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方法文章

由人诱导多能干细胞构建的等基因肾小球芯片

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DOI：

10.3791/63821

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2022年11月4日

 , 
1Department of Biomedical Engineering, Pratt School of Engineering, Duke University, 2Department of Medicine, Division of Nephrology, Duke University School of Medicine, 3Department of Cell Biology, Duke University, 4Center for Biomolecular and Tissue Engineering, Duke University

本文内容

摘要

本文介绍了一种构建个性化器官芯片系统的方案，该系统通过整合由人诱导多能干细胞分化而来的基因匹配的上皮细胞和血管内皮细胞，模拟肾脏肾小球滤过屏障的结构与功能。这种生物工程系统可推动肾脏精准医学及相关应用的发展。

摘要

慢性肾病（CKD）影响着美国15%的成年人口，但由于缺乏能够准确预测人类生物学反应和肾毒性的功能性模型，靶向治疗的发展受到限制。肾脏精准医学的进步有望克服这些局限。然而，以往建立的 体外 人肾小球（血液滤过的主要部位，也是多种疾病和药物毒性的关键靶点）的模型通常采用功能特性有限且遗传背景不一致的异质性细胞群体，这些局限性显著制约了其在患者特异性疾病建模和治疗发现中的应用。

本文介绍了一种将来自同一患者的诱导性多能干细胞（iPS细胞）来源的肾小球上皮细胞（足细胞）与血管内皮细胞整合的实验方案，用于构建具有同基因型且带血管化的微流控肾小球芯片。所构建的肾小球芯片包含来源于干细胞的内皮细胞层和上皮细胞层，这些细胞表达谱系特异性标志物，产生基底膜蛋白，并形成类似于肾脏肾小球滤过屏障的组织-组织界面。该工程化肾小球芯片可选择性地过滤分子，并重现药物诱导的肾损伤。利用同基因型细胞重建肾小球结构与功能的能力，为实现患者特异性的肾病建模提供了可能，并推动了器官芯片在肾脏精准医学及相关应用中的实用性。

引言

器官芯片设备是利用分子和机械刺激以及血管化来形成组织-组织界面的动态三维体外模型，可模拟特定器官的结构与功能。以往建立的旨在模拟肾脏肾小球（肾小球芯片）的器官芯片设备，主要采用动物细胞系1或来源异质的人原代细胞系和永生化细胞系2,3。使用遗传背景异质的细胞来源会带来显著变异，严重限制了对患者特异性反应、疾病遗传学或发病机制的研究4,5。解决这一挑战的关键在于能否获得来自特定个体、具有相同遗传背景（同基因型）且保留了完整分子与遗传特征的细胞系，从而为构建更精确的体外模型提供理想的微环境2,3,6。 近年来，随着人类诱导多能干细胞（iPS细胞）培养技术的进步，现已可便捷地获得人源同基因型细胞系。由于人类iPS细胞通常可通过非侵入方式获取，具有无限自我更新能力，并能分化为几乎所有类型的细胞，因此成为构建体外模型（如肾小球芯片）的理想细胞来源7,8。肾小球滤过屏障是血液滤过的主要部位，血液依次通过血管内皮、肾小球基底膜，最终穿过一种特化的上皮细胞——足细胞。这三层结构共同构成了滤过屏障，协同实现对分子的选择性滤过。本文介绍了一种利用单一人源iPS细胞来源构建包含血管内皮和肾小球上皮的器官芯片设备的技术方案。该方案不仅特别适用于构建具有同基因型特征且具备血管化的芯片以模拟肾小球滤过屏障，也为开发其他类型的个性化器官芯片及多器官集成平台（例如同基因型“人体芯片”系统）提供了可借鉴的技术蓝图。

本方案首先将人iPS细胞分别分化为两种不同的谱系——侧中胚层和中胚层细胞，随后进一步分化为血管内皮和肾小球上皮。为了生成侧中胚层细胞，将人iPS细胞接种于包被有基底膜基质1的培养板上，在N2B27培养基中培养3天（期间不更换培养基），并添加Wnt激活剂CHIR 99021和强效中胚层诱导因子骨形态发生蛋白4（BMP4）。所获得的侧中胚层细胞此前已被证实表达brachyury（T）、mix配对样同源框蛋白（MIXL）和内胚层中胚层同源蛋白（EOMES）9。随后，将侧中胚层细胞在添加VEGF165和福斯科林（Forskolin）的培养基中继续培养4天，以诱导生成血管内皮细胞，并通过磁珠激活细胞分选技术（MACS）根据VE-钙黏蛋白和/或PECAM-1的表达对细胞进行分选。所得血管内皮细胞（viEC）在包被有基底膜基质3的培养瓶中扩增培养，直至可用于微流控装置的接种。

为生成中胚层细胞，将人iPS细胞接种于包被有基底膜基质2的培养板上，并在含有Activin A和CHIR99021的培养基中培养2天。所获得的中胚层细胞表达HAND1、goosecoid和brachury（T），特征如先前所述2,10,11。为诱导中间中胚层（IM）细胞分化，将中胚层细胞在添加BMP-7和CHIR99021的培养基中继续培养14天。所获得的IM细胞表达Wilms肿瘤1（WT1）、成对盒基因2（PAX2）和odd-skipped相关蛋白1（OSR-1）2,10,11。

设计了一种基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的双通道微流控芯片，用于在体外模拟肾小球滤过屏障的结构。in vitro。尿液通道尺寸为1,000 µm × 1,000 µm（宽 × 高），毛细血管通道尺寸为1,000 µm × 200 µm（宽 × 高）。通过流体通道两侧的中空腔室实现周期性拉伸和松弛循环。细胞被接种在分隔尿液通道和毛细血管通道的柔性PDMS膜（厚度50 µm）上。该膜上设有六边形孔（孔径7 µm，孔间距40 µm），以促进细胞间信号传导（图1A）2,12。在IM诱导完成前两天，用基底膜基质2对微流控芯片进行包被。IM诱导完成前一天，使用内皮细胞维持培养基将viECs接种至微流控芯片的毛细血管通道中，并将芯片倒置，以促进细胞在ECM包被的PDMS膜基底侧的黏附。在IM诱导完成当天，使用添加了BMP7、Activin A、CHIR99021、VEGF165和all trans视黄酸的培养基将细胞接种至微流控芯片的尿液通道中，以诱导芯片内足细胞的分化。次日，向培养基储液池中加入足细胞诱导培养基和内皮细胞维持培养基，并对芯片施加10%机械应变（0.4 Hz）和流体流动（60 µL/h）。

将已形成细胞结构的微流控芯片在足细胞诱导培养基（尿液通道）和内皮细胞维持培养基（血管通道）中继续培养5天。所得的肾小球芯片随后在足细胞和内皮细胞的维持培养基中进一步培养最多7天。分化后的足细胞呈阳性表达谱系特异性蛋白，包括podocin和nephrin13,14；而血管内皮细胞（viECs）则呈阳性表达谱系鉴定蛋白PECAM-1和VE-Cadherin，这些分子均为维持肾小球滤过屏障完整性所必需15,16。足细胞和viECs均被发现可分泌肾小球基底膜中最丰富的蛋白——IV型胶原蛋白，该蛋白对组织成熟和功能亦具有重要意义。

肾小球芯片中的滤过屏障三组分系统——内皮细胞、基底膜和上皮细胞——能够选择性地滤过分子，并对化疗性肾毒性药物处理产生响应。药物处理结果表明，该肾小球芯片可用于肾毒性研究及疾病建模。本方案提供了利用同基因来源的诱导多能干细胞（iPS细胞）衍生物构建功能性微流控肾小球芯片的通用指南。研究人员可根据需要对构建的芯片进行后续分析。有关使用肾小球芯片模拟药物诱导的肾小球损伤的更多信息，请参见以往的出版物2,12。

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方案

1. 准备基底膜基质溶液及包被基质

  1. 将基底膜基质1在4 °C的冰上过夜解冻。根据制造商建议的稀释比例进行分装。使用50 mL锥形管和移液器，将适量的基底膜基质1加入25 mL冷的DMEM/F12中，彻底混匀，直至完全解冻并溶解。
    1. 为溶解冷冻的分装样品，从25 mL冷的DMEM/F12中取出约200 µL，转移至冷冻的分装管中。反复吹打，直至基质完全解冻并溶解。将基底膜基质1的全部内容物转移至剩余的冷DMEM/F12中。
  2. 将1 mL基底膜基质1溶液加入6孔板的每孔中。若需当天使用包被的板，于37 °C孵育2小时。
    1. 或者，包被后的板可用封口膜包裹，在4 °C保存最多2周。使用储存的板时，于37 °C孵育30分钟。
  3. 将基底膜基质2用9 mL无菌蒸馏水稀释，使其终浓度为5 µg/mL。将700 µL基底膜基质2溶液加入12孔板的每孔中。用封口膜包裹基底膜基质2包被的板，在4 °C保存最多2周。
  4. 根据制造商建议，用磷酸盐缓冲液（PBS，无Ca+2和Mg+2）将冻干的基底膜基质3重悬，使其终浓度为1 mg/mL。将一份250 µL的分装样品用9.75 mL PBS（无Ca+2和Mg+2）稀释至终浓度25 µg/mL。取6 mL该溶液包被一个T75培养瓶（终浓度为2 µg/cm2）。基质包被的培养瓶在4 °C保存最多1周。

2. 人iPS细胞培养

注意：本方案中使用的 DU11 细胞系经过检测，未发现支原体污染和核型异常。

  1. 将包被有基底膜基质1的培养板在37°C下孵育1–2小时。
  2. 用1 mL预热（37 °C）的DMEM/F12培养基将6孔板每孔洗涤3次。向6孔板每孔加入2 mL人iPS细胞培养基（CCM）（补充表S1）。在按以下步骤准备细胞接种的同时，将培养板置于37 °C孵育。
  3. 用1 mL预热的DMEM/F12培养基洗涤含有人iPS细胞的6孔板每孔。
  4. 吸除DMEM/F12培养基。向6孔板每孔加入1 mL预热的细胞解离缓冲液。在37 °C下孵育1分钟。
  5. 在显微镜下观察每孔细胞集落边缘是否发生解离。小心吸除细胞解离缓冲液。用1 mL预热的DMEM/F12培养基轻柔洗涤每孔一次。
  6. 在显微镜下检查培养板，确保细胞未从培养板完全脱落或被意外吸除。
  7. 向含有细胞的6孔板每孔加入3 mL预热的人iPS细胞CCM培养基。使用细胞刮棒轻柔刮下细胞集落。用5 mL移液管将每孔细胞悬液上下轻柔吹打混匀一次。
  8. 从培养箱中取出新的包被有基底膜基质1的培养板。将0.5 mL细胞悬液转移至新板的每孔中。以“8”字形方式轻轻晃动培养板，使细胞均匀分布。置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育。
  9. 每日吸除用过的培养基，并更换为3 mL新鲜人iPS细胞CCM培养基，持续培养至细胞融合度达到70%（传代后约4天）。

3. 第0-16天：将人iPSCs分化为中间中胚层细胞

  1. 第0-2天：中胚层诱导
    1. 将包被有基底膜基质2的培养板从4 °C转移至室温，平衡2小时，以恢复至室温。
    2. 吸除含有约70%融合度人iPS细胞的6孔板中各孔的旧培养基。用1 mL温热的DMEM/F12轻柔洗涤细胞3次。
    3. 吸除DMEM/F12。向每孔人iPS细胞的6孔板中加入1 mL细胞解离缓冲液。在37 °C孵育5-7分钟。
    4. 在显微镜下观察各孔细胞集落边缘是否发生解离。使用细胞刮棒轻柔刮取细胞集落。
    5. 将6孔板所有孔中的细胞悬液转移至15 mL锥形管中，用P1000移液器反复吹打数次，以获得单细胞悬液。
    6. 用DMEM/F12将锥形管中的细胞悬液补至14 mL。在室温下以200 ×g离心5分钟。
    7. 吸除上清液。将细胞沉淀重悬于14 mL温热的DMEM/F12中。再次在室温下以200 ×g离心5分钟。
    8. 吸除上清液。将细胞重悬于1 mL中胚层诱导培养基（补充表S1）中。使用血细胞计数板计数细胞，并用中胚层诱导培养基稀释至终浓度为1 × 105 个细胞/mL。
    9. 吸除基底膜基质2包被的培养板中的包被液。用1 mL温热的DMEM/F12对基底膜基质2包被的培养板每孔冲洗2次。
    10. 用移液器轻柔吹打细胞悬液2次。向基底膜基质2包被的培养板每孔加入1 mL细胞悬液。轻柔地以“8”字形移动培养板，使细胞均匀分布。
    11. 将培养板在37 °C孵育过夜。次日（第1天），吸除12孔板各孔中的旧培养基，每孔更换1 mL温热的中胚层诱导培养基。在37 °C继续孵育过夜。
  2. 第2-16天：中间中胚层诱导
    1. 吸除旧的中胚层诱导培养基，每孔加入1 mL温热的中间中胚层诱导培养基（补充表S1）。此后每天更换一次培养基，即吸除旧培养基并更换为1 mL温热的中间中胚层诱导培养基，持续14天。

4. 第0-15天：人iPSC向血管内皮细胞的分化与扩增

  1. 第0天：人iPS细胞接种
    1. 准备15 mL含ROCK抑制剂的人类iPS细胞完全培养基（human iPS CCM）补充表 S1）。在37 °C下保温。
    2. 在37 °C下孵育一块基底膜基质1包被的培养板1–2小时。吸除基底膜基质1。用1 mL温热的DMEM/F12洗涤3次。
    3. 吸弃 DMEM/F12 培养基。向 6 孔板的每孔中加入 2 mL 含 ROCK 抑制剂的人类 iPS CCM 培养基。将培养板置于 37 °C 培养箱中孵育，同时按以下步骤准备待接种的细胞。
    4. 吸弃6孔板中每个孔的旧培养基，该6孔板中含约70%融合度的人iPS细胞。用1 mL预热的DMEM/F12轻柔洗涤细胞3次。
    5. 吸弃 DMEM/F12 培养基。向每孔人 iPS 细胞的 6 孔板中加入 1 mL 细胞解离缓冲液。在 37 °C 下孵育 5–7 分钟，使细胞解离为单细胞。
      注意：由于iPS细胞系之间存在固有差异，使用者需在5分钟后目视检查细胞，以确定最佳孵育时间。
    6. 将细胞转移至15 mL锥形管中。加入温热的DMEM/F12培养基至终体积14 mL，以中和消化缓冲液。200 × g离心5分钟× g 在室温下
    7. 轻轻吸除上清液。用1 mL含ROCK抑制剂的Human iPS CCM重悬细胞。使用血细胞计数板计数细胞总数。
    8. 在每平方厘米接种37,000至47,000个细胞2 （每孔355,200至451,200个细胞，使用6孔板）。在37 °C下孵育过夜。
      注意：由于iPS细胞系之间存在固有差异，使用者需确定最佳接种密度。
  2. 第1-3天：侧中胚层诱导
    1. 第二天（第1天），吸出人iPS细胞6孔板中每个孔的用过的培养基。向6孔板的每个孔中加入5 mL侧方中胚层诱导培养基（Lateral Mesoderm Induction medium）补充表 S1扩大培养容器（如培养瓶）时，通常应替换为培养容器工作体积3倍的培养基。
    2. 3 天内不要更换此培养基。
      注意：随着细胞消耗营养物质，孔中的侧中胚层诱导培养基通常会从红色变为黄色。然而，培养基浑浊或出现细菌生长属于异常情况，应进行去污染处理并丢弃。
  3. 第4–6天：内皮细胞诱导
    1. 吸弃6孔板中每孔的旧培养基，每孔更换为3 mL温热的内皮诱导培养基（补充表 S137 °C 下孵育平板过夜。
    2. 在接下来的2天（第5天和第6天），将所有孔中的用过的培养基收集至一个50 mL锥形管中，将锥形管置于4 °C保存。向细胞中补充3 mL预热的内皮诱导培养基，将培养板在37 °C孵育。
  4. 第7天：内皮细胞（viEC）分选
    1. 取出基底膜基质3个培养瓶，室温放置1小时。
    2. 配制 50 mL MACS 缓冲液（补充表 S1).
    3. 放置细胞解离缓冲液、MACS缓冲液、内皮细胞完全培养基（Endothelial CCM）和PBS（Ca2+ 和 Mg2+ 在组织培养操作台中，将样品置于冰上（无自由水状态）。
    4. 将磁铁放置在MACS支架上。在锥形管架中放置两个50 mL锥形管和一个15 mL锥形管。
    5. 将MACS磁力架（带磁铁）和一个LS柱放入组织培养罩内。在MACS磁力架下方、磁铁正下方位置安装锥形管架（内含锥形管）补充图 S1A).
    6. 将6孔板中每孔的用过的培养基收集到4.3.2步骤中的50 mL锥形管中。用PBS（不含Ca2+ 和 Mg2+ 自由的）。
    7. 吸去 PBS，加入 1 mL 细胞解离缓冲液，37 °C 孵育 5–7 分钟，以充分解离细胞。
    8. 将细胞转移至一个50 mL锥形管中。用预冷的内皮细胞完全培养基（Endothelial CCM）将细胞悬液补至15 mL。在200 × g 室温下孵育5分钟。
    9. 吸弃上清液。用1 mL冷的MACS缓冲液重悬细胞。使用血细胞计数板对细胞进行计数。
    10. 向细胞悬液中加入 10 mL MACS 缓冲液。在 200 × g 条件下离心 5 分钟。 g 在室温下
    11. 吸弃上清液。每1000万个细胞用80 µL MACS缓冲液重悬细胞。每1000万个细胞加入20 µL FcR阻断试剂、CD31微珠和CD144微珠。冰上孵育15分钟。
    12. 在细胞悬液孵育的同时，将从内皮诱导中收集的培养基（步骤 4.3.2）于 200 × g 10 分钟
    13. 使用500 mL 0.22 µm真空滤器收集上清液。制备内皮细胞条件培养基（补充表 S1在无菌条件下过滤培养基，并在37 °C下保温。
      注意：内皮细胞的增殖速率在第3代后将开始下降。为在第3代后仍获得指数级生长，可从第1代开始在内皮细胞条件培养基和维持培养基中添加10 µM TGF-β抑制剂（SB431542）。
    14. 在步骤 4.4.11 的 15 分钟孵育后，向细胞悬液中每 1000 万个细胞加入 10 mL MACS 缓冲液（最多使用 30 mL MACS 缓冲液）。在 200 × g 5 分钟。
    15. 吸弃上清液。用 1 mL MACS 缓冲液重悬。
    16. 取LS柱，将注射器的柱塞从针筒中抽出，再将柱塞放回塑料套管中。将柱子置于磁铁上。
    17. 将第一个50 mL离心管置于层析柱下方。向层析柱中加入1 mL MACS缓冲液，用下方的50 mL离心管收集流出液。
    18. 让液体流过层析柱，但不要完全流干，以防止柱子干燥。当液体滴下速度开始变慢时，将细胞悬液加入层析柱中。用同一个50 mL离心管收集穿流液。
    19. 当液体滴开始缓慢滴下时，将下一个50 mL离心管置于层析柱下方。将初始穿流液（步骤4.4.18）加至层析柱中，并用下方的50 mL离心管收集。
    20. 当液体滴下速度变慢时，加入 500 µL MACS 缓冲液 3x 以洗涤柱子。
    21. 将层析柱从磁铁上取下，置于15 mL锥形管上。向层析柱中加入1 mL冷的PBS缓冲液。
    22. 为收集细胞，将推杆从塑料套管中取出，并用力插入柱中。
    23. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。用PBS将细胞悬液调整至5 mL。在200 × g条件下离心5分钟。 g.
    24. 在细胞离心过程中，用 5 mL PBS 将包被有基底膜基质 3 的培养瓶清洗 3 次，以准备接种细胞。吸除 PBS 后，向包被有基底膜基质 3 的培养瓶中加入 20 mL 内皮细胞条件培养基。
    25. 从离心机中取出细胞，吸除上清液。用内皮细胞条件培养基重悬细胞，按26,000个细胞/cm²的密度接种2 (1.95 × 106 细胞/每T75培养瓶）。接种细胞。
    26. 通过将步骤 4.4.23 中的细胞计数除以步骤 4.4.9 中的细胞计数，计算分选效率和细胞得率。
  5. 第8–15天：viECs的扩增
    1. 第二天（第8天），吸除培养瓶中的旧培养基，加入10 mL内皮细胞条件培养基。每隔一天更换一次内皮细胞条件培养基，直至培养瓶中细胞融合度达到90%或内皮细胞条件培养基用完为止。
    2. 吸弃用过的培养基，并加入 10 mL 内皮细胞维持培养基（Endothelial Maintenance medium）补充表 S1每隔一天进行一次，以维持持续扩增。
    3. 为了传代viECs，准备两个经3型基底膜基质包被的T75培养瓶。将培养瓶在室温下放置1小时。用5 mL PBS将新制备的培养瓶彻底洗涤3次。
    4. 吸除 PBS。向每只新制备的培养瓶中加入 10 mL 温热的内皮细胞维持培养基。将培养板置于 37 °C 培养箱中孵育，同时按如下所述准备待接种的细胞。
    5. 向一个90%融合的viECs T75培养瓶中加入5 mL细胞解离缓冲液，于37 °C孵育5–7分钟。将细胞转移至15 mL锥形管中，加入5 mL预热的DMEM/F12培养基，于200 × g离心 g 5 分钟。
    6. 吸弃上清液。用1 mL温热的内皮细胞维持培养基重悬细胞。将500 µL细胞悬液接种至每瓶新制备的T75培养瓶中。
    7. 次日，吸除废弃培养基，加入10 mL内皮细胞维持培养基。此后每隔一天吸除废弃培养基，并更换为10 mL内皮细胞维持培养基，直至培养瓶中细胞融合度达到90%。

第14天：细胞培养用微流控器官芯片装置的制备

  1. 等离子体处理与基底膜基质2包被
    1. 制备基底膜基质2溶液（步骤1.3）。放置一旁备用。
    2. 在无菌细胞培养超净台中，打开无菌的100 mm × 15 mm圆形培养皿。将培养皿盖子倒置，置于培养皿底部下方（补充图S1B）。
    3. 使用镊子将微流控芯片从包装中取出，并放入培养皿内。用位于培养皿底部下方的盖子将培养皿封闭。
    4. 在等离子清洗仪中，将培养皿盖子置于培养皿底部之下，盖子朝下，保持二者作为一个整体单元。将该培养皿单元放入等离子清洗仪腔室内。以氧气为气体，设定功率100 W、流速15 SCCM，处理30秒，启动等离子清洗。
    5. 时间敏感：处理完成后，立即从等离子清洗仪中取出培养皿单元。用实验室擦拭纸蘸取70%乙醇，迅速而轻柔地擦拭培养皿盖子表面。随后用该盖子盖上培养皿。
    6. 将培养皿转移至无菌细胞培养超净台中。轻轻向芯片的尿液侧（上层）通道加入25 µL基底膜基质2溶液。向毛细血管侧（下层）通道加入20 µL基底膜基质2溶液。
    7. 取两个无菌的15 mL锥形管盖，各加入无菌蒸馏水（约500 µL）。将管盖放入培养皿中，以防止芯片通道及膜干燥。盖上培养皿盖子，在37 °C条件下孵育过夜。

6. 将血管内皮细胞和中间中胚层细胞接种至微流控装置

  1. 第15天：viECs
    1. 吸除含有约90%融合度viECs的T75培养瓶中的培养基。加入5 mL细胞解离缓冲液，于37 °C孵育5–7分钟。
    2. 将细胞转移至15 mL锥形管中，加入5 mL DMEM/F12培养基。在200 × g 条件下离心5分钟。
      注意：每个约90%融合的T75培养瓶可收获约300万个细胞。
    3. 吸除上清液。用300 µL内皮细胞维持培养基重悬细胞，使细胞浓度约为200万个/300 µL。使用血细胞计数板计数细胞。将细胞悬液暂置备用。
    4. 将含有微流控芯片的培养皿转移至组织培养超净台中。在移液器末端安装P200屏障吸头。
    5. 同时用200 µL DMEM/F12冲洗微流控芯片的顶部和底部通道，并同步从出口周围吸液。
    6. 用连接至吸液器的P200屏障吸头牢固夹持芯片，远离底部通道出口。将约含134,000个细胞的20 µL viEC悬液强力注入芯片的毛细管（底部）通道中，并小心从出口周围吸除培养基。
    7. 在显微镜下检查是否存在气泡或viEC接种密度不均的情况。
    8. 轻柔翻转芯片，使其倒置，以便viEC能够附着于柔性PDMS膜的基底侧。将芯片放入支架卡盒中。向芯片支架卡盒中加入3 mL PBS，防止膜干燥。于37 °C孵育3小时。
    9. 在显微镜下检查底部通道，确认viEC已形成融合层并附着于柔性PDMS膜上。在底部通道入口处滴加200 µL内皮细胞维持培养基，使其流经通道以洗去未贴壁的内皮细胞，同时小心从毛细管（底部）通道出口周围吸液。
    10. 将芯片重新放回支架卡盒中。于37 °C孵育过夜。
  2. 第16天：中间中胚层（IM）细胞
    1. 用200 µL内皮细胞维持培养基轻柔冲洗毛细管（底部）通道，同时小心从出口端周围吸液。
    2. 用200 µL DMEM/F12冲洗尿液（顶部）通道，同时小心从出口周围吸液。在入口和出口端口各滴加约50 µL DMEM/F12。
    3. 吸除12孔板各孔中的中间中胚层诱导培养基。
      注意：每个孔在分化结束时可获得约150万个IM细胞。
    4. 向12孔板的每孔中加入1 mL胰蛋白酶-EDTA溶液，于37 °C孵育5分钟。
    5. 使用细胞刮轻轻刮下细胞，并用P1000移液器反复吹打以解离细胞。向每孔中加入2 mL胰蛋白酶中和液（补充表S1）。将细胞转移至50 mL锥形管中，用DMEM/F12补足体积至50 mL，在200 × g 条件下离心5分钟。
    6. 吸除上清液。用500 µL中间中胚层诱导培养基重悬细胞，使细胞浓度约为300万个/500 µL。使用血细胞计数板计数细胞。
    7. 用连接至吸液器的P200屏障吸头牢固夹持芯片，远离尿液（顶部）通道出口。将约含112,500个IM细胞的25 µL细胞悬液强力注入芯片的尿液（顶部）通道，并小心从出口周围吸除培养基。
    8. 在显微镜下检查是否存在气泡或IM细胞接种密度不均的情况。向芯片支架卡盒中加入3 mL PBS。于37 °C孵育3小时。
    9. 用各自相应的细胞培养基各200 µL冲洗两个通道，同时小心从芯片出口周围吸液，以防止废液和细胞碎片倒流。
    10. 在尿液通道和毛细管通道的两个出口处分别插入空的P200屏障吸头。吸取200 µL内皮细胞维持培养基，将其中一半注入毛细管通道入口。将移液器吸头保留在入口内，使该通道的入口和出口均连接充满培养基的移液器吸头。
    11. 吸取200 µL IM维持培养基，将其中一半注入尿液通道入口。将移液器吸头保留在入口内，使该通道的入口和出口均连接充满培养基的移液器吸头。将带有吸头的芯片于37 °C孵育过夜。
  3. 将芯片连接至器官芯片生物反应器，以施加流体流动和机械应变。
    1. 从尿液通道和毛细管通道上移除P200吸头。在尿液和毛细管通道的入口与出口处滴加相应培养基，防止干燥。
    2. 向尿液通道入口储液池中加入3 mL预热的足细胞诱导培养基（补充表S1）。向毛细管通道入口储液池中加入3 mL预热的内皮细胞维持培养基。
    3. 直接在出口端口上方，向尿液通道出口储液池中加入300 µL预热的足细胞诱导培养基。同样地，向毛细管通道出口储液池中加入300 µL预热的内皮细胞维持培养基。
    4. 将芯片模块滑入托盘并推入器官芯片生物反应器中。
    5. 使用器官芯片生物反应器上的旋钮选择并启动预灌注循环（2分钟）。目视检查模块底部四个流体端口是否有小液滴形成。
    6. 为实现模块底部与微流控芯片端口之间的液-液接触，轻柔地将芯片载体滑入模块中。轻压芯片载体标签向内并向上。吸除芯片表面多余的培养基。
    7. 将器官芯片生物反应器的流速设为60 µL/h，循环应变设为10%（0.4 Hz）。使用器官芯片生物反应器上的旋钮 选择调节循环，运行2小时。
    8. 目视检查出口储液池中培养基液面是否升高。
    9. 使用器官芯片生物反应器上的旋钮选择调节循环。

7. 第17-21天及之后：足细胞诱导与芯片维持

  1. 从尿液通道出口储液池中斜向吸出培养基，注意避开进样口，但每天培养时需在储液池中保留部分培养基。每2天向尿液通道入口储液池补充最多3 mL足细胞诱导培养基，持续5天。
    1. 5天后，从尿液通道中吸出培养基，但需在储液池中保留部分培养基。此后每天向尿液通道入口储液池补充3 mL足细胞维持培养基。
  2. 从毛细血管通道出口储液池中斜向吸出培养基，注意避开进样口，但每天培养时需在储液池中保留部分培养基。每天向毛细血管通道入口储液池补充最多3 mL内皮细胞维持培养基。

8. 功能检测与免疫荧光成像

注意：有关流式细胞术分析、芯片流出液的ELISA以及mRNA分离的详细信息，请参见补充文件1。

  1. 使用菊粉和白蛋白的功能测定（分子过滤）
    1. 从毛细管通道出口储液池中斜向吸出培养基，方向远离加样口，但保留部分培养基在储液池内。更换为 3 mL 添加了菊粉和白蛋白的内皮细胞维持培养基（补充表 S16小时。
    2. 使用5 mL血清移液管，量取尿液通道中培养基的体积（mL），并转移至15 mL锥形管中。用铝箔包裹锥形管以避光，减少荧光素偶联的菊粉和白蛋白发生光漂白。向储液器中补充3 mL足细胞维持培养基。
    3. 在足细胞维持培养基中配制菊粉的储备液。从 25 µg/mL 的菊粉开始，配制八种不同浓度的菊粉标准品 通过 在足细胞维持培养基中进行2倍系列稀释。
    4. 同样地，用足细胞维持培养基配制白蛋白储备液。从150 µg/mL的白蛋白开始，配制八种白蛋白标准品 通过 在足细胞维持培养基中进行2倍系列稀释。
    5. 将每种标准菊粉浓度各100 µL重复加入黑色96孔板的每个孔中（共16个菊粉孔）。将每种标准白蛋白浓度各100 µL重复加入同一96孔板的每个孔中（共16个白蛋白孔）。将足细胞维持培养基各100 µL重复加入孔中作为空白对照（共2个足细胞维持培养基孔）。
    6. 将尿液通道的流出培养基用移液器重复取100 µL，加入同一块96孔板的每个孔中。将毛细血管通道的流出培养基用移液器重复取100 µL，加入同一块96孔板的每个孔中。
    7. 将酶标板放入酶标仪中，于激发波长550 nm、发射波长615 nm条件下测定白蛋白的荧光值；在同一酶标板中，于激发波长513 nm、发射波长577 nm条件下测定菊粉的荧光值。
    8. 对生成的数据，计算每个芯片的重复测量值的平均值。从该数据表的其余数据中减去对应于该板读数的空白值。
    9. 以白蛋白标准品的数值绘制标准曲线，横轴为浓度 [µg/mL]，纵轴为荧光强度。以菊粉标准品的数值绘制标准曲线，横轴为浓度 [µg/mL]，纵轴为荧光强度。
    10. 使用统计分析软件包和线性插值法分别测定芯片流出液中菊粉和白蛋白的尿液浓度。
    11. 利用公式（测定芯片中菊粉/白蛋白的尿清除率1)2:
      尿清除率 = ([U] × UV) / [P]    (1)
      ​其中 [U] 为步骤 8.1.10 中测得的尿液浓度，UV 为步骤 8.1.2 中收集的尿液通道流出液体积，[P] 为血浆中菊粉或白蛋白的浓度（菊粉为 10 µg/mL，白蛋白为 100 µg/mL）。
  2. 免疫荧光成像
    1. 将一个空的P200枪头插入尿液通道和毛细血管通道的出口端口。为固定细胞，用移液器吸取200 µL 4%多聚甲醛，将其中一半注入底部通道的入口。将移液器枪头在入口内释放。
    2. 用移液器吸取200 µL的4%甲醛，将其中一半注入尿道通道的入口。将移液器吸头留在入口内，使通道的入口和出口均连接装有固定液的移液器吸头。
    3. 将芯片在室温下孵育20分钟。
    4. 20分钟后，丢弃所有移液枪头。将洁净的空P200枪头插入尿液通道和毛细血管通道的出口端口。为进行细胞通透处理，吸取200 µL 0.125% Triton X-100/PBS溶液，将其中一半注入毛细血管通道的入口，随后在入口内释放移液枪头。
    5. 用移液器吸取 200 µL 0.125% Triton X-100/PBS，将其中一半注入尿道通道入口。在入口内释放移液器吸头。室温孵育芯片 5 分钟。
    6. 弃去所有移液器吸头。将洁净的空P200吸头插入尿液通道和毛细血管通道的出口端口。为阻断细胞，用移液器吸取200 µL含0.125% Triton X-100的PBS缓冲液配制的1%牛血清白蛋白（BSA），并将其中一半注入毛细血管通道入口。将移液器吸头留在入口内。
    7. 用移液器吸取200 µL含1% BSA的0.125% Triton X-100/PBS溶液，将其中一半注入尿道通道入口。将移液器吸头留在入口内，室温孵育30分钟。
    8. 弃去所有移液枪头。用移液枪吸取 200 µL 0.125% Triton X-100/PBS 加入每个通道，室温孵育 5 分钟，重复洗涤 3 次。
    9. 按制造商推荐的稀释比例，用0.125% Triton X-100/PBS配制每通道100 µL一抗溶液。将洁净的空P200吸头插入尿液通道和毛细血管通道的出口端口。吸取100 µL一抗溶液，将其中一半注入相应通道中。在入口端口内释放移液吸头。
    10. 室温孵育1小时，或为获得更佳效果，于4 °C过夜孵育。
      注意：可同时使用多种一抗；但是，一抗溶液必须根据生产商说明书进行稀释。
    11. 按照步骤 8.2.8 中所述，清洗通道 3 次，每次 10 分钟。
    12. 按制造商推荐的稀释比例，用0.125% Triton X-100/PBS配制每通道100 µL的二抗溶液。将洁净的空P200吸头插入尿液通道和毛细血管通道的出口端。吸取100 µL二抗溶液，将一半体积注入相应通道中。在入口端松开移液器吸头。室温孵育1小时。
      注意：每种二抗必须分别单独使用。每次抗体孵育后均须按照步骤 8.2.8 进行至少 3 次、每次 10 分钟的洗涤。
    13. 按照步骤8.2.8中所述，清洗通道，每次10分钟，共清洗3次。
    14. 用 200 µL 去离子水分别冲洗两个通道一次，同时从芯片出口端周围抽吸残留液体。
    15. 将洁净的空P200枪头插入尿液通道和毛细血管通道的出口端口。为对细胞进行复染，吸取200 µL 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，以蒸馏水1:1,000稀释），将其中一半注入毛细血管通道入口；在入口内释放移液枪头，再吸取200 µL DAPI，将其中一半注入尿液通道入口；在入口内释放移液枪头，室温孵育5分钟。
    16. 弃去所有移液枪头。将洁净的空P200枪头插入尿液通道和毛细管通道的出口端口。为对细胞进行复染，用移液器加入200 µL鬼笔环肽（用不含Ca²⁺的PBS按1:1,000稀释）2+ 和 Mg2+）并将其中一半注入毛细管通道入口，随后在入口内释放移液枪头。用移液器吸取200 µL鬼笔环肽（用不含Ca的PBS按1:1,000稀释）2+ 和 Mg2+）并将其中一半注入尿道入口，然后将移液器吸头留在入口内。室温孵育15分钟。
    17. 用不含 Ca 的 PBS 以 200 µL 体积冲洗通道 3 次2+ 和 Mg2+，并从出口端口周围吸除多余液体。
    18. 观察芯片。

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结果

在此，我们展示了功能性3D 体外 由同基因来源的人诱导多能干细胞（iPS细胞）构建的肾小球模型可实现血管化和上皮化。具体而言，本方案提供了如何应用人iPS细胞技术（尤其是其分化为特定细胞类型的能力）的详细说明，以生成肾脏肾小球上皮细胞（足细胞）和血管内皮细胞（viECs），并将其整合至微流控装置中，从而在患者特异性水平上模拟人肾脏的结构与功能。本方案的示意图及时间线概述（图1A) 描述了如何培养有丝分裂活跃的人类诱导多能干细胞（iPS细胞）图1B）然后将它们（平行地）分化为中胚层和侧中胚层细胞系（图1C，D). 结果发现，所产生的中胚层细胞表达brachyury（T），而侧中胚层细胞表达brachyury（T）、MIXL和EOMES2,9,

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讨论

本报告中，我们概述了一种从同基因型人诱导多能干细胞系中分化出血管内皮细胞和肾小球上皮细胞（足细胞）的实验方案，并介绍了利用这些细胞构建三维“器官芯片”系统的方法，该系统可模拟肾脏肾小球的结构、组织-组织界面以及分子滤过功能。该肾小球芯片包含内皮细胞和肾小球上皮细胞，二者共同形成一道选择性滤过分子的屏障。

有意采用本方案的研究人员应考虑以下事项：首先，根据所用干细胞系固有的生长特性，可能需要对细胞接种条件进行优化。由于不同人源iPS细胞增殖速率存在内在差异，细胞接种密度可能需要调整。建议研究人员初始采用本方案推荐的中胚层细胞接种密度，之后根据需要进行调整。同样，建议侧中胚层分化也从推荐的细胞接种密度开始，再根据需要调整，以实现静脉内皮样细胞（viEC）产量和分选效率达到50%或更高。若分选后获得的细胞数量不足，可使用TGF-β抑制剂（SB431542）以防止细胞进入静息状态，并促进viEC呈指数扩增（传代3次以后）。然而，多个细胞过程或信号通路依赖于TGF-β（例如高血糖/糖尿病的发病机制、免疫稳态）；因此，建议研究人员在下游分析中充分考虑TGF-β抑制可能带来的影响，或进行充分验证...

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披露

S.M. 是一项与人iPS细胞分化为足细胞相关的专利的发明人。另一位作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了杜克大学普拉特工程学院、杜克大学医学院肾病科、生物医学研究怀特海德奖学金以及S. Musah获得的基因泰克研究奖的支持。Y. Roye获得了杜克大学与阿尔弗雷德·P·斯隆基金会联合设立的奖学金，以及杜克大学生物医学工程系颁发的威廉·M. "蒙蒂"·赖希特研究生奖学金。DU11（杜克大学克隆#11）诱导多能干细胞系由杜克大学iPSC核心实验室制备，并由杜克大学Bursac实验室提供。作者感谢N. Abutaleb、J. Holmes、R. Bhattacharya和Y. Zhou在技术方面提供的协助和有益的讨论。作者还感谢Musah实验室成员对稿件提出的宝贵意见。作者感谢Segura实验室赠送Acuri C6流式细胞仪。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗体
Alexa Fluor 488 和 Alexa Fluor 594 标记的二抗Thermo/Life TechnologiesA32744; A32754; A-11076; A32790; A21203; A11015
IV型胶原蛋白Thermo/Life Technologies14-9871-82
NephrinProgenGP-N2
PECAM-1R&D SystemsAF806
PodocinAbcamab50339
VE-CadherinSanta Cruzsc-9989
基底膜基质
Corning 人纤维连接蛋白Corning356008基底膜（3）
iMatrix-511 层粘连蛋白-E8（LM-E8）片段Iwai North AmericaN8922012基底膜基质（2）
Matrigel hESC 认证基质，5 mL 瓶装BD Biosciences354277基底膜基质（1）；可能存在批间差异
细胞
DU11 人诱导多能干细胞DU11（杜克大学克隆 #11）iPS 细胞系由杜克大学 iPSC 核心设施生成，并由杜克大学 Bursac 实验室提供。该细胞系经检测无支原体污染（最近一次检测时间为2021年11月），且无核型异常（2019年7月）
培养基、生长因子及培养基添加剂
0.5 M EDTA，pH 8.0Invitrogen15575020
2-巯基乙醇Thermo/Life Technologies21985023
牛血清白蛋白，德克萨斯红标记Thermo/Life TechnologiesA23017
全反式维甲酸（500 mg）Stem Cell Technologies72262
B27 无血清添加剂Thermo/Life Technologies17504044
B-27 添加剂（50倍浓度），不含维生素AThermo/Life Technologies12587010
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA9418
CHIR99021Stemgent04-0004可能存在批间差异
含 CultureBoost-R 的完全培养基试剂盒Cell Systems4Z0-500-R足细胞维持培养基
DMEM/F12Thermo/Life Technologies12634028
含 GlutaMAX 添加剂的 DMEM/F12Thermo/Life Technologies10565042含谷氨酰胺的 DMEM/F12
福斯高林（腺苷酸环化酶激活剂）Abcamab120058
GlutaMAX 添加剂Thermo/Life Technologies35050061谷氨酰胺添加剂
热灭活胎牛血清Thermo/Life Technologies10082147
肝素溶液Stem Cell Technologies7980
人 Activin AThermo/Life TechnologiesPHC9544
人 BMP4Preprotech120-05ET
人 BMP7Thermo/Life TechnologiesPHC9544
人 VEGFThermo/Life TechnologiesPHC9394
菊粉-FITCSigma-AldrichF3272
mTeSR1 培养基Stem Cell Technologies05850人 iPS 细胞培养基（CCM）。根据制造商说明添加 5 倍添加剂。人 iPS CCM 可在 -20 °C 下保存长达 6 个月。
N-2 添加剂（100倍浓度）Thermo/Life Technologies17502048
Neurobasal 培养基Thermo/Life Technologies21103049侧中胚层基础培养基
PBS（磷酸盐缓冲液）Thermo/Life Technologies14190-250
青霉素-链霉素溶液（100倍浓度）Thermo/Life Technologies15140-163
ROCK 抑制剂（Y27632）Tocris1254
StemPro-34 SFMThermo/Life Technologies10639011内皮细胞培养基（CCM）。根据制造商说明添加添加剂。内皮 CCM 可在 4 °C 下保存长达两周，或在 -20 °C 下保存长达 6 个月。
TGF-β 抑制剂（SB431542）Stem Cell Technologies72234
酶及其他试剂
AccutaseThermo/Life TechnologiesA1110501细胞解离缓冲液
二甲基亚砜（DMSO）Sigma-AldrichD2438
乙醇溶液，70%（体积/体积），生物技术级VWR97065-058
多聚甲醛（PFA）Thermo/Life Technologies28906
无菌蒸馏水Thermo/Life Technologies15230162
吐温 X-100VWR97062-208
设备
0.05% 胰蛋白酶-EDTAThermo/Life Technologies25300-120
（Orb）Hub 模块EmulateORB-HM1
100 mm × 15 mm 圆形培养皿FisherbrandFB087579B
120 mm × 120 mm 方形细胞培养皿VWR688161
Accuri C6BD Biosciences
吸管，独立包装Corning29442-462
吸液装置SP Bel-ArtF19917-0150
Avanti J-15R 离心机Beckman CoulterB99516
锥形离心管，15 mLCorning352097
锥形离心管，50 mLCorning352098
EVOS M7000Thermo/Life TechnologiesAMF7000用于拍摄固定和染色细胞的荧光显微镜。
血细胞计数板VWR100503-092
Heracell VIOS 160i CO2 培养箱Thermo/Life Technologies51030403
配备 AxioCam 503 相机的倒置 Zeiss Axio Observer 显微镜Carl Zeiss Micrscopy491916-0001-000（显微镜）；426558-0000-000（相机）
Kimberly-Clark 丁腈手套VWR40101-346
Kimwipes，大号VWR21905-049
Leica SP8 正置共聚焦显微镜
培养基储液槽（POD 便携模块）EmulatePOD-1
微孔板摇床VWR12620-926
器官芯片EmulateS-1 Chip
器官芯片支架EmulateAK-CCR
P10 精密屏障移液器吸头Denville ScientificP1096-FR
P100 屏障移液器吸头Denville ScientificP1125
P1000 屏障移液器吸头Denville ScientificP1121
P20 屏障移液器吸头Denville ScientificP1122
P200 屏障移液器吸头Denville ScientificP1122
等离子清洗仪Quorum techK1050X RF该等离子刻蚀/灰化/清洗仪为杜克大学共享材料仪器设施（SMiF）的一部分。
带滤网旋盖的圆底聚苯乙烯试管Corning352235
血清移液管，10 mL，独立包装Corning356551
血清移液管，25 mL，独立包装Corning356525
血清移液管，5 mL，独立包装Corning356543
Steriflip，0.22 µm，PESEMD MilliporeSCGP00525
无菌微量离心管Thomas Scientific1138W14
带透气盖的 T75 cm2 细胞培养瓶Corning430641U
组织培养处理的 12 孔板Corning353043
组织培养处理的 6 孔板Corning353046
真空调节器和蠕动泵（Zoe 培养模块）EmulateZOE-CM1器官芯片生物反应器
VE-Cadherin CD144 抗人抗体 - APC 标记Miltenyi Biotec130-126-010
宽斜面细胞刮刀Corning3008
MACS
CD144 MicroBeads，人源Miltenyi Biotec130-097-857
CD31 MicroBead 试剂盒，人源Miltenyi Biotec130-091-935
LS 柱Miltenyi Biotec130-042-401

参考文献

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