 Alexa Fluor 594 标记的二抗 | Thermo/Life Technologies | A32744; A32754; A-11076; A32790; A21203; A11015 | |
| IV型胶原蛋白 | Thermo/Life Technologies | 14-9871-82 | |
| Nephrin | Progen | GP-N2 | |
| PECAM-1 | R&D Systems | AF806 | |
| Podocin | Abcam | ab50339 | |
| VE-Cadherin | Santa Cruz | sc-9989 | |
| 基底膜基质 | |||
| Corning 人纤维连接蛋白 | Corning | 356008 | 基底膜（3） |
| iMatrix-511 层粘连蛋白-E8（LM-E8）片段 | Iwai North America | N8922012 | 基底膜基质（2） |
| Matrigel hESC 认证基质，5 mL 瓶装 | BD Biosciences | 354277 | 基底膜基质（1）；可能存在批间差异 |
| 细胞 | |||
| DU11 人诱导多能干细胞 | DU11（杜克大学克隆 #11）iPS 细胞系由杜克大学 iPSC 核心设施生成，并由杜克大学 Bursac 实验室提供。该细胞系经检测无支原体污染（最近一次检测时间为2021年11月），且无核型异常（2019年7月） | ||
| 培养基、生长因子及培养基添加剂 | |||
| 0.5 M EDTA，pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 2-巯基乙醇 | Thermo/Life Technologies | 21985023 | |
| 牛血清白蛋白，德克萨斯红标记 | Thermo/Life Technologies | A23017 | |
| 全反式维甲酸（500 mg） | Stem Cell Technologies | 72262 | |
| B27 无血清添加剂 | Thermo/Life Technologies | 17504044 | |
| B-27 添加剂（50倍浓度），不含维生素A | Thermo/Life Technologies | 12587010 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | 可能存在批间差异 |
| 含 CultureBoost-R 的完全培养基试剂盒 | Cell Systems | 4Z0-500-R | 足细胞维持培养基 |
| DMEM/F12 | Thermo/Life Technologies | 12634028 | |
| 含 GlutaMAX 添加剂的 DMEM/F12 | Thermo/Life Technologies | 10565042 | 含谷氨酰胺的 DMEM/F12 |
| 福斯高林（腺苷酸环化酶激活剂） | Abcam | ab120058 | |
| GlutaMAX 添加剂 | Thermo/Life Technologies | 35050061 | 谷氨酰胺添加剂 |
| 热灭活胎牛血清 | Thermo/Life Technologies | 10082147 | |
| 肝素溶液 | Stem Cell Technologies | 7980 | |
| 人 Activin A | Thermo/Life Technologies | PHC9544 | |
| 人 BMP4 | Preprotech | 120-05ET | |
| 人 BMP7 | Thermo/Life Technologies | PHC9544 | |
| 人 VEGF | Thermo/Life Technologies | PHC9394 | |
| 菊粉-FITC | Sigma-Aldrich | F3272 | |
| mTeSR1 培养基 | Stem Cell Technologies | 05850 | 人 iPS 细胞培养基（CCM）。根据制造商说明添加 5 倍添加剂。人 iPS CCM 可在 -20 °C 下保存长达 6 个月。 |
| N-2 添加剂（100倍浓度） | Thermo/Life Technologies | 17502048 | |
| Neurobasal 培养基 | Thermo/Life Technologies | 21103049 | 侧中胚层基础培养基 |
| PBS（磷酸盐缓冲液） | Thermo/Life Technologies | 14190-250 | |
| 青霉素-链霉素溶液（100倍浓度） | Thermo/Life Technologies | 15140-163 | |
| ROCK 抑制剂（Y27632） | Tocris | 1254 | |
| StemPro-34 SFM | Thermo/Life Technologies | 10639011 | 内皮细胞培养基（CCM）。根据制造商说明添加添加剂。内皮 CCM 可在 4 °C 下保存长达两周，或在 -20 °C 下保存长达 6 个月。 |
| TGF-β 抑制剂（SB431542） | Stem Cell Technologies | 72234 | |
| 酶及其他试剂 | |||
| Accutase | Thermo/Life Technologies | A1110501 | 细胞解离缓冲液 |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| 乙醇溶液，70%（体积/体积），生物技术级 | VWR | 97065-058 | |
| 多聚甲醛（PFA） | Thermo/Life Technologies | 28906 | |
| 无菌蒸馏水 | Thermo/Life Technologies | 15230162 | |
| 吐温 X-100 | VWR | 97062-208 | |
| 设备 | |||
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA | Thermo/Life Technologies | 25300-120 | |
| （Orb）Hub 模块 | Emulate | ORB-HM1 | |
| 100 mm × 15 mm 圆形培养皿 | Fisherbrand | FB087579B | |
| 120 mm × 120 mm 方形细胞培养皿 | VWR | 688161 | |
| Accuri C6 | BD Biosciences | ||
| 吸管，独立包装 | Corning | 29442-462 | |
| 吸液装置 | SP Bel-Art | F19917-0150 | |
| Avanti J-15R 离心机 | Beckman Coulter | B99516 | |
| 锥形离心管，15 mL | Corning | 352097 | |
| 锥形离心管，50 mL | Corning | 352098 | |
| EVOS M7000 | Thermo/Life Technologies | AMF7000 | 用于拍摄固定和染色细胞的荧光显微镜。 |
| 血细胞计数板 | VWR | 100503-092 | |
| Heracell VIOS 160i CO2 培养箱 | Thermo/Life Technologies | 51030403 | |
| 配备 AxioCam 503 相机的倒置 Zeiss Axio Observer 显微镜 | Carl Zeiss Micrscopy | 491916-0001-000（显微镜）；426558-0000-000（相机） | |
| Kimberly-Clark 丁腈手套 | VWR | 40101-346 | |
| Kimwipes，大号 | VWR | 21905-049 | |
| Leica SP8 正置共聚焦显微镜 | |||
| 培养基储液槽（POD 便携模块） | Emulate | POD-1 | |
| 微孔板摇床 | VWR | 12620-926 | |
| 器官芯片 | Emulate | S-1 Chip | |
| 器官芯片支架 | Emulate | AK-CCR | |
| P10 精密屏障移液器吸头 | Denville Scientific | P1096-FR | |
| P100 屏障移液器吸头 | Denville Scientific | P1125 | |
| P1000 屏障移液器吸头 | Denville Scientific | P1121 | |
| P20 屏障移液器吸头 | Denville Scientific | P1122 | |
| P200 屏障移液器吸头 | Denville Scientific | P1122 | |
| 等离子清洗仪 | Quorum tech | K1050X RF | 该等离子刻蚀/灰化/清洗仪为杜克大学共享材料仪器设施（SMiF）的一部分。 |
| 带滤网旋盖的圆底聚苯乙烯试管 | Corning | 352235 | |
| 血清移液管，10 mL，独立包装 | Corning | 356551 | |
| 血清移液管，25 mL，独立包装 | Corning | 356525 | |
| 血清移液管，5 mL，独立包装 | Corning | 356543 | |
| Steriflip，0.22 µm，PES | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| 无菌微量离心管 | Thomas Scientific | 1138W14 | |
| 带透气盖的 T75 cm2 细胞培养瓶 | Corning | 430641U | |
| 组织培养处理的 12 孔板 | Corning | 353043 | |
| 组织培养处理的 6 孔板 | Corning | 353046 | |
| 真空调节器和蠕动泵（Zoe 培养模块） | Emulate | ZOE-CM1 | 器官芯片生物反应器 |
| VE-Cadherin CD144 抗人抗体 - APC 标记 | Miltenyi Biotec | 130-126-010 | |
| 宽斜面细胞刮刀 | Corning | 3008 | |
| MACS | |||
| CD144 MicroBeads，人源 | Miltenyi Biotec | 130-097-857 | |
| CD31 MicroBead 试剂盒，人源 | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | |
| LS 柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-401 |
参考文献
- Wang, L., et al. A disease model of diabetic nephropathy in a glomerulus-on-a-chip microdevice. Lab on a Chip. 17 (10), 1749-1760 (2017).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripot....
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